Патент на изобретение №2185438

(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PTRCTE-LEP, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ЛЕПТИНА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI – ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ЛЕПТИНА ЧЕЛОВЕКА

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для получения полипептида со свойствами лептина человека. Рекомбинантная плазмидная ДНК содержит к ДНК процессированной формы лептина человека, trc-промотор Escherichia coli и синтетический участок – усилитель трансляции гена 10 бактериофага Т7, обусловливающие биосинтез полипептида со свойствами лептина человека. Esсherichia coli W3110/рTrcTE-Lep, трансформированный полученной плазмидой, обеспечивает синтез этого полипептида с уровнем экспрессии не ниже 43% суммарного клеточного белка при концентрации индуктора, изопропил--D-тиогалактопиранозида, 0,05 мМ. Изобретение позволяет увеличить уровень биосинтеза полипептида при одновременном снижении количества добавляемого индуктора. 2 с.п. ф-лы, 5 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую кДНК процессированной формы лептина человека, trc-промотор Escherichia coli и синтетический участок – усилитель трансляции, обусловливающие биосинтез полипептида со свойствами лептина человека, а также штамм Escherichia coli – продуцент этого полипептида.

Лептин человека представляет собой полипептидный гормон с молекулярной массой 16000 Да [1]. Лептин синтезируется преимущественно жировыми клетками в виде предшественника, состоящего из 167 аминокислотных остатков (а.о.). При секреции происходит удаление лидерного пептида с образованием зрелой формы белка, состоящей из 146 а.о. Показано, что лептин не содержит гликозидных остатков [2].

Физиологическая функция лептина заключается в поддержании энергетического баланса у млекопитающих. Связывание лептина с рецептором в гипоталамусе уменьшает потребление пищи, стимулирует обмен веществ и увеличивает расходование энергии [3-5].

Рекомбинантный лептин находит широкое применение в лабораторных и клинических исследованиях. В работе [6] показано, что подкожное введение в течение 4 недель рекомбинантного лептина, содержащего на N-конце метиониновый остаток, в количестве 0,1 мг/кг веса в день приводит к потере веса у людей в среднем на 1,9 кг.

Известны способы получения лептина человека, основанные на экспрессии в дрожжах [7] и в бакуловирусной системе [8]. Недостатком обоих методов является недостаточно высокий выход целевого продукта, а также длительная процедура очистки белкового препарата.

Основным способом получения лептина человека является микробиологический синтез [9, 10] . Синтезируемый белок накапливается в нерастворимом виде в телах включения, что, с одной стороны, требует введения стадии ренатурации для получения биологически активной формы полипептида, а с другой стороны, упрощает процедуру очистки целевого белка от полипептидных компонентов клетки. Недостатками описанных в работах [9, 10] способов являются весьма умеренный для микробиологического синтеза выход целевого белка, а также большой расход индуктора, требуемый для достижения экспрессии.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению (прототипом) является способ, описанный в работе [11]. Рекомбинантная плазмидная ДНК содержит кДНК зрелого лептина человека под контролем промотора фага Т7. Синтезируемый целевой белок содержит на N – конце 11 аминокислотных остатков гистидина. Синтез белка осуществляют при добавлении индуктора, изопропил--D-тиогалактопиранозида (ИПТГ), до конечной концентрации 1 мМ. Полученный белок очищают с помощью металлоаффинной хроматографии, после чего остатки гистидина удаляют тромбиновым гидролизом. В результате получают зрелый лептин человека с общим выходом 45 нг/л культуральной жидкости.

Недостатком способа-прототипа является недостаточно высокий уровень синтеза лептина, использование больших количеств ИПТГ для индукции, а также высокий базальный уровень синтеза белка, свойственный системам экспрессии на основе промотора фага Т7 [12].

Изобретение решает задачу получения полипептида со свойствами лептина человека путем индуцибельного синтеза, а также увеличение уровня его биосинтеза при одновременном снижении количества добавляемого индуктора.

Поставленная задача решается путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pTrcTE-Lep, кодирующей индуцибельный синтез полипептида со свойствами лептина человека, и штамма Escherichia coli W3110/pTrcTE-Lep, обеспечивающего синтез этого полипептида с уровнем экспрессии не ниже 43% суммарного клеточного белка. Индуцибельный высокий уровень синтеза целевого полипептида обеспечивается тем, что плазмида pTrcTE-Lep содержит trc-промотор Е. coli и синтетический усилитель трансляции гена 10 бактериофага Т7.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pTrcTE-Lep, кодирующая полипептид со структурой лептина человека, характеризуется следующими признаками:
имеет молекулярную массу 3,09 Md (4,682 т.п.о.);
кодирует аминокислотную последовательность зрелого лептина человека;
состоит из Cla I/Hind III – фрагмента ДНК плазмиды pTrcTEGF [13] длиной 4,232 т.п.о., содержащего trc-промотор Е. coli, синтетический усилитель трансляции TREN гена 10 бактериофага Т7, терминатор транскрипции фага лямбда term, ген bla -лактамазы, ген lac I^q lac-репрессора и участок ori инициации репликации; а также из кДНК зрелого лептина человека, фланкированной сайтами рестрикции Cla I и Hind III;
содержит: trc-промотор Е. coli, синтетический усилитель трансляции TREN гена 10 бактериофага Т7, кДНК зрелого лептина человека, терминатор транскрипции фага лямбда term, ген bla -лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pTrcTE-Lep клеток к ампициллину, ген lac I^q lac-репрессора, участок ori инициации репликации; уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: Nco I – 265, Eco RI – 270, Kpn I – 286, Xba I – 340, Cla I – 377, Hind III – 828.

Особенностью предложенной плазмидной конструкции является то, что кДНК зрелого лептина человека находится под контролем trc-промотора Е. coli, a для усиления трансляции используется синтетический усилитель трансляции, что в совокупности обеспечивает индуцибельный синтез целевого белка с надежной регуляцией и высоким выходом, достигаемым при малых концентрациях индуктора.

Для получения штамма-продуцента полипептида со структурой лептина человека трансформируют компетентные клетки Escherichia coli W3110 рекомбинантной плазмидой pTrcTE-Lep.

Полученный штамм Escherichia coli W3110/pTrcTE-Lep характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки мелкие палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, 1х3-5 мкм, подвижные.

Культуральные признаки. При росте на плотной среде LA колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые, край ровный, диаметр колоний 1-3 мм; консистенция пастообразная. Рост в жидкой среде LB характеризуется ровным помутнением с образованием легкого осадка.

Физико-биохимические признаки. Клетки растут при температуре 4-42^oС при оптимуме pH 6,8-7,2. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 200 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена бета-лактамазы.

Штамм Е. coli W3110/pTrcTE-Lep обеспечивает индуцибельный синтез полипептида со свойствами лептина человека в количестве не менее 43% от суммарного клеточного белка при концентрации индуктора 0,05 мМ. В отличие от прототипа в данном штамме достигается в 1,5 раза более высокий выход целевого белка при использовании лишь 1/20 от указанного в прототипе количества индуктора. Совокупность перечисленных свойств штамма Е. coli W3110/pTrcTE-Lep обусловливает большую технологичность процесса получения рекомбинантного полипептида.

Полученный штамм депонирован в коллекции культур микроорганизмов Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина – Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук под номером 20.

На фиг. 1 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды рТrсТЕ-Lep; на фиг.2(а) – нуклеотидная последовательность кДНК лептина человека с прилегающими регуляторными элементами: trc – промотор (1-30 п.о.), усилитель трансляции TREN (93-186 п.о.), ген лептина (190-630 п.о.); инициирующий и терминирующий кодоны подчеркнуты, в рамки взяты сайты рестриктаз: Eco RI, Kpn I, Cla I и Hind III; на фиг.2(б) – нуклеотидная последовательность олигонуклеотидных праймеров, использованных для амплификации кДНК лептина человека; на фиг.3 – аминокислотная последовательность полипептида лептина, кодируемого рекомбинантной плазмидой рТrсТЕ-Lep; на фиг.4 – электрофореграмма лизатов клеток штамма-реципиента Е. coli W3110 (дорожка 1), штамма-продуцента Е. coli W3110/pTrcTE-Lep при концентрации ИПТГ в среде 0,05 мМ (дорожка 2) и 1 мМ (дорожка 3) в 13%-ном полиакриламидном геле (стрелкой указан полипептид лептин); на фиг.5 – иммуноблот лизатов клеток штамма-продуцента Е. coli W3110/pTrcTE-Lep (дорожка 1) и штамма-реципиента Е. coli W3110 (дорожка 2) (стрелкой указан комплекс лептина с моноклональными антителами).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pSK-Lep.

Выделяют суммарную клеточную РНК из жировой ткани человека. Для этого 0,8 г жировой ткани размельчают в жидком азоте, после чего гомогенизируют в 10 мл реагента TRIZOL (Gibco BRL, США) с использованием гомогенизатора TISSUMIZER (Tekmar, США). К полученному гомогенату добавляют 2 мл хлороформа, перемешивают до образования суспензии и откручивают при 12000 g 15 мин при 4^oС. Отбирают верхнюю водную фазу, содержащуюся в ней РНК осаждают добавлением 5 мл изопропилового спирта, выдерживают 10 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют при 12000 g 10 мин при 4^oС. Полученный осадок промывают 75%-ным этиловым спиртом, высушивают на воздухе и растворяют в 500 мкл воды. Концентрацию РНК определяют спектрофотометрически при длине волны 260 нм.

Суммарную клеточную РНК используют для получения кДНК лептина человека методом обратной транскрипции – полимеразной цепной реакции. Обратную транскрипцию проводят следующим образом: 5 мкг РНК в 10 мкл водного раствора инкубируют 5 мин при 75^oC, после чего добавляют 50 пмоль праймера I (фиг.2 (б)), 4 мкл 5-кратного буфера (250 мМ трис-HCl, pH 8,3, 375 мМ КСl, 15 мМ MgCl₂, 10 мМ дитиотреитол), 4 мкл смеси, содержащей 2,5 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов, 1 мкл (40 ед.) рекомбинантного ингибитора рибонуклеаз (Gibco BRL, США), 1,5 мкл (200 ед/мкл) M-MLV обратной транскриптазы (Gibco BRL, США) и воду до конечного объема 20 мкл. Реакционную смесь инкубируют 1 ч при 42^oC, реакцию останавливают прогревом 5 мин при 75^oС.

Синтез второй цепи и амплификацию кДНК лептина человека осуществляют следующим образом: к 5 мкл реакционной смеси, полученной после проведения обратной транскрипции, прибавляют по 100 пмоль праймеров I и II, 8 мкл смеси, содержащей 2,5 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов, 10 мкл 10-кратного буфера (100 мМ трис-HCl, pH 8,8, 500 мМ КСl, 15 мМ MgCl₂), 2 ед. Taq ДНК-полимеразы (Fermentas, Литва) и воду до 100 мкл. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят в следующем режиме: денатурация – 1 мин, 94^oC; отжиг – 1 мин, 62^oС; достройка – 1 мин, 72^oС; количество циклов – 35. Праймер I представляет собой 36-звенный олигонуклеотид, в состав которого входят сайт узнавания рестриктазы Сlа I, стартовый ATG-кодон и 22 нуклеотида 5′-области кДНК зрелого лептина человека. Праймер II представляет собой 33-звенный олигонуклеотид, содержащий сайт узнавания рестриктазы Hind III, а также последовательность, комплементарную стоп-кодону гена лептина человека и прилегающим 18 нуклеотидам кодирующей области.

5 мкг плазмидной ДНК pBluescript (SK)+ (“Stratagene”, США) обрабатывают 15 ед. рестриктазы Sma I (Fermentas, Литва) 1,5 ч при 30^oС в 30 мкл буферного раствора, содержащего 33 мМ трис-ацетата (pH 7,9), 10 мМ ацетата магния, 66 мМ ацетата калия, и из полученного гидролизата выделяют линеаризованную плазмидную ДНК переносом на DEAE – мембрану NA-45 (Schleicher & Schuell, Германия) из 0,8%-ного агарозного геля.

0,5 мкг полученного в результате ПЦР фрагмента длиной 0,467 т.п.о. и 0,1 мкг векторной части плазмиды pBluescript (SK)+ длиной 2,961 т.п.о. сшивают при помощи лигазной реакции в течение 14 ч при 16^oС в 15 мкл раствора, содержащего 40 мМ триса-НСl (pH 7,8), 10 мМ MgCl₂, 10 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ аденозинтрифосфата и 3 ед. Вейса Т4 ДНК-лигазы (Fermentas, Литва). 5 мкл реакционной смеси используют для трансформации 200 мкл компетентных клеток Escherichia coli XL-1 Blue (“Stratagene”, США). 1/10 часть от общего количества клеток, использованных для трансформации, высевают на LB-агар, содержащий 75 мкг/мл ампициллина. В процессе рассева клеток на поверхность агара добавляют 100 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и 20 мкл 4%-ного раствора 5-бромо-4-хлоро-3-индоксил--D-галактозида.

Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pSK-Lep позволяет использовать принцип цветной селекции для поиска клонов, содержащих встраиваемый фрагмент. Из выросших белых клонов выделяют плазмидную ДНК и анализируют рестрикционным анализом. Отбирают плазмидные ДНК, содержащие нужный набор рестрикционных фрагментов. Определяют нуклеотидную последовательность отобранных ДНК и окончательно отбирают плазмидные ДНК, в которых нуклеотидная последовательность кДНК лептина полностью соответствует данным, приведенным на фиг.2.

Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pTrcTE-Lep.

10 мкг плазмидной ДНК pSK-Lep обрабатывают 20 ед. рестриктазы Сla I и 30 ед. Hind III (Fermentas, Литва) в течение 2 ч при 37^oC в 50 мкл буферного раствора, содержащего 33 мМ трис-ацетата (pH 7,9), 10 мМ ацетата магния, 66 мМ ацетата калия, и из полученного гидролизата выделяют переносом из 2%-ного агарозного геля на DEAE-мембрану NA-45 фрагменты кДНК лептина человека длиной 0,351 т.п.о. (Cla I – Hind III фрагмент) и 0,099 т.п.о. (Hind III – Hind III фрагмент).

5 мкг плазмидной ДНК pTrcTEGF(b) размером 4,804 т.п.о., содержащей trc-промотор и усилитель трансляции TREN бактериофага Т7, обрабатывают 10 ед. рестриктазы Cla I и 15 ед. рестриктазы Hind III в течение 2 ч при 37^oC в 30 мкл буферного раствора, содержащего 33 мМ трис-ацетата (pH 7,9), 10 мМ ацетата магния, 66 мМ ацетата калия, и из полученного гидролизата выделяют переносом из 0,8%-ного агарозного геля на DEAE-мембрану NA-45 векторную часть плазмидной ДНК длиной 4,232 т.п.о.

0,02 мкг Cla I – Hind III фрагмента кДНК лептина человека длиной 0,351 т.п.о. и 0,05 мкг векторной части плазмидной ДНК pTrcTEGF(b) длиной 4,232 т. п. о. соединяют при помощи лигазной реакции в течение 3 ч при 10^oC в 15 мкл раствора, содержащего 40 мМ трис-НС1 (pH 7,8), 10 мМ MgCl₂, 10 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ аденозинтрифосфата и 2 ед. Вейса Т4 ДНК-лигазы. 5 мкл реакционной смеси используют для трансформации 200 мкл компетентных клеток XL-1 Blue. 1/10 клеток, использованных для трансформации, высевают на LB-агар, содержащий 75 мкг/мл ампициллина. Из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК, содержащую фрагмент кДНК лептина человека.

5 мкг полученной плазмидной ДНК, содержащей фрагмент кДНК лептина человека длиной 0,351 т.п.о., обрабатывают 15 ед. рестриктазы Hind III в течение 1,5 ч при 37^oC в 20 мкл буферного раствора, содержащего 33 мМ трис-ацетата (pH 7,9), 10 мМ ацетата магния, 66 мМ ацетата калия, и из гидролизата выделяют линеаризованную ДНК длиной 4,583 т.п.о. переносом из 0,8%-ного агарозного геля на DEAE-мембрану NA-45. 0,2 мкг полученной таким образом векторной ДНК длиной 4,583 т.п.о. соединяют с 0,02 мкг Hind III – Hind III фрагмента кДНК лептина длиной 0,099 т.п.о. посредством лигазной реакции в течение 3 ч при 10^oC в 10 мкл раствора, содержащего 40 мМ трис-НСl (pH 7,8), 10 мМ MgCl₂, 10 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ аденозинтрифосфата и 2 ед. Вейса Т4 ДНК-лигазы. 2 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток XL-1 Blue. 1/10 клеток, использованных для трансформации, высевают на LB-агар, содержащий 75 мкг/мл ампициллина. Из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК pTrcTE-Lep, содержащую Hind III – Hind III фрагмент кДНК лептина в требуемой ориентации.

Окончательно структуру рекомбинантной ДНК pTrcTE-Lep подтверждают определением нуклеотидной последовательности в области встроенной кДНК лептина человека.

Пример 3. Получение штамма-продуцента полипептида со свойствами лептина человека.

Рекомбинантной плазмидной ДНК pTrcTE-Lep трансформируют компетентные клетки Escherichia coli W3110 (American Type Culture Collection, 27325) и получают штамм-продуцент полипептида со свойствами лептина человека.

Пример 4. Определение продуктивности штамма-продуцента полипептида со свойствами лептина человека.

Ночную культуру клеток Е. coli W3110/pTrcTE-Lep в объеме 200 мкл переносят в 10 мл жидкой среды LB, содержащей 75 мкг/мл ампициллина, и выращивают до оптической плотности 0,7 (длина волны 550 нм) при 37^oС при 175 об/мин. Добавляют ИПТГ до конечной концентрации 0,05 и 1 мМ, после чего клетки выращивают в течение 3 часов. Отбирают пробу 0,5 мл и центрифугируют 5 мин при скорости 6000 об/мин. Осажденные клетки суспендируют в 100 мкл буфера, содержащего 125 мМ трис-HCl, pH 6,8, 20% глицерин, 3% додецилсульфат натрия, 3% меркаптоэтанол, 0,005% бромфеноловый синий, инкубируют 10 мин в кипящей водяной бане, образцы объемом 5 мкл анализируют электрофорезом в 13% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Гель окрашивают Кумасси R-250 (фиг. 4), сканируют и рассчитывают процентное содержание рекомбинантного белка в лизатах с использованием программы Scion Image (Scion Corp., США). По данным сканирования полипептид лептин составляет 43-46% от общего клеточного белка при концентрации ИПТГ 0,05 мМ и 50-54% при концентрации ИПТГ 1 мМ.

Пример 5. Иммуноблот лизатов штамма-продуцента Е. coli W3110/рТrсТЕ-Lep с моноклональными антителами к лептину человека.

Получают клетки штамма-реципиента Е. coli W3110 и штамма-продуцента Е. coli W3110/pTrcTE-Lep после индукции 0,05 мМ ИПТГ в течение 3 ч при 37^oС при 175 об/мин. Для каждого штамма отбирают пробу 0,5 мл и центрифугируют 5 мин при скорости 6000 об/мин. Осажденные клетки суспендируют в 100 мкл буфера, содержащего 125 мМ трис-HCl, pH 6,8, 20% глицерин, 3% додецилсульфат натрия, 3% меркаптоэтанол, 0,005% бромфеноловый синий, инкубируют 10 мин в кипящей водяной бане, образцы объемом 5 мкл анализируют электрофорезом в 13% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, после чего осуществляют перенос белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану. Проводят связывание белков на мембране с моноклональными антителами к лептину человека МАВ398 (R&D Systems, США) в течение 2 ч при концентрации антител 1,25 мкг/мл в 20 мМ трис-HCl, pH 7,6, 140 мМ NaCl. Мембрану отмывают от несвязавшихся антител, после чего мембрану инкубируют в присутствии конъюгата пероксидазы хрена и козлиных антител к антителам мыши (Sigma, США) в разведении 1:4000 в течение 2 ч в 20 мМ трис-HCl, pH 7,6, 140 мМ NaCl. Детекцию (фиг. 5) проводят с использованием набора для усиленной хемилюминесцентной детекции ECL (Amersham Life Science, Великобритания).

Пример 6. Выделение и характеризация рекомбинантного полипептида со свойствами лептина человека.

Проводят индукцию биосинтеза лептина в клетках штамма-продуцента Е. coli W3110/pTrcTE-Lep ИПТГ (конечная концентрация 0,05 мМ) в течение 3 ч. Клетки центрифугируют, после чего 1 г влажной биомассы обрабатывают лизоцимом и ультразвуком в 10 мл буферного раствора, содержащего 0,05 М трис-HCl, pH 8,0, 0,1 М NaCl и 0,001 М ЭДТА. Лизат центрифугируют в течение 10 мин при 10000 об/мин. Осадок, содержащий тельца включения, отмывают буферным раствором, содержащим 1% тритона Х-100, 0,05 М трис-HCl, pH 8,0, 0,025 М NaCl, 0,001 М ЭДТА, и тем же буферным раствором без тритона Х-100.

Для выделения лептина очищенные тельца включения растворяют в 10 мл 6 М раствора гуанидинхлорида, содержащего дитиотреитол, выдерживают в растворе окисленной и восстановленной формы глутатиона и выделяют хроматографическими методами: ион-обменной хроматографией и гель-фильтрацией. Лептин человека получают в 0,1 М уксусной кислоте, либо в 0,01 М трехзамещенном цитрате натрия, либо в 0,05 М бикарбонате аммония.

Описываемый способ выделения позволяет получить 34 мг лептина из 1 г влажной биомассы, что соответствует 34 мг белка из 100 мг лиофилизированной биомассы.

N-концевую аминокислотную последовательность определяют на секвенаторе 477А и ФТГ анализаторе 120А фирмы “Applied Biosystems”, США. Препарат рекомбинантного лептина человека имеет следующую структуру N-конца молекулы: Met Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp…, т.е. соответствует структуре N-конца природного лептина человека с дополнительным метиониновым остатком, не влияющим на его биологические свойства [6].

Анализ вторичной структуры полипептида лептина осуществляют методом кругового дихроизма на приборе J500C фирмы JASCO (Япония). По данным анализа, доля аминокислотных остатков, входящих в состав -спиральных участков составляет 642%, что в пределах погрешности опыта совпадает с данными рентгено-структурного анализа растворимой мутантной формы лептина, имеющей аминокислотную замену триптофана на аспарагиновую кислоту в 100-м положении [14] .

Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить полипептид со структурой и свойствами, идентичными структуре и свойствам природного лептина человека; биосинтез полипептида индуцируется добавлением ИПТГ до конечной концентрации всего 0,05 мМ, и при этом уровень его синтеза составляет не менее 43% от суммарного клеточного белка за счет того, что ген лептина находится под контролем trc-промотора Е. coli, а трансляция белка усиливается за счет синтетического усилителя трансляции. Все это позволяет значительно повысить технологичность и экономичность процесса получения рекомбинантного лептина за счет значительного снижения расхода индуктора при одновременном увеличении выхода целевого продукта в 1,5 раза.

Источники информации

11. Патент США N 6048837, 2000.

13. Патент Российской Федерации 2113483.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рTrcTE-Lep, кодирующая полипептид со свойствами лептина человека с мол. м. 3,09 Мd (4,682 т. п. о. ), состоящая из Cla I/Hind III-фрагмента ДНК плазмиды рTrcTEGF длиной 4,232 т. п. о. , включающего trc-промотор Е. cоli, синтетический усилитель трансляции TREN гена 10 бактериофага Т7, терминатор транскрипции фага лямбда, ген bla -лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой рTrcTE-Lep клеток к ампициллину, участок оri инициации репликации; фланкированной сайтами рестрикции Сla I и Hind III кДНК длиной 0,450 т. п. о. , кодирующей аминокислотную последовательность зрелой формы лептина человека и имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в фиг. 2; содержащая уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: Nco I – 265, Eco RI – 270, Kpn I – 286. Xba 1 – 340, Cla – 377.

2. Штамм бактерий Esсherichia coli W3110/рTrcTE-Lep – продуцент полипептида со свойствами лептина человека.

РИСУНКИ