Патент на изобретение №2184782
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИСТЕРИЙ
(57) Реферат: Изобретение относится к микробиологии. Может быть использовано для бактериологической диагностики листериоза животных и человека и для выделения листерий из объектов окружающей среды. Среда содержит следующие компоненты, г/л: дрожжевой экстракт – 10,0; глюкоза – 1,0; агар-агар – 10,0; эскулин – 0,6; цитрат железа трехвалентного – 0,5; налидиксовая кислота – 0,04; метиленовый синий – 0,03; панкреатический рыбный гидролизат c содержанием аминного азота 110 мг % – остальное. Среда обладает более высокими ростовыми и дифференциально-диагностическими свойствами. 1 табл. Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для бактериологической диагностики листериоза животных и человека и для выделения листерий из объектов окружающей среды. Актуальность проблемы заключается в том, что листериоз животных и человека широко распространен по всем мире. Однако по сравнению с развитыми странами процент выявления заболеваемости людей листериозом в нашей стране сравнительно невысокий, причем главной причиной является несовершенство лабораторной диагностики вследствие отсутствия недорогих отечественных, эффективных дифференциально-диагностических сред для диагностики и выделения листерий. В нашей стране в настоящее время в основном используют дорогостоящие зарубежные селективные среды. Известна импортная селективная среда PAL CAM (по прописи Merck) (Бактериологический контроль пищевых продуктов на наличие листерий, Бакулов И. А. , – Ульяновск, 1999, с. – 22) содержащая следующие компоненты: пептон, крахмал, хлористый натрий, агар-агар, эскулин, аммоний железа (III) сульфат, Д-маннит, феноловый красный, глюкоза, хлористый литий. Недостатком этой среды является ее очень высокая цена – цена одного килограмма равна 226 $. Известна отечественная “Питательная среда для выделения листерий”, заявка 95-1099695/13, МКИ 12 Q 1/04, С 12 N 1/20, авторы Ибрагимов Ф.Х., Бойко О. В. , Бойко А.В., содержащая гидролизат казеина, сухой питательный бульон, мочевину, теллурит калия, агар-агар и воду. Недостатком данной среды является: во-первых, довольно большая стоимость, за счет использования гидролизата казеина, во-вторых, низкая разрешающая способность, т.к. теллурит калия ингибирует не только сопутствующую микрофлору, но и некоторые штаммы листерий. Наиболее близкой к предлагаемому техническому решению является селективная питательная среда (автореферат “Психрофильность Listeria monocytogenes и ее эколого-эпидемиологическое значение”, Беленева И.А. – Владивосток, 1996, с. 9), состоящая из питательного агара КД (г.Махачкала), трипафлавина, налидиксовой кислоты и полимиксина В. Недостатком данной среды является ее низкая разрешающая способность, т. к. она не дифференцирует колонии листерий от колоний сопутствующей микрофлоры, а также из-за недостатка питательных веществ в среде колонии вырастают очень мелкие (0,4-0,5 мм) и их трудно различить на желтоватом фоне среды. Задачей данного изобретения является получение недорогой отечественной питательной среды с высокой разрешающей способностью, не уступающей зарубежным средам. Это достигается тем, что питательная среда, содержащая источники азота, агар-агар, налидиксовую кислоту и воду дополнительно содержит дрожжевой экстрат, глюкозу, эскулин, цитрат железа трехвалентного и метиленовый синий, а в качестве источника азота она содержит панкреатический рыбный гидролизат по Хоттингеру с содержанием аминного азота 110 мг % при следующем соотношении компонентов, л: Дрожжевой экстрат – 10,0 Глюкоза – 1,0 Агар-агар – 10,0 Эскулин – 0,6 Цитрат железа – 0,5 Налидиксовая к-та – 0,04 Метиленовый синий – 0,03 Панкреотический рыбный гидролизат – Остальное Приготовление среды. Заранее готовят: 1. Панкреотический рыбный гидролизат по Хоттингеру по известной методике (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, Биргер О.М., Москва, 1967, с.53-54); 2. 10% раствор дрожжевого экстрата, используя сухой коммерческий препарат. Стерилизуют его при 0,5 атм, 20 мин; 3. 1% раствор налидиксовой кислоты – 0,05 г налидиксовой кислоты растворяют в 0,5 мл 1N NaOH и добавляют 4,5 мл дистиллированной воды; 4. 1% раствор метиленового синего – 1 г вещества растворяют в 100 мл дистиллированной воды; Затем готовят питательный агар, при этом из основного перевара по Хоттингеру готовят сначала питательный бульон, разводят дистиллированной водой до содержания в нем аминного азота 123 мг %. Затем в 1 л питательного бульона добавляют 12 г агар-агара и 0,5-0,6 NaCl. Стерилизуют при 1 атм (121oС) в течение 20 мин. Для приготовления 1л питательной среды берут 100 мл 10% стерильного дрожжевого экстракта, 1 г глюкозы, 0,6 г эскулина, 0,5 г цитрата железа (III), 3 мл 1% раствора метиленового синего и остальное питательный агар. Смесь доводят до кипения, варят на медленном огне 2-3 мин, затем добавляют 4 мл налидиксовой кислоты. Среду тщательно перемешивают, разливают по чашкам Петри по 13-20 мл (в зависимости от размера чашки). Цвет застывшей питательной среды голубовато-синий. рН среды 7,2-7,4. Предлагаемый панкреатический рыбный гидролизат в качестве питательной основы, являясь продуктом глубокого расщепления белков, содержит широкий спектр аминокислот, играющих важную роль в метаболизме микроорганизмов. Кроме того, содержание амминного азота в данной питательной среде в количестве 110 мг % в сочетании с глюкозой и дрожжевым экстрактом в предлагаемых количествах способствует интенсивному росту листерий, так как дрожжевой экстракт является поставщиком витаминов группы В, а глюкоза – источником углерода. Применение метиленового синего в сочетании с налидиксовой кислотой в предложенных количествах позволяет подавить сопутствующего микрофлору, при этом не оказывает ингибирующего действия на рост листерий. Также метиленовый синий окрашивает питательную среду в голубовато-синий цвет. На этом фоне колонии листерий очень хорошо видны. Использование эскулина и цитрата железа (III) позволяет дифференцировать колонии листерий от сопутствующих бактерий по биохимическому тесту-гидролиз эскулина. Колонии листерий серебристо-серого цвета, слегка выпуклые с черным ареалом хорошо выделяются на синем фоне среды. Величина колоний 1,2-1,5 мм. Агар-агар используется в качестве уплотнителя среды. Заявленное техническое решение соответствует критерию “изобретательский уровень” ввиду того, что впервые для дифференциации листерий используют панкреатический рыбный гидролизат с содержанием аминного азота 110 мг % в сочетании с дрожжевым экстрактом и глюкозой в предлагаемых концентрациях и метиленовый синий в сочетании с налидиксовой кислотой в качестве селективной добавки в питательной среде для выделения листерий, а также использование биохимического теста, присущего большинству серотипов Listeria monocytogenes – способность гидролизовать эскулин. Существенным отличием предложенного технического решения является – возможность использования предлагаемой среды для более точной дифференциации листерий; – замена дорогостоящих импортных питательных основ на недорогую отечественную; – использование метиленового синего в качестве ингибитора посторонней микрофлоры и красителя самой среды. В результате этого достигается – интенсификация роста листерий; – индикация и дифференциация листерий; – удешевление питательной среды; – расширение ассортимента отечественных питательных сред для дифференциации листерий. Пример конкретного выполнения Для приготовления 1 л питательной среды берут 100 мл 10% стерильного дрожжевого экстракта, 1 г глюкозы, 0,6 г эскулина, 0,5 г цитрата железа (III), 3 мл 1% раствора метиленового синего и остальное питательный агар с содержанием аминного азота 123 мг %. Смесь доводят до кипения, варят на медленном огне 2-3 мин, затем добавляют 4 мл 1% раствора налидиксовой кислоты. Среду тщательно перемешивают, разливают по чашкам Петри по 13-20 мл (в зависимости от размера чашки). Цвет застывшей питательной среды голубовато-синий, рН среды 7,2 – 7,4. На приготовленную среду высевали штаммы 4 b, 1/2 а е 546 L. Monocytogenes в количестве 102КОЕ в 0,1 мл физиологического раствора, а также в смеси с почвенной болтушкой в количестве 102KOE в 0,1 мл почвенной взвеси. Через 48 ч культивирования при 37oС на чашках с чистой культурой выросло 42 колонии штамма 4 b, 62 колонии штамма 1/2 а е 54 колонии штамма 546. Колонии круглые, величина колоний 1,2-1,5 мм, цвет серебристо-серый с четко выраженным черным ореолом на синем фоне среды. В смеси с почвенной болтушкой колонии листерий четко дифференцировались от колоний почвенных возбудителей. Колонии сопутствующей микрофлоры выросли мелкие (0,4-0,6 мм), бесцветные в незначительном количестве. Для сравнительного изучения ростовых и дифференциально-диагностических свойств известных технических решений и предлагаемой среды были использованы среды, взятые в качестве аналогов и прототипа. Результаты исследований представлены в таблице. Предложенная питательная среда по своим ростовым и дифференциально-диагностическим свойствам не уступает зарубежной питательной среде (1) и дешевле ее по стоимости в 8 раз. По сравнению с прототипом предлагаемая питательная среда обладает более высокими ростовыми факторами, ярко выраженными дифференциально-диагностическими свойствами, а также более высокой ингибирующей способностью по отношению к сопутствующей микрофлоре, при этом не угнетая рост листерий. Технико-экономическая эффективность данного предложения заключается в следующем: – повышается диагностическая эффективность и возможность дифференциации листерий в сравнительно короткие сроки с минимальными затратами; Это дает возможность отказаться от использования дорогостоящих зарубежных питательных сред и увеличить процент обнаружения листериоза человека и животных в стране для успешной борьбы с этим заболеванием. Формула изобретения
Дрожжевой экстракт – 10,0 Глюкоза – 1,0 Агар-агар – 10,0 Эскулин – 0,6 Цитрат железа трехвалентного – 0,5 Налидиксовая кислота – 0,04 Метиленовый синий – 0,03 Панкреатический рыбный гидролизат с содержанием аминного азота 110 мг% – Остальное РИСУНКИ
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 03.11.2002
Номер и год публикации бюллетеня: 16-2004
Извещение опубликовано: 10.06.2004
|
||||||||||||||||||||||||||
