Патент на изобретение №2184776

(54) МУТАНТНАЯ ЛИНИЯ КЛЕТОК ПОЧКИ ОВЦЫ OVIS ARIE L, ДЕФЕКТНАЯ ПО ТИМИДИНКИНАЗЕ ПО-100-ТК^–, ДЛЯ ГИБРИДИЗАЦИИ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ IN VITRO

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для вирусологических и биотехнологических исследований. Мутантную линию клеток почки овцы Ovis arie L, дефектную по тимидинкиназе, получают из нормальной ткани почки овцы путем многошаговой селекции с использованием токсичного аналога пиримидиновых оснований 5-бром-2-дезоксиуридина. Линию клеток культивируют на питательных средах с минимальной концентрацией фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Изобретение позволяет проводить межвидовую и внутривидовую гибридизацию и получать клеточные гибриды с полезными свойствами.

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, именно к выведению клеточных гибридов, используемых для вирусологических и биотехнологических исследований.

Методы гибридизации соматических клеток в настоящее время широко применяются для решения различных теоретических проблем биологии и многих практических задач медицины и ветеринарии. Мутантные и гибридные линии клеток используются при исследовании действия генов и их регуляции, механизмов клеточной дифференцировки, взаимодействия ядра и цитоплазмы, проблем злокачественного роста, а также для изучения взаимодействия между вирусами и клетками хозяев.

В 1972 г. Сlive et al. подтвердил, что резистентность клеток млекопитающих к 5-бром-2-дезоксиуридину обусловлена истинной генной мутацией, отвечающей за отсутствие синтеза тимидинкиназы /1/.

Известен мутантный штамм клеточного клона почки эмбриона свиньи, дефектный по тимидинкиназе /2/.

В задачу наших исследований входило получить мутантный штамм почки овцы, дефектный по тимидинкиназе.

Предложенный мутантный штамм линии клеток почки овцы (Ovis aries L) ПО-100-ТК является мутантным по гену, отвечающему за синтез фермента тимидинкиназа. Мутантный штамм (генная мутация) получен из нормальной, не раковой ткани почки овцы ПО-2 в результате многошаговой селекции с использованием токсичного аналога пиримидиновых оснований нуклеиновых кислот-5-бром-2-дезоксиуридина. Штамм хорошо культивируется на отечественных питательных средах с минимальной концентрацией фетальной сыворотки крупного рогатого скота.

Мутантный штамм линии клеток почки овцы (Ovis aries L) назван авторами ПО-100-ТК^– и хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток с/х и промысловых животных СХЖ РАСХН. ВИЭВ, под номером 56, 2000 г.

Морфологические признаки
Клеточный клон состоит из эпителиоподобных клеток, границы клеток четко выражены. Ядра разнородные по величине и округлые по форме. Ядрышки мелкие, по несколько штук в ядре. Цитоплазма клеток гомогенная, вакуолизированная. Модальный класс хромосом составляет 54 (нормальный кариотип 2 n=54).

Культуральные свойства
Мутантный клон культивируется в среде Игла МЕМ с добавлением 3-5% фетальной сыворотки к.р.с. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов 0,25% трипсина и 0,2% версена в соотношении 1:9. Монослой клеток формируется через 3-4 дня с коэффициентом пересева 1:3-1:4. Частота пассирования культур составляет 4-6 дней. Посевная концентрация 1-10⁵ клеток в 1 мл.

Митотическая активность к 3-4 суткам культивирования достигает до 22-24%. Эффективность клонирования клеточного штамма 30-45%. Мутантный штамм чувствителен к вирусам инфекционного ринотрахеита к.р.с., ринопневмонии лошадей.

Криоконсервация штамма
Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Концентрация клеток при замораживании 3-5 млн в 1 мл. Криозащитную среду готовят по следующему составу:
50-60% – среда Игла МЕМ,
40-30% – фетальная сыворотка крупного рогатого скота,
10% – диметилсульфоксид.

Суспензию клеток разливают по 1 мл в ампулы. Замораживание проводят по двухступенчатому методу.

Сведения о контаминации
Бактерии и грибы не обнаружены.

Микоплазмы при бактериологическом, цитологическом исследовании с применением флюорохрома (оливомицина) не обнаружены.

Пример использования штамма
Мутантный штамм линии клеток почки овцы (Ovis aries L), дефектный по тимидинкиназе ПО-100-ТК^–, использовали для слияния со спленоцитами и лимфоцитами, выделенными из овцы.

Соотношение клеток партнеров по гибритазии составило 1:5-1:10. После слияния клетки высеивают по 2,510⁵-5,010⁴ клеток на чашку Петри диаметром 60 мм в среду Игла МЕМ, содержащую 13,6 мкг/мл гипоксантина, 1,18 мкг/мл аминоптерина, 3,87 мкг/мл тимидина и 20% сыворотки к.р.с. Чашки инкубировали в атмосфере воздуха с 5% СО₂ при 37^oС. Через 19-21 день образовывались гибридные клетки, а родительские погибали. Такая селекция гибридных клеток в среде ГАТ основана на наличии у клеток млекопитающих двух синтезов нуклеотидов. Первый из них представляет собой путь, при котором нуклеотиды синтезируются denovo из сахаров и аминокислот; для второго пути характерно использование уже имеющихся в клетках остатков нуклеозидов – гипоксантина и тимидина.

Основные биосинтетические пути синтеза:
пуринов – пиримидинов
Запасные пути: – аминоптерин
ГГФРТ
гипоксантин
гуанин+ФРПФ — рибонуклиотиды — РНК
ТК
Тимидин+АТФ — дезоксинуклеотиды — ДНК
Первый путь блокируется с помощью аминоптерина, присутствующего в среде ГАТ. Синтез, использующий остатки нуклеотидов в клетке, зависит от одновременного присутствия в них ферментов гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ) и тимидинкиназы (ТК). При отсутствии одного из них в родительских клетках они не могут размножаться в среде ГАТ. Гибридные клетки в результате комплементации содержат гены обеих родительских клеток, синтезируют оба фермента ГГФРТ и ТК и могут расти в селективной среде ГАТ.

Штамм используется для внутривидовой, а также межвидовой гибридизации. Мутантный штамм линии клеток почки овцы (Ovis aries L), дефектный по тимидинкиназе По-100-ТК, также может быть использован для изучения экспрессии и регуляции генов, механизмов клеточной дифференцировки, проблем злокачественного роста, а также для получения новых клеточных линий с желательными и полезными свойствами (продуцентов различных биологически активных веществ).

Мутантный штамм ПО-100-ТК найдет широкое применение в вирусологических исследованиях и в биотехнологии.

Источники информации
1. Mut. Res., 1972, 16, 77-87.

2. SU 1611929 А1, 07.12.1990.

Формула изобретения

Мутантная линия клеток почки овцы Ovis arie L, дефектная по тимидинкиназе ПО-100-ТК^–, для гибридизации клеток животных in vitro хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных СХЖ РАСХН ВИЭВ под 56.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 16.12.2007

Извещение опубликовано: 7.07.2009 БИ: 21/2009