Патент на изобретение №2186390
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПНЕВМОЦИСТ
(57) Реферат: Изобретение относится к области медицины, а именно к паразитологии, и касается способов выделения пневмоцист (Pneumocystis carinii), которые могут быть использованы для изготовления диагностических тест-систем. Способ характеризуется тем, что для выделения пневмоцист из легких зараженных минисвиней используют трипсин, что позволяет повысить выход целевого продукта, сократить время процедуры до 2 ч и проводить центрифугирование материала при 2000 об/мин. Изобретение относится к медицине, а именно к паразитологии, и касается способов выделения очищенных пневмоцист (Pneumocystis carinii), которые могут быть использованы для приготовления диагностических тест-систем. Известен способ выделения пневмоцист из легочной ткани зараженных крыс или мышей (1, 2). Однако при этом способе выделение проводят на дорогостоящем оборудовании при 10000 об/мин с использованием импортных ферментов (коллагеназы, гиалуронидазы, ДНК-азы, РНК-азы) в течение 4-х часов. Цель изобретения – удешевление способа, сокращение по времени процедуры обработки ферментом, повышение выхода целевого продукта. Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что легочную ткань зараженных минисвиней обрабатывают трипсином и центрифугируют при 2000 об/мин. Пример. Минисвиньям в возрасте от 1 до 1,5 месяцев, весом 1,5-2 кг вводят подкожно в область бедра ацетат кортизона (75-100 мл/кг массы) 2 раза в неделю в течение 2-х месяцев. На второй неделе с начала инъекций проводят интерназальное инфицирование испытуемых животных суспензией пневмоцист при концентрации 106 цист/мл. Для предупреждения бактериальной инфекции в пищу добавляют тетрациклин из расчета 25 мг на 1 кг массы животного. Через 2 месяца минисвиней умерщвляют под эфирной анестезией, иссекают легкие и делают мазки-отпечатки. Окраску препарата осуществляют по методу Романовского-Гимза и оценивают в световом микроскопе при увеличении x 7000 (3). Ткань легкого измельчают в стерильной чашке Петри, переносят в стерильную колбу с 25% трипсином (t 37oС). Объем трипсина превышает легочную массу в 20 раз. Колбу помещают в термостат при (t 37oС) на магнитную мешалку на 3-4 минуты. Затем отбирают жидкую суспензию, содержащую цисты и клетки легкого, и переносят в стерильный флакон, который ставят в холодильник (t +4oС) для прекращения действия трипсина. Оставшиеся неразрушенные кусочки легких заливают трипсином и повторяют процедуру до полной трипсинизации легкого (5-7 раз). Все полученные пробы жидкой суспензии объединяют и фильтруют через стерильную воронку, покрытую 3-4 слоями стерильной марлевой салфетки, на поверхности которой остаются крупные конгломераты легочной ткани и слизи. Очищенный материал, содержащий цисты, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15-20 минут. Затем надосадочную жидкость удаляют, а к осадку пневмоцист добавляют 1-2 мл раствора Хенкса, ресуспендируют его и доводят до 10 мл раствором Хенкса и вновь центрифугируют при 2000 об/мин. Этот этап отмывки пневмоцист повторяют еще раз. Эта процедура переваривания легочной ткани трипсином занимает 2 часа. После чего полученный осадок ресуспендируют в 1-2 мл раствора Хенкса и готовят контрольный мазок на стекле, который высушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимза или проводят иммунофлюоресцентную реакцию. В препарате должно быть не менее 300 цист в 10 полях зрения. Дальнейшая очистка и концентрация пневмоцист проводятся в градиенте плотности перколла. Выход целевого продукта в 10 раз превышает выход цист, полученных известным способом. Таким образом, использование в качестве фермента трипсина позволило удешевить способ выделения пневмоцист, повысить выход целевого продукта, сократить время процедуры до 2 часов и проводить центрифугирование материала при 2000 об/мин. Литература 3. Васильева В. И. , Каражас Н. В., Плюхин Д.Ю., Савицкий И.Г. А.с. 1685991. Формула изобретения
|
||||||||||||||||||||||||||
