Патент на изобретение №2183970

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АЛЛЕРГЕНОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии, и касается получения бактериальных аллергенов. Сущностью изобретения является получение бактериальных аллергенов из микробных клеток и их метаболитов, полученных из высокоаллергенных штаммов условно патогенных микроорганизмов, выделенных со слизистой дыхательного тракта больных бронхиальной астмой. Техническим результатом является получение аллергена для специфической аллергологической диагностики инфекционно-аллергических заболеваний дыхательных путей.

Изобретение относится к области медицины, а именно аллергологии, и касается получения бактериальных аллергенов.

Известен способ получения бактериальных аллергенов, например, мелиоидозного аллергена, характеризующийся тем, что бактериальную массу культивируют на плотной питательной среде, затем инактивируют ацетоном в соотношении 1:3 при 20-30^oС в течение суток, полученный препарат дезинтегрируют ультразвуком мощностью 75-100 Вт, частотой 18-22 кГц 25-30 мин, центрифугируют при 1000010 g 25-30 мин и высаливают сульфатом аммония при 400,5% насыщения (патент RU 1621229, 1988 г., А 61 К 39/02).

Задачей настоящего изобретения является получение аллергена для специфической аллергологической диагностики и терапии инфекционно-аллергических заболеваний дыхательных путей.

Для решения поставленной задачи используют аллерген, представляющий собой взвесь микробных клеток и их метаболитов, полученную из высокоаллергенных штаммов условно-патогенных микроорганизмов, выделенных со слизистых дыхательного тракта больных бронхиальной астмой.

Выращивание культуры ведут на целлофановых дисках на питательной среде, включающей 1% глюкозы и 7% дефибринированной кроличьей крови при 37^oС с концентрацией взвеси 10 млрд. микробных тел/мл, далее микробную взвесь смывают физраствором с 0,3% фенола при рН 7,0-7,2, инактивируют при 37^oС в течение 18-20 ч и последовательно разводят сначала физраствором с 0,4% фенола до концентрации 1 млрд. микробных клеток в 1 мл, а затем разводящей жидкостью до концентрации 300-500 млн. микробных клеток в 1 мл.

Конкретные примеры осуществления способа.

Пример 1.

Способ получения аллергена Neisseria perflava.

Для получения аллергена используют штаммы 57 и 11, характеризующиеся следующими признаками:
а) морфологические и тинкториальные свойства – грамотрицательные диплококки, 0,6-0,8 мкм в диаметре;
б) культуральные биохимические свойства – на плотных средах с добавлением 5-7% кроличьих эритроцитов при 371^oС дает рост в виде мелких, округлых, блестящих, полупрозрачных, слегка беловатых (желтоватых) колоний слизистой консистенции. Колонии на агаре с декстрозой мелкие, круглые, слегка возвышенные. Кислота – на декстрозе, мальтозе, левулезе, сахарозе. Оптимум температуры 37^oС;
в) вирулентные и токсикогенные свойства – не токсикогенен, вирулентность – 1) вызывает вульвовагиниты; 2) свежевыделенные штаммы имеют пили и паразитируют на клетках слизистых дыхательного тракта и вагины.

Для изготовления аллергена Нейссерии перфлава используют производственные штаммы Нейссерии перфлава 57, 11, депонированные в коллекции музея живых культур ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Для изготовления аллергена используют микробные суспензии. Для этого сухие лиофильные штаммы засевают на скошенном мясопептонном агаре с 7% дефибринированной стерильной кроличьей крови. Мясопептонный агар, содержащий 1% глюкозы, необходимо растопить в водяной бане, охладить до 56^oС и в стерильных условиях добавить 7 мл дефибринированной кроличьей крови. Полученную смесь разливают в стерильные пробирки и помещают в специальные штативы для получения скошенного агара, подсушивают и ставят в термостат на 18-20 ч при 37^oС. В работе используют только культуры, прошедшие контроль на стерильность.

Контроль лиофильной культуры Нейссерия перфлава осуществляется путем внесения в ампулу 1 мл физиологического раствора и посева на скошенный агар, после чего пробирка помещается в термостат при 37^oС на 18-20 ч.

Определение чистоты посевного материала проводят под микроскопом ММБ-1: в предварительно отобранные пробирки со скошенным агаром вносят культуру со всех посевов, подсушивают и окрашивают по Граму. Чистые культуры смывают с агара 0,5 мл физиологического раствора. Концентрацию взвеси доводят физиологическим раствором до 10 млрд. клеток.

Получение маточной микробной взвеси.

Стеклянная посуда, используемая в работе, стерилизуется в сухо-жарочном шкафу при 18^oС в 1 ч, целлофановые диски стерилизуют в течение трех дней в автоклаве текучим паром по 30 мин.

Для производственного посева используется питательная среда, состоящая из мясопептонного агара, содержащего 1% глюкозы и 7% дефибринированной кроличьей крови. Питательную среду разливают в чашки Петри таким образом, чтобы слой агара был равен 10 мм, после чего чашки помещают в термостат на сутки при 37^oС. На поверхность агаровой пластинки в каждую чашку укладывают целлофановый диск, диаметр которого должен быть на 10 мм больше диаметра используемых в работе чашек Петри. Подготовленный диск прижимают пинцетом к краям чашки для образования целлофанового бортика высотой до 1 см.

Засевают 18-20-часовую маточную микробную смесь. Плотность посева – 0,1 мл микробной взвеси (с концентрацией 10 млрд. микр. тел/мл) на одну чашку Петри. Нанесенную на целлофан культуру микроба стерильным стеклянным шпателем равномерно распределяют по поверхности целлофана.

Чашки с посевным материалом помещают в термостат ЗЦ-1125М на 18-20 ч при температуре 37^oС. В течение срока выращивания посевов термостат не открывают для предотвращения загрязнения посевов.

По истечении срока инкубации чашки с посевами извлекают из термостата, изучают рост макро- и микроскопически. Чашки с неоднородным ростом бракуют.

Смыв культуры с целлофана производят следующим образом: в чашку Петри наливают 1-2 мл физиологического раствора, содержание – 0,009 г в 1 мл готового препарата с 0,3% фенола и дистиллированную воду и при помощи стерильного шпателя смывают культуру. Жидкость для смыва культуры должна иметь рН 7,0-7,2. Чашку Петри при смыве слегка наклоняют и полученную микробную взвесь переносят пипеткой в стерильный флакон. Проверяют чистоту полученной маточной микробной взвеси путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. Бактериоскопически чистые маточные взвеси сливают в один сосуд и определяют концентрацию по стандарту мутности.

После определения микробного стандарта, маточную микробную смесь разводят физиологическим раствором с 0,4% фенола, рН 7,0-7,2 до концентрации в 1 мл 10 млрд. микробных клеток.

Сосуд с маточной взвесью в физиологическом растворе помещают для инактивации в термостат при температуре 37^oС на 18-20 ч. В течение периода инактивации маточную взвесь периодически встряхивают.

Маточную микробную взвесь разводят физиологическим раствором с 0,4% фенола, рН 7,0-7,2, до концентрации 1 млрд. микробных клеток в 1 мл и сохраняют в холодильнике при температуре от 4 до 8^oС.

Разведение маточного аллергена проводят в боксе в асептических условиях с применением стерильной приточной вентиляции стерильной разводящей жидкостью до концентрации 400100 млн. микробных клеток в 1 мл. По окончании разведения содержимое бутыли тщательно перемешивают. Разводящая жидкость представляет собой физиологический раствор с 0,4% фенола. Используется для разведения аллергена при проведении специфической гипосенсибилизирующей иммунотерапии и при постановке кожных проб в качестве тест-контрольной жидкости. Жидкость прозрачная, бесцветная.

Получение нативного аллергена Staphylococci aureus.

Нативный аллерген Staphylococci aureus представляет собой взвесь микробных клеток и продуктов их метаболизма в физиологическом растворе с фенолом. Для изготовления препаратов используют штаммы Волкова и Буганова, выделенные со слизистой бронхов больных инфекционно-аллергической бронхиальной астмой.

Нативные аллергены Staphylococci aureus – мутная гомогенная жидкость беловатого или слегка желтоватого цвета. Препарат стерилен, безвреден при подкожном введении белым мышам, специфически активен и имеет рН 7,0-7,4.

Готовый препарат содержит 1 млрд. микробных клеток в 1 мл.

Нативные аллергены Staphylococci aureus предназначены для выявления сенсибилизации к белому стафилококку и проведения специфической гипосенсибилизирующей терапии больным, страдающим заболеваниями инфекционно-аллергической природы.

Производственные штаммы выделены со слизистой бронхов при бронхоскопии больных инфекционно-аллергической бронхиальной астмой. Для изготовления нативного аллергена Staphylococci aureus используют штаммы Волкова и Буганова. Штаммы типичны по морфологическим и культуральным особенностям для стафилококковой группы микробов.

Вся работа по выращиванию культур проводится на мясопептонном агаре с добавлением 7% дефибринированной кроличьей крови. Среду разливают в чашки Петри так, чтобы слой агара был равен 10 мм. После разлива чашки с кровяным агаром помещают в термостат и выдерживают сутки при температуре 37^oС. Убедившись в стерильности питательной среды, проводят подготовку чашек для посевов. Для этого с помощью двух стерильных пинцетов на поверхность кровяного агара накладывают стерильный целлофановый диск, чтобы по краю чашки образовался невысокий бортик из целлофана. Последний необходим для того, чтобы при смыве культуры с поверхности диска жидкость не попадала на питательную среду. Целлофан, помещенный на кровяной агар, увлажняют небольшим количеством физиологического раствора и тщательно разглаживают поверхность диска при помощи стеклянного шпателя, чтобы не допустить образования воздушной прослойки между питательной средой и целлофановым диском. Подготовленные таким образом чашки Петри помещают в термостат на 18-20 ч для проверки стерильности целлофана.

Маточные культуры Staphylococci aureus Волкова, Буганова отливают на скошенный мясопептонный агар с 7% дефибринированной кроличьей крови /МПКА/ и через 18-20 ч выращивания при 37^oС из каждой пробирки готовят мазки, окрашивают по Граму и просматривают под микроскопом для определения чистоты посевного материала.

Чистые культуры смывают с косого агара 0,5 мл физиологического раствора. Концентрацию взвеси физиологическим раствором доводят до 10 млрд. клеток/мл по стандарту мутности. Далее производят посев культур на питательные среды, покрытые целлофановыми дисками.

Каждый штамм микробов высевают из расчета на 1 чашку Петри 0,1 мл микробной взвеси (концентрация 10 млрд. клеток/мл).

Нанесенную на целлофан культуру микроба стерильным стеклянным шпателем равномерно распределяют по поверхности целлофана. Чашки с посевами помещают в термостат в течение 18-20 ч при температуре 37^oС.

Через 20 ч с выросших на целлофане культур готовят мазки и окрашивают по Граму. Биологически чистую культуру смывают с поверхности целлофанового диска 2-3 мл физиологического раствора, содержащего 0,2-0,3% фенола (карболовой кислоты). Количество карболовой кислоты, добавляемой к физиологическому раствору, определяется концентрацией “смыва”. “Смыв” культуры с целлофана физиологическим раствором с фенолом представляет собой маточную взвесь аллергена.

Далее проводят определение концентрации маточной взвеси по бактериологическому стандарту мутности. Взвесь микробных тел в физиологическом растворе с фенолом выдерживают в термостате при температуре 37^oС в течение 36-72 ч.

При наличии полной стерильности маточной взвеси аллергена производят разведение аллергена до концентрации 1 млрд. клеток/мл. При этом исходят из концентрации, определенной непосредственно после смыва микробных тел с целлофанового диска. Разведение маточной взвеси производят физиологическим раствором без добавления консерванта. Это позволяет получить нативный аллерген в концентрации 1 млрд. клеток/мл с минимальным содержанием фенола в препарате.

Допустимая конечная концентрация консерванта в препарате – 0,04% от общего объема.

После разведения маточной взвеси аллергена до концентрации 1 млрд. клеток/мл проводят контроль препарата по:
1) физическим свойствам;
2) чистоте;
3) стерильности;
4) безвредности.

Нативный бактериальный аллерген Staphylococci aureus используют для проведения специфической гипосенсибилизирующей терапии больным инфекционно-аллергической бронхиальной астмой.

Для проведения лечения готовят смесь аллергенов из числа тех, на которые у больного были получены положительные кожно-аллергические и провокационные тесты. При этом аллергены в равных количествах в концентрации 1 млрд. клеток/мл смешивают во флаконе.

Для получения десятикратных разведении смеси используют контрольную жидкость, которая в данном случае может служить в качестве разводящей жидкости. Для разведения аллергена берут 4 флакона с контрольной жидкостью, в каждом из которых содержится по 1,8 мл указанной жидкости. В первый флакон вносят 0,2 мл составленной для лечения смеси аллергенов в концентрации 1 млрд. клеток/мл. Таким образом, исходная смесь разведена в 10 раз и концентрация аллергена при этом будет равна 100 млн. клеток/мл, 0,2 мл разведенного аллергена переносят в следующий флакон с контрольной жидкостью и получают аллерген в концентрации 10 млн. клеток/мл. Таким образом, получают последующие разведения: 1 млн. клеток/мл и 100000 млн. клеток/мл. С последнего разведения обычно начинают лечение.

При тяжелом течении болезни и резко выраженной кожной чувствительности, особенно с синдромными реакциями, безопаснее начинать лечение с разведения 10000 микробных клеток в 1 мл.

Бактериальные аллергены, полученные предложенным способом, предназначены для специфической аллергологической диагностики инфекционно-аллергических заболеваний дыхательных путей.

Формула изобретения

Способ получения бактериальных аллергенов, включающий выращивание культуры на плотной питательной среде с последующим ее инактивированием и отделением целевого продукта, отличающийся тем, что культивируют микробные клетки, полученные из высокоаллергенных штаммов условно патогенных микроорганизмов, выделенных со слизистой дыхательного тракта больных бронхиальной астмой, при этом выращивание культуры ведут на питательной среде, содержащей 1% глюкозы и 7% дефибринированной кроличьей крови на целлофановых дисках и концентрацией взвеси 10 млрд микробных тел/мл, далее культуру смывают физраствором с 0,3% фенолом при pH 7,0-7,2, инактивируют при 37^oС в течение 18-20 ч, микробную взвесь последовательно разводят физраствором с 0,4% фенола до концентрации 1 млрд микробных клеток/мл, а затем разводящей жидкостью до концентрации 300-500 млн микробных клеток в 1 мл.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 01.02.2008

Извещение опубликовано: 10.11.2009 БИ: 31/2009