Патент на изобретение №2186105

(54) СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПОЛУЧЕНИЯ МЕЛАНИНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области микробиологического синтеза органических соединений. При реализации способа проводят культивирование штамма дрожжей Saccharomyces neoformans var. nigricans ГСП – ТБ 17 Д на углесодержащих средах. Процесс проводят при 27 – 35^oС и рН культуральной жидкости 4,5 – 5,5 в условиях аэрации и перемешивании. Полученную биомассу отделяют от культуральной жидкости с последующим выделением целевого продукта. Способ позволяет со-кратить время синтеза и повысить выход меланина. 8 з.п.ф-лы.

Изобретение относится к области микробиологического синтеза органических соединений, в частности кислородсодержащих органических соединений с использованием бактерий, и может быть использовано при получении черно-коричневых пигментов – меланинов.

Меланины представляют собой черные, коричневые и желтые пигменты. Молекулы меланинов представляют собой сложные комплексы, образованные полимерами производных тирозина и белков. Молекулярная масса меланинов зависит от способа его получения.

Известен способ (Жданова Н.Н., Василевская А.И. Меланинсодержащие грибы в экстремальных условиях. Киев: “Наукова думка”, 1988, с. 194), позволяющий получать меланин из грибов. Недостатком известного способа следует признать его сложность, вызванную использованием нетрадиционных условий проведения технологии выращивания грибов.

Известно также о принципиальной возможности получения меланина с использованием грибов Paecilomyces Variotti и Aspergillus carbonarius (Бабицкая В. Г. и др. Меланиновые пигменты грибов Paecilomyces Variotti и Aspergillus carbonarius. “Прикладная биохимия и микробиология”, 2000, т. 36, 2, с. 153). Однако не разработана технология получения указанным способом меланинов в промышленном масштабе.

Известен способ микробиологического получения меланина (Рубан Е.Л. и др. Локализация пигментов в клетках черных дрожжей. Известия АН СССР, сер. Биологическая, 1969, 2, стр. 292 – 301) с использованием черных дрожжей. Указанный способ включает выращивание культуры черных дрожжей и выделение меланина в качестве целевого продукта. Однако этот способ чрезвычайно трудоемок и длителен.

Техническая задача, решаемая использованием настоящего изобретения, состоит в разработке промышленного способа микробиологического получения меланинов.

Технический результат, получаемый при реализации изобретения, состоит в обеспечении быстрого получения меланинов промышленно приемлемым способом.

Для достижения указанного технического результата предложено осуществлять культивирование штамма дрожжей Saccharomyces neoformans var. nigricans ГСП – ТБ 17 Д на углеродсодержащих средах при 27 – 35^oС и рН культуральной жидкости 4,5 – 5,5 при аэрации и перемешивании до получения концентрации биомассы не более 4% с последующим извлечением целевого продукта посредством гидролиза или дезинтеграции клеток с последующим выделением меланина. Обычно для создания углеродсодержащей среды используют отходы спиртового производства, и/или молочную сыворотку, и/или смесь мелассы с углеводородами. Предпочтительно гидролиз полученной биомассы проводят при рН 8 – 9 и давлении 0,5-0,7 атм в течение 30-45 мин с последующим отделением нерастворимого в воде осадка, содержащего меланин, центрифугированием. Преимущественно дезинтеграцию биомассы дрожжей проводят центрифугированием с последующим отделением нерастворимого в воде осадка, содержащего меланин. Обычно в обоих случаях меланин отделяют от белковой фракции осаждением в изоэлектрической точке при рН 3,0-4,9 и/или посредством мембранной фильтрации. Дезинтеграцию можно проводить нагревом суспензии биомассы дрожжей и/или посредством ультразвука.

Штамм Saccharomyces neoformans var. nigricans ГСП – ТБ 17 Д зарегистрирован в Коллекции культур микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института биосинтеза белковых веществ.

Родословная штамма. Указанный штамм выделен из воздуха.

Способ получения штамма. Культивируют штамм путем накопительных культур из воздуха с последующей селекцией.

Культурально морфологические особенности штамма. Дрожжи, клетки округлые, коротко овальные, черного или темно-коричневого цвета, могут быть соединены небольшими группами. Аэроб. При выращивании на сусло агаре образует гладкие черные колонии с ровным краем. Размножается путем вегетативного деления. Использует в качестве источника углерода сахара, пектин, крахмал, органические кислоты, спирты. Проявляет фенолоксидазную активность. Нуждается в факторах роста, биотине.

Продукт, синтезируемый штаммом. Белок одноклеточных, пигмент меланин.

Активность (продуктивность) штамма, а также другие производственные показатели штамма. Скорость роста 0,2 ч^-1, синтезирует меланин в количестве 50-70 мг/г.

В дальнейшем изобретение будет раскрыто использованием следующих примеров получения меланина.

1. Дрожжи штамма Saccharomyces neoformans var. nigricans ГСП-ТБ 17 Д выращивали в аппарате, конструкция которого обеспечивала аэрацию культуральной жидкости при перемешивании и термостатировании, объемом 5 дм³ на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода отход спиртового производства, в количестве 4% по объему от объема культуральной жидкости, а также в качестве источников минерального питания сульфат аммония (6 г/дм³), однозамещенный фосфат калия (1,5 г/дм³), сульфат магния (0,5 г/дм³), а также сульфат марганца, сульфат цинка, сульфат железа (II) и сульфат меди по (0,05 г/дм³). рН культуральной среды составило 5,5 при температуре 30^oС. Режим аэрации составил 1 об/обмин. При этом в течение 20 часов культивирования была получена суспензия, содержащая 3,9% биомассы. Биомассу обработали 0,5 N гидроксида натрия при давлении 0,5 атм в течение 30 мин. Клетки дрожжей осадили центрифугированием. Фугат подкислили 40%-ной соляной кислотой до рН 3,2. В результате вышеуказанных операций меланин выпал в осадок. Осадок центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 мин с последующей последовательной промывкой водой и этиловым спиртом. В результате было получено 4,5 г меланина, что составило выход 2,5% от субстрата и 3,1% от содержания биомассы.

2. Дрожжи штамма Saccharomyces neoformans var. nighcans ГСП-ТБ 17 Д выращивали в аппарате, конструкция которого обеспечивала аэрацию культуральной жидкости при перемешивании и термостатировании, объемом 5 дм³ на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода смесь мелассы с углеводородами в соотношении 10:1 в количестве 6% по объему от объема культуральной жидкости, а также в качестве источников минерального питания сульфат аммония (5,8 г/дм³), однозамещенный фосфат калия (1,6 г/дм³), сульфат магния (0,6 г/дм³), а также сульфат марганца, сульфат цинка, сульфат железа (II) и сульфат цинка по (0,045 г/дм³). рН культуральной среды составило 5,6 при 30^oС. Режим аэрации составил 1,1 об/обмин. При этом в течение 18 ч культивирования была получена суспензия, содержащая 3,5% биомассы. Биомассу обработали 0,5 N гидроксида калия при давлении 0,5 атм в течение 30 мин. Клетки дрожжей осадили центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин. Фугат содержал 70% меланина от а.с.в, 15% белков от а.с.в. и 6% липидов от а.с.в. В результате выход продукта составил 13,8% от исходной биомассы, при этом чистого меланина получено 6,9% от содержания биомассы.

3. Дрожжи штамма Saccharomyces neoformans var. nigricans ГСП – ТБ 17 Д выращивали в аппарате, конструкция которого обеспечивала аэрацию культуральной жидкости при перемешивании и термостатировании, объемом 5 дм³ на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода отход спиртового производства, в количестве 4% по объему от объема культуральной жидкости, а также в качестве источников минерального питания сульфат аммония (6 г/дм³), однозамещенный фосфат калия (1,5 г/дм³), сульфат магния (0,5 г/дм³), а также сульфат марганца, сульфат цинка, сульфат железа (II) и сульфат меди по (0,05 г/дм³). рН культуральной среды составило 5,5 при температуре 30^oС. Режим аэрации составил 1 об/обмин. При этом в течение 18 ч культивирования была получена суспензия, содержащая 3,3% биомассы. Биомассу обработали ультразвуковыми колебаниями частотой 50-100 кГц в течение 5 мин. Клетки дрожжей осадили центрифугированием. Фугат пропустили через мембранный фильтр фирмы Millipore с размером пор 0,45 мкм. Полученный продукт содержал 98% меланина от а.с.в.

4. Для получения путем микробиологического синтеза меланина в качестве углеродсодержащего сырья использовали молочную сыворотку. Дрожжи штамма Saccharomyces neoformans var. nigricans ГСП-ТБ 17 Д выращивали в аппарате, конструкция которого обеспечивала аэрацию культуральной жидкости при перемешивании и термостатировании, объемом 10 дм³ на молочной сыворотке с содержанием сухих веществ 6%. В качестве источников минерального сырья использовали сульфат аммония (4 г/дм³), однозамещенный фосфат калия (1,0 г/дм³), сульфат меди (0,1 г/дм³), сульфат железа (II) (0,01 г/дм³). рН культуральной среды составило 5,5 при 30^oС. Режим аэрации составил 1 об/обмин. При этом в течение 20 ч культивирования была получена суспензия, содержащая 2,6% (вес.) биомассы. Для извлечения меланина биомассу обработали в ультразвуковом дезинтеграторе при частоте колебаний 100 кГц в течение 30 мин, затем дезинтегрированные клетки дрожжей осадили центрифугированием. Фугат подкислили соляной кислотой до рН 3,0 и отделили центрифугированием осадок. Полученный продукт содержал 91% меланина от а.с.в.

В результате проведенных экспериментальных работ установлено, что молекулярный вес получаемого меланина зависит от условия проведения эксперимента. Однако для получения меланина необходимо только наличие признаков, введенных в независимый пункт формулы изобретения.

Использование вышеуказанного способа позволяет количественно получить меланин в течение менее 24 ч, в то время как при использовании черных дрожжей процесс продолжается не менее 72 ч.

Формула изобретения

1. Способ микробиологического получения меланина, включающий культивирование дрожжей и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что культивирование штамма дрожжей Saccharomyces neoformans var. nigricans ГСП-ТБ 17 Д осуществляют на углеродсодержащих средах при 27 – 35^oС и рН культуральной жидкости 4,5 – 5,5 при аэрации и перемешивании, затем извлекают целевой продукт посредством гидролиза или дезинтеграцией клеток с последующим выделением меланина.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для создания углеродсодержащей среды используют отходы спиртового производства.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для создания углеродсодержащей среды используют молочную сыворотку.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для создания углеродсодержащей среды используют смесь мелассы с углеводородами.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что гидролиз полученной биомассы проводят при рН 8-9 и давлении 0,5-0,7 атм в течение 30-45 мин с последующим центрифугированием.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что меланин выделяют осаждением в изоэлектрической точке при рН 3,0-4,9.

7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что меланин выделяют посредством мембранной фильтрации.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дезинтеграцию проводят нагревом суспензии биомассы дрожжей.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дезинтеграцию клеток проводят посредством ультразвука.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 03.10.2007

Извещение опубликовано: 10.05.2009 БИ: 13/2009