Патент на изобретение №2184742
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТЕСТАХ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ ВИРУСАМИ ВИЧ-1 ГРУППЫ 0
(57) Реферат: Изобретение относится к новым синтетическим пептидам мономерного типа с 13-33 аминокислотами или димерного типа с 26-66 аминокислотами линейной или циклизованной интерцистеиновыми дисульфидными мостиками формы, соответствующей формуле (I)  -Z-Trp Gly Cys- -Cys Tyr Thr Ser- , (I)вкоторой означаетбиотинил,биоцитинил,атомводорода,ацетил(СН3СО-), алифатическую цепь, которая может содержать одну или несколько тиоловых, альдегидных или аминных функций, при этом алифатическая цепь представляет собой преимущественно алкильную цепь с 1-6 атомами углерода, или алкенильную цепь с 2-6 атомами углерода, или аминоалкилкарбонильную цепь с 2-6 атомами углерода; Z – последовательность пептидов одной из формул в которых  1 означает пептидную последовательность с 2-9 аминокислотами;2 – пептидную последовательность с 0-5 аминокислотами, – пептидную последовательность формулы (XI) -(АА1)-(АА2)-(АА3)-(АА4)-(АА5)- (XI), в которой (AA1) – остаток лизина либо аргинина; (АА2) – остаток глицина, (АА3) – остаток лизина либо аргинина, (АА4) – остаток лейцина либо аланина, (АА5) – остаток валина при условии, что (AA1), (AA2), (АА3), (АА4), (AA5) никогда не образуют вместе пептидные последовательности -Lys Gly Lys Leu Ile- и -Lys Gly Lys Leu Val-; зафиксированная на группе -СО серина, означает: гидроксил, пептидную последовательность формулы (ХII) -Val- – , где – последовательность формулы (ХIII) -(АА6)-Тrр-Asn-(АА7)-(AA8), в которой (АА6) – глутамин или аргинин, (АА7) – глутамин или серин, (AA8) – треонин и в которой , зафиксированная на остатке -СО – свободной аминокислоты AA8, означает группу ОН, пептидную последовательность формулы (ХУ) -Val-, в которой имеет указанное выше значение; композициям для обнаружения инфекции, вызванной ВИЧ-1 группы 0, способам диагностики инфекций, вызванных ВИЧ-1 группы 0 и диагностическому набору. Описываемые пептиды при использовании их в композициях, способах диагностики инфекций и в диагностических наборах позволяют получить результаты превосходящие те, что получены при использовании известных пептидов. 7 с. и 7 з.п. ф-лы, 8 табл.
Изобретение относится к синтетическим пептидам, используемым в биологических тестах с целью обнаружения инфекций, вызванных вирусами ВИЧ-1 группы 0, способу их получения, композициям, наборам, содержащие такие пептиды и биологическим тестам с использованием этих пептидов. Из уровня техники известны ретровирусы ВИЧ-1 группы 0. В европейском патенте 0345375 и в заявке на европейский патент 0657532 описаны изоляты ANT 70 и ANT 70 NA, выделенные у больных из Камеруна. Точнее, в этих материалах описаны антигены и антигенные композиции, содержащие лизаты или протеины упомянутых изолятов, нуклеиновые кислоты, соответствующие геномной РНК, методы гибридизации с использованием указанных нуклеиновых кислот, методы получения упомянутых выше изолятов, а также способы получения протеинов р12, р16, р25, gр41, gр120 указанных ретровирусов. В заявке на европейский патент 0591914 описан изолят MVP 5180/91. Данный изолят, охарактеризованный с помощью метода Western Blot, имеет, как и предыдущий изолят, отличия от давно известных изолятов ретровируса ВИЧ-1. В заявке на европейский патент 0591914 описывается, в частности, ДНК-последовательность изолята MVP 5180/91 и точно приводится локализация генов gag, pol и env. Кроме того в заявке на европейский патент 0591914 приводится описание синтетических пептидов петлевой последовательности V3, а также иммунодоминантной области (др41). Последние могут применяться в биологических тестах, в частности in vitro для обнаружения антител к ВИЧ-1 группы 0. В заявке на европейский патент 0673948 описываются синтетические или рекомбинтные пептиды, состоящие из 15-50 аминокислот (АА) и содержащие последовательность -VWGIRQLRARLQALETLIQNQQRLNLWGXKGKLIXYTSVKWNTSWSGR-, в которой Х означает остаток либо цистеина, либо серина. Эти пептиды применяются в диагностической сфере для выявления инфекций, вызываемых некоторыми изолятами ретровируса ВИЧ-1 группы 0. Известна также заявка на европейский патент 0727483, в которой описывается изолят MVP 2901/94, как составная часть ретровируса семейства ВИЧ-1 группы 0. В этой заявке описываются некоторые антигены с четко определенными пептидными последовательностями. Эти пептидные последовательности соответствуют частично последовательности gp120 и частично последовательности gp41 (иммунодоминантная область) изолята MVP 2901/94. В заявке WO 96/12809 описаны два новых изолята из семейства ВИЧ-1 группы 0. Имеются в виду изоляты VAU и DUR. В этой же заявке описываются и некоторые последовательности пептидов, выделенных из указанных вирусов, которые могут применяться для обнаружения антител, распознающих пептидные последовательности ВИЧ-1 VAU или DUR. В заявке WO 96/32293 описаны два антигена из последовательности изолята ANT 70. Имеются в виду антигены MDL061 и MDL056 в иммунодоминантной области др41. Согласно этому изобретению для обнаружения 100% проб в ограниченной коллекции сывороток больных, инфицированных вирусом ВИЧ-1 группы 0, необходимо применять композиции, содержащие эти два пептида, поскольку каждый пептид в отдельности не обеспечивает получения удовлетворительных результатов. Действительно, ввиду генетической вариабельности изолятов вируса группы 0 почти невозможно гарантировать серологическое выявление зараженных индувидуумов при использовании антигенов одного и того же изолята. Это означает невозможность получения реактивов, гарантирующих 100%-ную чувствительность. Таким образом впервые группа 0 обусловила появление серьезной проблемы: неадекватность некоторых серологических реактивов для распознавания индивидуумов, зараженных неодинаковыми группами или подтипами. Это относится, в частности, к ВИЧ-1 группы 0. В заявке WO 96/40763 утверждается существование больших различий внутри группы 0. В ней описываются пептиды, включающие в естественной последовательности ВИЧ-1 типа В, несколько незначительных модификаций (одна или две аминокислотные замены). Согласно данной заявке такие гибридные пептиды способны взаимодействовать с антителами к группе 0. В заявке WO 96/27013 описана серия новых вирусов ВИЧ-1 группы 0, обозначенных, как: BCF 01, BCF 02, BCF 03, BCF 06, BCF 07, BCF 08, BCF 09, BCF 11, BCF 12, BCF 13 и BCF 14, а также соответствующая серия пептидов доминантной области gр41, обозначенных, как ESS/BCF02, FAN/BCF01, LOB/BCF06, MAN/BCF07, NKO/BCF08, POC/BCF03, MAN/BCF11, BCF09, BCF12, BCF13 и BCF14. Некоторое число этих пептидов мало пригодно в диагностике вследствие их слабой растворимости, в частности пептид BCF 13. В настоящее время неожиданно было обнаружено, что некоторые синтетические пептиды являются высококачественными диагностическими реактивами, позволяющими достичь хороших результатов в выявлении больных, инфицированных ретровирусами ВИЧ-1 группы 0. Такие пептиды состоят из разных последовательностей, расположенных вокруг коротких, очень консервативных последовательностей, присутствующих в изолятах ретровирусов ВИЧ-1 группы 0. Пептиды согласно изобретению позволяют получать результаты, значительно превосходящие результаты, получаемые при использовании синтетических пептидов, несущих иммунодоминантные эпитопы др41 (env) некоторых изолятов ВИЧ-1 группы 0. Для обозначения аминокислот ниже применяется трехбуквенная номенклатура. Синтетические пептиды согласно изобретению соответствуют общей формуле (I): -Z-Trp Gly Cys--Cys Tyr Thr Ser-, (1)вкоторой означаетбиотинил,биоцитинил,атомводорода,ацетил(СН3СО-), алифатическую цепь, способную содержать одну или несколько тиоловых, альдегидных или аминных функций, при этом алифатическая цепь представляет собой преимущественно алкильную цепь с 1-6 атомами углерода или алкенильную цепь с 2-6 атомами углерода или аминоалкилкарбонильную цепь с 2-6 атомами углерода,Z означает последовательность пептидов одной из формул – 1-Ser-2-; (II)– 1-Gln-2-; (V)– 1-Asn-2-; (VIII)в которых 1 означает пептидную последовательность с 2-9 аминокислотами, 2 – пептидную последовательность с 0-5 аминокислотами, – пептидную последовательность формулы (XI)-(AA1)-(AA2)-(AA3)-(AA4)-(AA5)-, (XI) в которой (AA1) – остаток либо лизина, либо аргинина; (АА2) – остаток глицина; (АА3) – остаток либо лизина, либо аргинина; (АА4) – остаток либо лейцина, либо аланина; (АА5) – остаток валина при условии, что (AA1), (АА2), (АА3), (АА4), (АА5) никогда не образуют вместе пептидные последовательности -Lys Gly Lys Leu Ile- и -Lys Gly Lys Leu Val- , зафиксированная на группе -СО серина, означает гидроксил (-ОН), пептидную последовательность формулы (XII)-Val- –, (XII)в которой означает последовательность формулы (XIII)(AA6)-Trp Asn-(AA7-(AA8) (XIII), в которой (АА6) – глутамин или аргинин, (АА7) – глутамин или серин, (АА8) – треонин, и в которой , зафиксированная на остатке -СО- свободной аминокислоты АА8, означает группу ОН,пептидную последовательность формулы (XV) -Val- , (XV)в которой имеет указанное выше значение.
Пептиды формулы (I) относятся к мономерному типу и их размер может составлять от 13 до 33 аминокислот.
Пептиды согласно изобретению могут существовать либо в линейной форме, либо в циклической, образованной с помощью интерцистеиновых дисульфидных мостиков.
Предпочтительными являются пептиды формулы (I), в которой означает биотинил, атом водорода или алифатическую цепь, которая может содержать одну или две тиоловых, альдегидных или аминных функций, причем алифатическая цепь является предпочтительно алкильной цепью с 1-6 атомами углерода или аминоалкилкарбонильной цепью с 2-6 атомами углерода; Z – пептидную последовательность формулы (II) или (V), в которой 1 означает пептидную последовательность из двух аминокислот, 2 – аминокислоту или пептидную последовательность формулы (VIII), в которой 1 означает пептидную последовательность из девяти, восьми или трех аминокислот, а 2 – пептидную последовательность из пяти аминокислот; означает пептидную последовательность формулы -Lys Gly Arg Leu Val-; -Arg Gly Lys Ala Val-; -Arg Gly Arg Leu Val-; или -Arg Gly Arg Ala Val-; – гидроксильную группу, пептидную последовательность (XV) или одну из следующих последовательностей, соответствующих пептидной последовательности формулы (XII) -Val Arg Trp Asn Glu Thr-; -Val Gln Trp Asn Glu Thr- или -Val Gln Trp Asn Ser Thr-.Предпочтительно Z означает пептидную последовательность формулы -Leu Leu Ser Ser-; -Leu Leu Asn Ser-; -Leu Leu Gln Ser-; -Arg Leu Asn Ser-; -Ala Leu Glu Thr Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser- или -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu-; -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile-; -Leu Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser-; -Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser-. В состав изобретения входят также синтетические пептиды, содержащие 20-50 аминокислот и соответствующие формуле (Iа): -Za-Trp Gly Cys--Cys Tyr Thr Ser-a, (Ia)в которой Za – радикал формул 1a-Ser-2a; (IIa)1a-Gln-2a; (Va)1a-Asn-2a, (VIIIa)в которых 1a означает пептидную последовательность с 2-5 аминокислотами;2a – аминокислоту; a – пептидную последовательность формулы (XII), такую, как приведена для формулы (I); , , , имеют те же значения, что и в формуле (I).
Предпочтительными являются пептиды формулы (I) или (Iа), содержащие одну из следующих последовательностей. Последовательности приведены в соответствии с одно- или трехбуквенными номенклатурами.
Синтетические пептиды формулы (I), которые являются предметом настоящего изобретения, могут быть получены твердофазным синтезом с помощью традиционных методов: R.B.Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. (1963), 85, стр. 2149-2154; R. C. Sheppard, “Peptides 1971”, Nesvadba H. (ed.) North Holland, Amsterdam, стр. 111; E. Atherton and R.L.Sheppard, “Solid phase peptide synthesis, a practical approach”, IRL PRESS, 1989, Oxford University Press, стр. 25-34. В качестве автоматического синтезатора может использоваться синтезатор “9050 Plus Pep Synthesizer” Миллипора (Millipore) или аналогичный ему.
Твердая основа, применяемая при синтезах, должна быть совместимой с используемой техникой и химией. Так, например, для синтеза на синтезаторе “9050 Plus pep. Synthesizer” рекомендуется применять смолу, предназначенную для так называемой технологии “непрерывного потока”; таким критериям отвечают смолы PEG PS. Указанные основы состоят из спейсера на основе полиэтиленгликоля (PEG), расположенного между функциональной группой из полистероловых шариков и точкой закрепления первой аминокислоты. Тип такой точки фиксации может варьироваться в зависимости от выбранной С-терминальной функции. В данном случае применяются различные смолы PEG-PS.
Исходная смола и применяемые в качестве сырья аминокислоты имеются в продаже (PerSeptive-Biosystem или Neosystem).
При синтезе пептидов применяли следующие защитные группы боковых цепей (см. табл. А).
Временная защита первичной аминной функции в положении  применяемых аминокислот обеспечивается группой 9-фторэнилметилоксикарбонил (Fmoc). Удаление защитных групп осуществляется посредством 20%-го раствора пиперидина в диметилформамиде.
Для связи предпочтительно применяется избыточное количество диизопропилкарбодиимида (DIPCDI) и гидрокси-1-бензотриазола (HOBt).
По окончании синтеза смолу промывают органическими растворителями (диметилформамидом, затем дихлорметаном), сушат в вакууме, затем обрабатывают раствором на основе трифторуксусной кислоты (TFA), охлажденным до 0oС и содержащим соответствующие “очистители” (scavengers). Можно применять, например, реактив К с содержанием 82% трифторуксусной кислоты, 5% фенола, 5% воды, 5% тиоанизола и 3% этандитиола.
После фильтрования смолы пептиды выпадают в осадок и промываются простым эфиром.
После этого искусственные пептиды очищают с помощью жидкостной хроматографии с обратной фазой и определяют их чистоту масс-спектрометрией.
В качестве твердой фазы можно использовать, например, фазу Бондапака (Bondapak) C-18. Пептиды элюируют с применением линейного градиента между двумя буферными растворами, из которых первый раствор преимущественно водный (например, “вода – 0,1%-ая трифторуксусная кислота”), а второй раствор скорее органический (например, смесь, содержащая 60% ацетонитрила, 39,92% воды и 0,08% трифторуксусной кислоты). Полученные чистые фракции объединяют, концентрируют в условиях вакуума и лиофилизуют.
При циклизации искусственные очищенные пептиды растворяют в растворе ацетата аммония (10 мМ). Показатель рН доводят до 8,5 добавкой гидроксида аммония 1 М. Раствор интенсивно перемешивают. Полная циклизация наступает через 18 часов. После этого показатель рН снижают до 6 добавлением уксусной кислоты. Циклизованные пептиды лиофилизуют, затем очищают с помощью жидкостной хроматографии с обратной фазой, как описано выше.
Иммунореактивность пептидов согласно изобретению оценивали с помощью сывороток больных, которые в большинстве своем происходили из Камеруна и были инфицированы ретровирусом ВИЧ-1 группы 0. Проведенные тесты подтвердили, что пептиды согласно изобретению, взятые отдельно или в комбинации (пептидные композиции), позволяют выявить 100% сывороток, инфицированных ретровирусом ВИЧ-1 группы 0.
Синтетические пептиды согласно изобретению могут, следовательно, найти применение при проведении иммунологических тестов для обнаружения инфекций, вызванных ретровирусом ВИЧ-1 группы 0. Возможно также применять комбинации из нескольких синтетических пептидов формулы I. Такие комбинации, в которых могут содержаться два и более пептида формулы I, также входят в состав изобретения. Предпочтительными комбинациями являются те, в которых содержатся пептиды 1 (2В) и 3 (4В).
Также возможно использовать синтетические пептиды формулы (I) согласно настоящему изобретению в сочетании с рекомбинантными пептидами (рекомбинантные протеины) ВИЧ-1 группы 0, такими, которые могут быть получены традиционными методами и которые содержат последовательности, описанные, например, в заявке на европейский патент 0591914. Такие композиции также являются составной частью настоящего изобретения.
Синтетические пептиды согласно изобретению могут применяться, кроме того, в сочетании с другими синтетическими или рекомбинантными пептидами ВИЧ-1 (рекомбинантные протеины) и/или ВИЧ-2, такими, как пептиды, описанные в патентных заявках или в европейских патентах 0387914, 0239425, 0220273, 0267802. Этот перечень патентных заявок и патентов не является исчерпывающим и приводится в качестве примера.
Композиции, содержащие один или несколько синтетических пептидов формулы (I), а также один или несколько синтетических или рекомбинантных пептидов ВИЧ-1 или ВИЧ-2 находят свое применение в диагностике при обнаружении больных, инфицированных ретровирусом ВИЧ. Такие композиции также входят в состав настоящего изобретения.
Способы иммунного дозирования с применением одного или нескольких синтетических пептидов формулы (I), используемых отдельно или в сочетании с рекомбинантными пептидами ВИЧ-1 группы 0, или синтетическими или рекомбинантными пептидами ВИЧ-1 или ВИЧ-2 также относятся к изобретению.
Целью изобретения являются кроме того наборы, предназначенные для использования при иммунодозировании и содержащие пептид формулы (I) или композицию, содержащую по меньшей мере один пептид формулы (I).
Приводимые ниже примеры иллюстрируют изобретение и не являются ограничительными.
ПРИМЕР 1:Получение соединения согласно изобретению; пептид 2 (3В) LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET или  Данный пептид был синтезирован в твердой фазе. Технология, разработанная в 1963 году Меррифельдом (Merrifield) (J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, стр. 2149-2154), состоит в фиксации первой аминокислоты на полимерной (выполненной из смолы) твердой основе посредством ее кислотной функции и в удлинении пептидной последовательности, начиная с указанной первой аминокислоты, при этом в процессе синтеза пептид сохраняется зафиксированным на смоле. При синтезе пептида 2 использовали синтезатор “9050 Plus Pep ithesizer” и смолу Fmoc Thr (OtBu) PEG PS. В таблице I указаны различные этапы синтеза. По окончании синтеза смолу промывали диметилформамидом, затем хлорметаном и сушили в вакууме. После этого смолу обрабатывали реактивом к (82% трифторуксусной кислоты, 5% фенола, 5% воды, 5% тиоанизола, 3% этандитиола). Пептид 2 (3В), выделенный осаждением окисью диэтила, промывали тем же растворителем. Таким образом было получено 140 мг пептида 2 (3В). После этого пептид 2 (3В) очистили с помощью жидкостной хроматографии с обратной фазой. В качестве твердой фазы применяли фазу Бондапака (Bondapak) C-18. Пептид элюировали, применяя линейный градиент между двумя буферными растворами, из которых первый раствор был в основном водным (например, вода-трифторуксусная кислота 0,1%), второй скорее органическим (например, смесь, содержащая 60% ацетонитрила, 39,92% воды и 0,08% трифторуксусной кислоты). Собранные чистые фракции объединяли, концентрировали в вакууме и лиофилизовали. При циклизации полученный очищенный искусственный пептид растворили в растворе ацетата аммония (10 мМ). Показатель рН довели до 8,5 добавлением гидроксида аммония 1 М. Раствор интенсивно перемешали. Полная циклизация завершилась через 18 часов. Показатель рН снизили после этого до 6 добавлением уксусной кислоты. Циклизованный пептид лиофилизовали, затем очищали с помощью жидкостной хроматографии с обратной фазой, как описано выше. Получение соединения согласно изобретению “пептид 15 (22В)” Этот пептид синтезировали подобно пептиду 2 (3В), но в качестве смолы использовали смолу FmocPAL PEG-PS. В приводимой ниже таблице II указаны различные этапы синтеза. По окончании синтеза смолу промывали диметилформамидом, затем дихлорметаном и сушили в вакууме. После этого смолу обрабатывали реактивом К (82% трифторуксусной кислоты, 5% фенола, 5% воды, 5% тиоанизола, 3% этандитиола). Пептид 7 (22В), выделенный осаждением окисью диэтила, промывали тем же растворителем. Таким образом было получено 140 мг пептида 15 (22В). После этого пептид 15 (22В) очистили жидкостной хроматографией с обратной фазой, циклизовали, лиофилизовали и очищали, как описано выше, для пептида 2 (3В). Аналогичным образом синтезировали другие соединения согласно изобретению с использованием смол и соответствующих аминокислот. В таблице III указан молекулярный вес некоторых пептидов формулы (I) в нециклизованном виде, который определяли масс-спектрометрией. ПРИМЕР 2: Определение иммунореактивности пептидов согласно изобретению с помощью иммунно-ферментативного теста. Тест 1 Применявшиеся сыворотки ESS, DUR, VAU и HAD были получены от больных французской национальности, инфицированных ретровирусами ВИЧ-1 группы 0. Другие сывороточные пробы, взятые у больных, инфицированных ретровирусами ВИЧ-1 группы 0, были получены Институтом Пастера из Яунде, Камерун, и серотипизированы как группа 0 в соответствии с серологическим алгоритмом, описанным в AIDS, 1977 г., 77, стр. 445-453. ВИЧ-отрицательные сыворотки (ВИЧ) (n=48) были получены от здоровых доноров. Применявшиеся синтетические пептиды растворяли в воде в концентрации 1 мг/мл (маточный раствор). На этапе сенсибилизации твердой фазы (coating) 110 мкл раствора с содержанием 2 мкг/мл каждого пептида (получен разбавлением маточного раствора карбонатным буферным раствором 0,1 М) добавляли в каждую лунку плашек для микротитрования MicrotiterTM (NUNC). После инкубации в течение ночи при комнатной температуре микроплашки сначала промывали буферным раствором Tris NaCl, рН 7,4, с содержанием 0,1% Tween  20 и 0,001% мертиолата натрия, затем насыщали раствором PBS с содержанием 0,5% RegilaitTM (порошок обезжиренного молока). После отсоса раствора насыщения плашки нагревали при 50oС в течение 10 минут.
Сывороточные пробы разводили в пропорции 1/5 раствором обезжиренного молока (цитратный буфер с добавкой 0,01% фенолового красного, 0,25% хлороформа и 0,25% Kathon), помещали в лунки плашек и инкубировали в течение 30 минут при 40oС.
После промывки буферным раствором Tris NaCl, pH 7,4, содержавшим 0,1% Tween 20 и 0,001% мертиолата натрия 100 мкл раствора коньюгата антител козы anti IgG и IgM человека, меченных пероксидазой хрена, с содержанием в качестве консерванта 0,01% мертиолата натрия в виде раствора в буферном цитратном растворе с добавкой 30% глицерола и 25% нормальной сыворотки эмбриона теленка добавляли в каждую лунку плашки, после чего последние инкубировали в течение 30 минут при 40oC.
После промывки буфером Tris NaCl, pH 7,4, с содержанием 0,1% Tween 20 и 0,001% мертиолата натрия окраску получали добавкой в каждую лунку 100 мкл 0-фенилендиамина в виде раствора в перекиси водорода. Затем микроплашки инкубировали в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре. После этого прерывали реакцию окрашивания добавкой 100 мкл серной кислоты 4N. Удельное поглощение (А) определялось при 490 и 620 нм.
Относительное удельное поглощение (А490-А620), считываемое в каждой лунке, пропорционально иммунореактивности каждого пептида. Это указывает на способность каждого пептида вступать в реакцию с биологической пробой, используемой в тесте. Пороговая величина (cut-off) удельного поглощения была определена равной 0,15. Она соответствует средней величине отрицательных значений (n=48) плюс 12 типовых отклонений. Реакционную способность пептидов согласно изобретению (пептид 3 (4В), пептид 2 (3В) и пептид 1 (2В), все в циклизованном виде) сравнивали с реакционной способностью двух синтетических пептидов, последовательность которых является частью натуральной последовательности оболочки изолята VAU (ретровирус ВИЧ-1 группы 0) и которые содержат иммунодоминантный эпитоп gр41.
Эти оба пептида имеют последовательность, А (см. в конце описания).
При исследовании пептиды применялись в циклизованном виде. Результаты этого исследования приведены в таблице IV.
Результаты таблицы IV свидетельствуют о том, что пептид 3 (4В) обладает более эффективными свойствами по сравнению с другими пептидами. Этот пептид позволяет более эффективно обнаруживать сыворотки больных, инфицированных ретровирусом ВИЧ-1 группы 0, по сравнению с двумя пептидами, содержащими частично последовательность изолята VAU, соответствующего иммунодоминантному эпитопу gр41. В частности пептиды 2 (3В) и 1 (2В) согласно изобретению обладают более выраженной иммунной реактивностью, чем пептид VAU 22 АА, содержащий такое же число аминокислот.
ПРИМЕР 3:Оценка иммунореактивности пептидов согласно изобретению с помощью иммунно-ферментативного теста. Тест 2 Сывороточные пробы больных, инфицированных ретровирусом ВИЧ-1 группы 0, были получены Институтом Пастера из Яунде, Камерун, серотипизированы как группа 0 по серологическому алгоритму, описанному в AIDS, 1977 г., 11, стр. 445-453. Одна генотипическая проба (Maryland) поступила из США. Указанные пробы предварительно разбавили в отрицательной человеческой сыворотке до разведении, приведенных в таблице V, с тем, чтобы располагать достаточным объемом при проведении различных тестов на иммунореактивность. Используемые синтетические пептиды растворили в воде в концентрации 1 мг/мл (маточный раствор). На этапе сенсибилизации твердой фазы (coating) поступали, как описано в примере 2. Сывороточные пробы разбавили в пропорции 1/5 раствором обезжиренного молока (в нитратном буфере с добавкой фенолового красного 0,01%, хлороформа 0,25% и Kathon 0,25%), поместили в лунки плашек и инкубировали в течение 30 минут при 40oС.
После промывки буфером Tris NaCl, pH 7,4, с содержанием 0,1% Tween и 0,001% мертиолата натрия 100 мкл раствора конъюгата антител козы антиIgG и человеческих IgM, меченых пероксидазой хрена, содержащего в качестве консерванта мертиолат натрия (0,01%) в виде раствора в цитратном буферном растворе с добавкой глицерина (30%) и нормальной эмбриональной телячьей сыворотки (25%), добавили в каждую лунку, после чего плашки инкубировали в течение 30 минут при 40oC.
После промывки буфером Tris NaCl, pH 7,4, с содержанием 0,1% Tween 20 и 0,001%, мертиолата натрия окраску проявляли, как описано в примере 2.
Удельное относительное поглощение (DO)(А490-А620), считанное в каждой лунке, пропорционально иммунореактивности каждого пептида. Это указывает на способность каждого пептида вступать в реакцию с биологической пробой, используемой в тесте.
Реакционную способность пептидов согласно изобретению (пептиды 10 (14В), 11 (18В), 12 (19В), 14 (21В), 15 (22В), 16 (23В), все в циклизованном виде, сравнивали с реакционной способностью трех гомологичных синтетических пептидов, последовательность которых является частью натуральной последовательности оболочки ретровируса ВИЧ-1 группы 0. Этими пептидами явились два пептида, производных изолята VAU: пептид VAU 22 АА и пептид MVP 5180 (в таблице V обозначен, как “MVP 5180”). Пептиды VAU 22 АА и VAU 35 АА (их структура приведена в примере 2), а также пептид MVP 5180 содержат иммунодоминантный эпитоп gр41.
Все эти пептиды применялись в циклизованном виде. Последовательность пептида MVP 5180 имеет следующий вид (см. в конце описания).
Результаты данного исследования приведены в таблице V.
Для каждого тестируемого пептида пробы были разбиты на четыре класса (а, b, с, d), которые соответствуют разным уровням относительного удельного хюглощения, считываемого при длине волны А492-А620:для a: DO<0,100, для b: 0,100 что позволило определить степень иммунной реактивности пептидов. Наиболее иммуннореактивными пептидами оказались те, для которых наибольшее количество проб отнесено к классам, соответствующим наиболее высоким показателям удельного поглощения. Результаты приведены в таблице VI. Результаты свидетельствуют о том, что все тестированные пептиды согласно изобретению обладают более высокой иммунной реакционной способностью, чем эталонные пептиды из уровня техники, происходящие из естественных иэолятов (MVP 5180, VAU). Пептиды 15 (22В), 14 (21В) и 16 (23В) согласно изобретению оказались наиболее иммуннореактивными. ПРИМЕР 4: Оценка иммунореактивности композиций, содержащих пептиды согласно изобретению, посредством иммунно-ферментативного теста При этом исследовании поступали в соответствии с протоколом, описанным в примере 2, причем применялись одни и те же сыворотки. Применявшиеся микроплашки сенсибилизировали либо циклизованным пептидом 1 (2В), либо циклизованным пептидом 3 (4В), либо композицией, содержащей оба этих пептида (1:1 в отношении частей). В каждую из лунок помещали либо 100 мкл раствора с содержанием 2 мкг/мл пептида 1 (2В), либо 100 мкл раствора с содержанием 2 мкг/мл пептида 3 (4В), либо 100 мкл раствора с содержанием 1 мкг/мл пептида 1 (2В) и 1 мкг/мл пептида 3 (4В). Результаты исследования приведены в таблице VII. Приведенные в таблице VII результаты показывают, что композиции из пептидов согласно изобретению в случае их применения в диагностике позволяют обнаружить все сыворотки больных, инфицированных ретровирусами ВИЧ-1 группы 0. Формула изобретения
-Z-Trp Gly Cys--Cys Try Thr Ser-, (I)в которой означает биотинил, биоцитинил, атом водорода, ацетил (СН3СO-), алифатическую цепь, которая может содержать одну или несколько тиоловых, альдегидных или аминных функций, при этом алифатическая цепь представляет собой преимущественно алкильную цепь с 1-6 атомами углерода, или алкенильную цепь с 2-6 атомами углерода, или аминоалкилкарбонильную цепь с 2-6 атомами углерода;Z – последовательность пептидов одной из формул: – 1-Ser-2-; (II)– 1-Gln-2-; (V)– 1-Asn-2-; (VIII)в которых 1 означает пептидную последовательность с 2-9 аминокислотами, 2 – пептидную последовательность с 0-5 аминокислотами, – пептидную последовательность формулы (ХI)-(АА1)-(АА2)-(АА3)-(АА4)-(АА5)-, (ХI) в которой (АА1) – остаток либо лизина, либо аргинина, (АА2) – остаток глицина, (АА3) – остаток либо лизина, либо аргинина, (АА4) – остаток либо лейцина, либо аланина, (АА5) – остаток валина при условии, что (АА1), (АА2), (АА3), (АА4), (АА5) никогда не образуют вместе пептидные последовательности -Lys Gly Lys Leu Ile- и -Lys Gly Lys Leu Val- , зафиксированная на группе -СО серина, означает гидроксил (-ОН), пептидную последовательность формулы (ХII)-Val- –, (XII)в которой – последовательность формулы (ХIII)-(АА6)-Trp-Asn-(АА7)-(АА8), (ХIII) в которой (АА6) – глутамин или аргинин, (АА7) – глутамин или серин, (АА8) – треонин и в которой , зафиксированная на остатке -СО- свободной аминокислоты АА8, означает группу ОН,пептидную последовательность формулы (ХV) -Val- , (XV)в которой имеет указанное выше значение.
2. Синтетические пептиды формулы (I) по п. 1, в которой (АА4) в значении означает остаток лейцина.
3. Синтетические пептиды формулы (I) по п. 1, в которой означает биотинил, атом водорода или алифатическую цепь, которая может содержать одну или две тиоловых, альдегидных или аминных функций, причем алифатическая цепь является предпочтительно алкильной цепью с 1-6 атомами углерода или аминоалкилкарбонильной цепью с 2-6 атомами углерода; Z – пептидную последовательность формулы (II) или (V), в которой 1 – пептидная последовательность из двух аминокислот, 2 – аминокислота или пептидная последовательность формулы (VIII), в которой 1 означает пептидную последовательность из девяти, восьми или трех аминокислот, а 2 означает пептидную последовательность из пяти аминокислот; – пептидная последовательность формул -Lys Gly Arg Leu Val-, -Arg Gly Lys Ala Val-, -Arg Gly Arg Leu Val- или -Arg Gly Arg Ala Val- и означает гидроксильную группу, пептидную последовательность (ХV) или одну из следующих последовательностей, соответствующих пептидной последовательности формулы (ХII):  4. Синтетические пептиды формулы (I) по одному из пп. 1-3, в которой Z означает пептидную последовательность формул -Leu Leu Ser Ser-; -Leu Leu Asn Ser-; -Leu Leu Gln Ser-; -Arg Leu Asn Ser-; -Ala Leu Glu Thr Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser-; -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu-; -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile-; -Leu Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser- или -Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser-. 5. Синтетические пептиды по п. 1, содержащие 20-50 аминокислот формулы (Iа) -Za-Trp Gly Cys--Cys Tyr Thr Ser-a (Ia)в которой Zа – радикал формул 1a-Ser-2a; (IIa)1a-Gln-2a; (Va)1a-Asn-2a, (VIIIa)в которых 1a – пептидная последовательность из 2-5 аминокислот, 2a – аминокислота, a – пептидная последовательность формулы (ХII), такая, как приведена для формулы (I),, , , имеют те же значения, что и в формуле (I).
6. Синтетические пептиды формулы (I) по одному из пп. 1-5, содержащие одну из следующих последовательностей (см. графическую часть).
7. Синтетические пептиды по одному из пп. 1-6, имеющие следующую последовательность (см. графическую часть).
8. Композиция для обнаружения инфекции, вызванной ВИЧ-1 группы 0, содержащая один или несколько синтетических пептидов формулы (I) по одному из пп. 1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.
9. Композиция по п. 8, содержащая пептид 3 (4В) и пептид 1 (2В).
10. Композиция, содержащая один или несколько синтетических пептидов формулы (I) по п. 1, а также содержащая один или несколько рекомбинантных пептидов ВИЧ-1 группы 0.
11. Композиция, содержащая один или несколько синтетических пептидов формулы (I) по п. 1, а также содержащая один или несколько синтетических или рекомбинантных пептидов ВИЧ-1 и/или ВИЧ-2.
12. Способ диагностики инфекций, вызванных ВИЧ-1 группы 0, отличающийся тем, что используют один или несколько синтетических пептидов формулы (I) по одному из пп. 1-7.
13. Способ диагностики инфекций, вызванных ВИЧ-1 группы 0, отличающийся тем, что используют композицию по одному из пп. 8-11.
14. Диагностический набор, содержащий по меньшей мере один синтетический пептид формулы (I) по одному из пп. 1-7 или композицию по одному из пп. 8-11 и подходящий твердый носитель.
Приоритет по признакам:09.04.1997 – пептиды 2В: 3В: 4В, 5В, 6В, N6 и N7; 24.02.1998 – пептиды 12В, 14В, 18В, 19В, 20В, 21В, 22В, 23В. РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||
