Патент на изобретение №2185103
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ IN VITRO
(57) Реферат: Изобретение может быть использовано в медицине для определения фотодинамической активности in vitro. В оптически прозрачный сосуд для фотобиологических исследований помещают биологическую культуральную среду, содержащую культуру опухолевых клеток, вводят фотосенсибилизатор, инкубируют культуру клеток с фотосенсибилизатором, отмывают культуру клеток от фотосенсибилизированной культуральной среды, добавляют чистую культуральную среду, дополнительно в культуральную среду непосредственно перед облучением вводят эритроциты, полученную среду облучают, во время облучения измеряют спектр поглощения или рассеяния среды в оптическом диапазоне, по соотношению вкладов спектров окси- и дезоксигемоглобина в упомянутый спектр определяют степень оксигенации среды и скорость ее изменения, а именно определяют фотодинамическую активность фотосенсибилизатора по отношению скорости изменения оксигенации среды к плотности мощности облучения. Предпочтительно эритроциты вводят в количестве 0,2-1 об.%. Предлагаемый способ является более достоверным и простым по сравнению с известными. 1 з.п.ф-лы. Настоящее изобретение относится к фотобиологии и медицине, а более конкретно – способам оценки эффективности фотосенсибилизаторов – препаратов, используемых для фотодинамической терапии. Известен способ определения фотодинамической активности in vitro, при котором в оптически прозрачный сосуд для фотобиологических исследований помещают биологическую культуральную среду, содержащую культуру опухолевых клеток, вводят фотосенсибилизатор, инкубируют культуру клеток с фотосенсибилизатором, затем культуру клеток отмывают от фотосенсибилизированной культуральной среды, добавляют чистую культуральную среду, затем этот сосуд облучается светом соответствующей длины волны. В результате фотодинамического воздействия часть клеток гибнет, и по соотношению погибших и выживших клеток определяют фотодинамическую активность фотосенсибилизатора [Р.И. Якубовская и др. “Скрининг и медико-биологическое изучение отечественных фотосенсибилизаторов”. Российский химический журнал, том XLII, с. 17-23] /1/. Недостатком известного способа является его сложность, трудоемкость, неоперативность, необходимость использования сложных микроскопических, радиоактивных или флуоресцентных методов для контроля соотношения погибших и выживших клеток. При этом требуется значительное число проб, но даже при этом условии высока вероятность неудачного завершения исследований (например, из-за контаминации (“зарастания”) клеток, вызванной нарушением стерильности и т.д.), что снижает достоверность определения. В настоящем изобретении решается задача упрощения способа и повышения достоверности определения фотодинамической активности in vitro. Указанная задача решается тем, что в предлагаемом способе определения фотодинамической активности in vitro, при котором в оптически прозрачный сосуд для фотобиологических исследований помещают биологическую культуральную среду, содержащую культуру опухолевых клеток, вводят фотосенсибилизатор, инкубируют культуру клеток с фотосенсибилизатором, отмывают культуру клеток от фотосенсибилизированной культуральной среды, добавляют чистую культуральную среду, дополнительно в культуральную среду непосредственно перед облучением вводят эритроциты, полученную среду облучают, во время облучения измеряют спектр поглощения или рассеяния среды в оптическом диапазоне, по соотношению вкладов спектров окси- и дезоксигемоглобина в упомянутый спектр определяют степень оксигенации среды и скорость ее изменения, а именно определяют фотодинамическую активность фотосенсибилизатора по отношению скорости изменения оксигенации среды к плотности мощности облучения. Предпочтительно введение эритроцитов в количестве 0,2…1 об.%. Предлагаемый способ определения фотодинамической активности in vitro осуществляется следующим образом. В биологическую культуральную среду, содержащую культуру опухолевых клеток, вводят фотосенсибилизатор, инкубируют культуру клеток с фотосенсибилизатором, отмывают культуру клеток от фотосенсибилизированной культуральной среды, добавляют чистую культуральную среду, добавляют эритроциты. Оптимально эритроциты добавляют в среду в количестве 0,2…1 об.%. Такое количество достаточно для надежной регистрации спектра поглощения окси- и дезоксигемоглобина и не влияет на свойства изучаемой среды. Далее проводится облучение и в автоматическом режиме мониторинга регистрируются спектры поглощения или рассеяния, производится расчет соотношения окси- и дезоксигемоглобина, по динамике изменения которого оценивается скорость изменения оксигенации среды, по которой и определяют фотодинамическую активность фотосенсибилизатора. Пример конкретной реализации способа. В 24-луночный культуральный планшет помещают культуральную среду RPMI 1640, дополненную 10% FCS, со взвесью клеток мелкоклеточного рака легкого Н69 с концентрацией 105 клеток/мл, добавляют препарат “Фотосенс” до конечной концентрации 10 мкг/мл, инкубируют в СО2-инкубаторе при температуре 37oС в течение 24 ч, отмывают культуру клеток от фотосенсибилизированной культуральной среды, добавляют чистую культуральную среду, затем в среду добавляют эритроциты в количестве 1 об.% и в течение 2 мин облучают излучением с длиной волны 670 нм и плотностью мощности 100 мВт/см2, используя для облучения лазер ЛД-680-2000 со световодом TF-FC-5m-600-SMA. Для контроля оксигенации эритроцитов используют спектроанализатор ЛЭСА-6-Ох с волоконно-оптическим приемным катетером FOC-R-!-6 и источник белого света LS-H-3 со световодом TF-FC-5m-600-SMA. Значения оксигенации за время облучения уменьшаются от 100% вплоть до 0%. В качестве критерия для оценки фотодинамической активности используют значение скорости дезоксигенации или приведенную величину – коэффициент эффективности ФДТ (КФДТ) – отношение скорости дезоксигенации к плотности мощности облучения. В данном эксперименте время дезоксигенации от уровня 100% до уровня 0% при плотности мощности облучения 300 мВт/см2 составляет 90 с, КФДТ соответственно равен 36% см2/Вт, что соответствует высокой фотодинамической активности. Исследования авторов показали, что поскольку большинство фотосенсибилизаторов являются фотосенсибилизаторами второго рода, и основным цитотоксическим агентом при их фотодинамическом действии является синглетный кислород, то при исследовании фотодинамической активности in vitro происходит утилизация растворенного в этой среде молекулярного кислорода, и эта утилизация проходит тем быстрее, чем выше скорость фотодинамической реакции. В свою очередь, это приводит к уменьшению насыщения кислородом гемоглобина в эритроцитах, которое вычисляется из спектра поглощения или рассеяния среды в оптическом диапазоне ( по соотношению вкладов спектров окси- и дезоксигемоглобина в упомянутый спектр). Были получены достаточно точные и повторяемые результаты при широкой вариации параметров облучения, концентрации и состава фотосенсибилизаторов, позволяющие сделать вывод о высокой точности, оперативности и надежности предлагаемого способа для определения фотодинамической активности in vitro. Таким образом, предлагаемый способ является более достоверным и простым по сравнению с известным. Формула изобретения
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 30.03.2005
Извещение опубликовано: 10.03.2006 БИ: 07/2006
|
||||||||||||||||||||||||||
