Патент на изобретение №2186848

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине, ветеринарии и смежных областях науки и техники для получения супероксиддисмутазы (СОД). Способ выделения супероксиддисмутазы из дрожжей Saccharomyces cerevisiae включает разрушение клеток продуцента и выделение активного начала обработкой клеток продуцента. Многостадийную хроматографию ведут последовательно на сорбентах Солоза, на Sp-сефадексе и на С₈-целлюлозе. При этом хроматографию на Солозе КГ проводят в статическом режиме при рН 4,0-4,2 в 0,1 М растворе однозамещенного фосфата натрия с элюцией целевого продукта при рН 5,0-5,2. Хроматографию на Sp-сефадексе – на сорбенте, уравновешенном 0,1 М раствором однозамещенного фосфата натрия с проведением элюции супероксиддисмутазы 0,1 М водным раствором двузамещенного фосфата натрия. Хроматографию на С₈-целлюлозе – при рН 3,9-4,1 с использованием в качестве элюата фосфатного буферного раствора. Предлагаемая технология позволяет получать препарат СОД с удельной активностью около 500000 ед/мг и высоким выходом. 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине, ветеринарии и смежных областях науки и техники для получения супероксиддисмутазы (СОД) человека.

Супероксиддисмутаза находит применение в качестве антиксиданта производстве биологических препаратов, используется для защиты от проникающей радиации, для лечения патологий суставов, дисплозии легких, как противовоспалительное средство и антимутагенный препарат, находит применение в онкологии и геронтологии, а также в пищевой промышленности.

Известен способ выделения СОД человека из эритроцитов крови (пат. США 4435506, 1984, кл. А 61 К 35/18), включающий гемолиз эритроцитов водой, добавку изопропанола, инкубацию 1 час при 50^oС, фильтрование, концентрирование фильтрата на полых волокнах, осаждение дo 0-5^oС, добавление к смеси ацетона, выдерживание 48 часов, отделение осадка в проточной центрифуге, перерастворение осадка при pH 7.0, центрифугирование и хроматографию на поперечно сшитом декстране. Чистота получаемого продукта – 87%, выход – 20%.

Недостатками способа являются сложность процесса, дефицитность и ограниченность ресурсов используемого сырья – донорской крови человека.

Одним из наиболее перспективных направлений в настоящее время является получение СОД из рекомбинантных штаммов дрожжей Saccharomyces cereviseae (S. cer. ) (вылож. заявка РФ 92009197, 1997, кл. С 12 N 9/02). СОД выделяют из продуцента разрушением клеток дрожжей, выделением из них фракции с мол. массой 10-100 кДа, хроматографической очисткой с использованием ионита типа КБ-2Т, фракционированием активной фракции и осаждением примесей.

Недостатком данного способа является получение препарата относительно невысокой активности.

Прототипом заявляемого способа является технология выделения СОД из дрожжей Saccharomyces cereviseae (пат. РФ 1800841, 1996, кл. С 12 N 9/02), заключающийся в том, что клетки разрушают методом замораживания-оттаивания, после чего экстрагируют активное начало фосфатным буферным раствором при рН 7.7-7.9 и соотношении мицелий: экстрагент 1:3 в течение 20-24 часов при 7^oC. Затем суспензию подкисляют до рН 4.4 и отделяют биомассу центрифугированием. Субстрат последовательно очищают ионообменной хроматографией на КМТ, а затем гель-фильтрацией на сефадексе G-75. В результате получали СОД с активностью до 120 Ед/мл. Полученные активные фракции лиофилизируют.

Недостатком прототипа является невозможность получения препарата с высокой активностью.

Задачей, решаемой авторами, являлась разработка способа получения СОД человека, обладающей высокой удельной активностью и повышение выхода конечного продукта.

Указанная задача достигалась путем проведения процесса разрушения клеток дрожжей и выделения активного начала механической дезинтеграцией в присутствии стабилизатора СОД-раствора медного купороса; и осуществление очистки СОД последовательной ионообменной хроматографией на катионите Солоза КГ, Sp-сефадексе и C₈-целлюлозе.

Условия очистки определяются экспериментально исходя из особенностей штамма-продуцента и условий его культивирования. Однако проведенные эксперименты, показали, что лучшие результаты достигаются при следующих параметрах процесса:
– использованием в качестве стабилизатора 3-4 мМ раствор медного купороса;
– проведением хроматографии на Солозе КГ в статическом режиме при рН 4.0-4.2 в 0.1 М растворе однозамещенного фосфата натрия с элюцией целевого продукта фосфатным буферным раствором при рН 5.0-5.2;
– проведением хроматографии на Sp-сефадексе, уравновешенным водным раствором 0.1 М однозамещенного фосфата натрия при pН 3.9-4.1 с элюцией целевого продукта 0.1 М раствором двузамещенного фосфата натрия;
– проведением хроматографии на С₈-целлюлозе при рН 3.9-4.1 с использованием в качестве элюата 0.1 М раствора однозамещенного фосфата натрия.

Существенными отличиями являются изменение стадии разрушения клеток путем замены процедуры замораживания-оттаивания на существенно более разрушительную для клеток процедуру дезинтеграции (до 97% разрушения клеточных стенок), что приводит к более полному выделению СОД в раствор, стабилизации ее медным купоросом и принципиально иному составу разделяемой смеси продуктов и следовательно необходимости использования иных сорбентов и условий очистки СОД, в частности использования на первой стадии хроматографии со статической десорбцией СОД, позволяющей уменьшить потери целевого продукта и, одновременно, практически полностью отделить его от примесных белков, что исключено при проведении процесса, в режиме хроматографии в потоке.

Конечный продукт обессоливали и лиофильно высушивали. Активность СОД определяли хемилюминесцентным методом. Чистоту получаемого продукта, характеризовали с помощью электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии на сорбенте TSK 2. 000 SWL.

В результате внесенных изменений в технологию получения СОД человека из дрожжей удалось получить продукт – с активностью 500000 Eд/мг при высоком выходе с единицы биомассы.

Использование заявляемого изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 4,5 кг дрожжевой биомассы Saccharomyces cereviseae суспендировали в 8.4 л 2 мМ водного раствора медного купороса, а затем подвергали дезинтеграции в течение 1.5 часов до достижения степени дезинтеграции клеток 97,5%. К лизату клеток добавляли 0.1 М НС1 до рН 4.2, полученный осадок отделяли центрофугированием. Было получено 14 л супернатанта с содержанием СОД 60,2%. Супернатант подкисляли до рН 4.1 и наносили на колонку с 9 л сорбента Солозы КГ. Через сорбент пропускали 50 л раствора 0.1 М однозамещенного фосфата натрия, после чего добавляли еще 10 л этого раствора и при интенсивном перемешивании вводили 10 М раствор NaOH до рН 5.15. Затем смесь перемешивали в течение 30 минут и сливали элюат СОД. Колонку дважды промывали двумя порциями по 10 л 1 М фосфатного буферного раствора и объединяли промывочный раствор с элюатом. Было получено 31 л СОД-содержащего элюата с содержанием СОД 0.1 мас.%.

Полученный элюат нитровали 1 М НC1 до pН 4.0 и наносили на колонку, содержащую 1 л Sp-сефадекса, уравновешенного раствором 0.1 М однозамещенного фосфата натрия при рН 4.0. После чего колонку промывали 3 л буферного раствора и элюировали СОД 0.1 М раствором двузамещенного фосфата натрия. Было получено 1.1 л элюата СОД с содержанием СОД – 24.2 г. Полученный элюат подкисляли 1 М НСl до рH 4.0 и наносили его на колонку с 1.2 л сорбента С₈-целлюлоза. Колонку промывали раствором 0.1 М однозамещенного фосфата натрия при рН 4.0. Первые 0.9 л элюата отбрасывали, а следующие 1.8 л отбирали. Выход СОД составлял 23.5 г при активности 500 тысяч единиц на мг. Для сравнения – из 4 кг эритроцитов крови получали только 0.2 г СОД той же активности.

Пример 2. В условиях примера 1 проводили выделение СОД из дрожжей Saccharomyces cerevisae при варьировании параметров отдельных стадий процесса. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Формула изобретения

1. Способ выделения супероксиддисмутазы, включающий в себя разрушение клеток продуцента – дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выделение активного начала и центрифугирование, многостадийную хроматографию полученного супернатанта с использованием сефадекса, отличающийся тем, что разрушение клеток и выделение активного начала проводят обработкой клеток продуцента механической дезинтеграцией в присутствии раствора медного купороса, а хроматографию проводят на сорбенте Солоза, на Sp-сефадексе и на С₈-целлюлозе.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что разрушение клеток и экстракцию активного начала проводят обработкой клеток продуцента 1-4 мМ раствором медного купороса.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографию на Солозе КГ проводят в статическом режиме при рН 4,0 – 4,2 в растворе 0,1 М однозамещенного фосфата натрия с элюцией целевого продукта при рН 5,0 – 5,2.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографию на Sp-сефадексе проводят на сорбенте, уравновешенном раствором 0,1 М однозамещенного фосфата натрия с проведением элюции супероксиддисмутазы 0,1 М водным раствором двузамещенного фосфата натрия.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографию на С₈-целлюлозе проводят при рН 3,9 – 4,1 с использованием в качестве элюата раствора 0,1 М однозамещенного фосфата натрия.

РИСУНКИ

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Прежний патентообладатель:

Шаронова Валентина Львовна

(73) Патентообладатель:

Чурилова Ирина Васильевна

(73) Патентообладатель:

ООО “РЭСБИО”

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 16.09.2004 № 20090

Извещение опубликовано: 27.10.2004 БИ: 30/2004

QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Общество с ограниченной ответственностью “РЭСБИО”

Вид лицензии*: НИЛ

Лицензиат(ы): Федеральное государственное унитарное предприятие “Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов” Федерального Медико-Биологического Агентства

Договор № РД0019520 зарегистрирован 13.03.2007

Извещение опубликовано: 20.04.2007 БИ: 11/2007

* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Прежний патентообладатель:

Общество с ограниченной ответственностью “РЭСБИО”

(73) Патентообладатель:

Общество с ограниченной ответственностью “Научно-Производственное Предприятие “Ферментные технологии”

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 12.02.2008 № РД0032639

Извещение опубликовано: 7.03.2008 БИ: 09/2008