Патент на изобретение №2183935

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ “МИЛКАНГ” И ПОЛУЧЕННАЯ ЭТИМ СПОСОБОМ БАД “МИЛКАНГ”

(57) Реферат:

Изобретение относится к молочной, биотехнологической, медицинской и фармацевтической промышленности, а именно к способам получения биологически активных веществ, которые могут использоваться в качестве биологически активных добавок (БАД). Способ включает очистку сырья центрифугированием, сорбцию белков на ионообменнике, хроматографическое их разделение, элюирование, определение фракции с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед., диализ и стабилизацию. В качестве сырья используют нативные низкомолекулярные катионные белковые вещества молочного происхождения. Хроматографическое разделение проводят на СМ-целлюлозе, а диализ – против физиологического раствора, при этом стабилизацию осуществляют микрофильтрацией через полупроницаемые мембраны с селективностью более 50 кДа. Полученную БАД фасуют. Перед фасовкой БАД подвергают сушке. В качестве нативных низкомолекулярных катионных белковых веществ молочного происхождения используют молоко, или молозиво, или стародойное молоко, или обезжиренное молоко, или подсырную сыворотку, или творожную сыворотку, или ультрафильтрат обезжиренного или цельного молока, а также ультрафильтрат подсырной или творожной сыворотки. Биологически активная добавка может дополнительно содержать лизоцим, панкреатическую РНКазу и полипептиды. Данный способ позволяет получить БАД, содержащую в нативном виде ангиогенин, лизоцим, панкреатическую РНКазу и полипептиды, которая обладает ранозаживляющим и общеукрепляющим действием. 2 с. и 9 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к молочной, биотехнологической, медицинской и фармацевтической промышленности, а именно к способам получения биологически активных веществ, которые могут использоваться в качестве биологически активных добавок (БАД).

При производстве детских молочных продуктов известны способы получения БАД на основе лизоцима, а также лизоцима и молочнокислых бактерий ацидофильной палочки. Этими способами получают БАД, предназначенные для использования в детском, диетическом и лечебно-профилактическом питании. При получении БАД используют препарат куриного лизоцима и бактериальный концентрат ацидофильной палочки. Данный способ включает использование только одного фермента – лизоцима, обладающего бактерицидным действием, при этом не из молочного источника. Поэтому данный способ является менее совершенным и экономически менее эффективным [Детские молочные продукты, обогащенные лизоцимом: Обзорная инф. / Щербакова Э.Г., Растунова Г.А., Журавлева Т.П., Шаманова Г.П., Недайвозова Н.Н. – М.: АгроНИИТЭИММП, 1986, – 40 с.].

Известны способы переработки молока и получения белкового полисахаридного концентрата, которые заключаются в том, что с целью повышения биологической ценности и создания безотходной технологии обезжиренное молоко в количестве 5-100% с кислотностью 15-23^oТ обрабатывают при 2-40^oС полисахаридом с молекулярной массой 20000-80000 до разделения на казеиновую и полисахаридную фазу [Патент 1725803 (Россия). Способ переработки молока. / Молочников В. В. , Толстогузов В.Б.]. И получают концентрат натурального казеина (КНК), содержащий около 97% казеина и безказеиновую фракцию, содержащую всю водорастворимую часть молока и полисахарид. В дальнейшем безказеиновую фазу сгущают, получая при этом концентрат структурирующий пищевой (КСП) [Патент 181876 (Россия). Способ получения белкового полисахаридного концентрата./ Молочников В.В., Щанов В.Ю., Анисимов С.В., Храмцов А.А.]. КСП рекомендован для использования в качестве добавки к молочным и кондитерским изделиям как сруктурообразующий компонент, а также для регулирования содержания в продуктах растворимых биологически активных компонентов, повышающих устойчивость организма к вредным воздействиям окружающей среды [ТУ 49 1171-85 Концентрат структурирующий пищевой КСП]. Недостатком данных способов является содержание в готовом продукте (КСП) биологически активных веществ в неконцентрированном состоянии, а также содержание наряду с белковыми компонентами минеральных веществ, лактозы и пектина, а кроме того, КСП подвергается технологической обработке, в результате которой нативные свойства биологически активных веществ молока снижаются.

Японскими учеными запатентован в России способ получения продукта, содержащего “активные молочно-белковые компоненты”, и продукт, полученный этим способом (варианты) [Патент 21-6785 (Россия). Способ получения продукта, содержащего активные молочно-белковые компоненты, и продукт, полученный этим способом (варианты)./ Йосиказу Юки (JP), Кумико Теразава (JP), Томойо Накагава (JP), Казуо Кате (JP)]. Целью разработанного способа является получение для недоношенных детей продуктов, получаемых из грудного или коровьего молока и содержащих активные молочные белковые компоненты, а именно иммуноглобулины, лактоферрин и лизоцим. Эти продукты также могут быть использованы в качестве добавки к грудному молоку и как фармацевтические продукты, например, при терапии неподдающегося поноса. Авторы патента термин “активные белковые компоненты” используют для обозначения любого белка, который в минимальных количествах проявляет физиологические и фармакологические свойства. Продукты получают по способу, состоящему из стадий добавления к молочной плазме или сыворотке сахарного спирта, или дисахарида, или стабилизатора, состоящего из дисахарида и аминокислоты (глицин), и проведения термообработки полученной смеси при рН 6-8, при примерно 60^oС в течение около 10 ч; продукты, содержащие активные компоненты молочного белка, представляют собой осадок, образовавшийся при добавлении сульфата аммония в концентрации 30-60% (мас./объем) к термообработанной смеси. Термообработанную смесь охлаждают, а осажденную фракцию собирают центрифугированием и растворяют в изотоническом солевом растворе, подвергают адекватному диализу и стерилизации с помощью мембранной фильтрации. Недостатком данного способа является использование длительной (10 ч) термообработки, в результате которой уничтожаются не только вирусы, но и нативные вещества молока.

В Японии запатентован способ выделения из молока препарата ангиогенина, обладающего физиологической активностью [Патент 2-296000 (Япония)]. Благодаря наиважнейшей функции ангиогенина – способности индуцировать рост кровеносных сосудов предлагается использовать его для обработки поврежденных тканей, язв, при имплантации органов.

Однако в Японии запатентован способ использования ангиогенина в качестве препарата, стимулирующего рост волос [Патент 4-210618 (Япония)], а в США способ использования ангиогенина, выделенного из молозива или молока млекопитающих, например коровы, овцы, козы, в качестве биологически активного компонента косметического средства (в виде крема, эмульсии, лосьона) для удаления прыщей, веснушек и пятен с кожи [Патент 5698185 (США). Whitening cosmetic preparation and method of using same / Yasuharu Itagaki, Hidetoshi Ishikawa, Seiji Kurosawa].

Известен способ выделения ангиогенина, который представляет собой трехэтапный метод хроматографической очистки ангиогенина от белков молока с помощью ионообменной хроматографии на СМ-целлюлозе и гидрофобной хроматографии на CM Toyopearl 650S и Butyl Toyopearl 650 S [Патент 2109748 (РФ). Способ выделения ангиогенина / Рогов И.А., Шалыгина А.М., Комолова Г.С., Михайлов А. М. , Тихомирова Н.А.]. Данный способ является прототипом. Его недостатком является использование в качестве сорбентов дорогостоящих препаратов импортного производства, таких как CM Toyopearl 650 S и Butyl Toyopearl 650 S, а также использование трех этапов хроматографической очистки.

Таким образом, в результате патентного и литературного поиска установлено, что получение биологически активных веществ из молока является актуальной задачей, а использование нового белка ангиогенина в виде биологически активного препарата находит широкое распространение не только в медицине, фармакологии, но и в косметических целях.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является разработка способа получения БАД из различных видов молочного сырья, в том числе не используемого рационально, а именно: молозива, стародойного молока и вторичного сырья молочной промышленности, и полученная этим способом БАД “Милканг”, содержащая в концентрированном виде низкомолекулярные катионные белковые вещества (ангиогенин, лизоцим, панкреатическую РНКазу и полипептиды), обладающие парафармацевтическими свойствами.

Это достигается тем, что для получения БАД “Милканга” низкомолекулярные катионные белки молочного происхождения отделяют от жировой фракции, подвергая центрифугированию молочное сырье, далее проводят их сорбцию и хроматографическое разделение, элюирование, определение фракций с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед., подвергают диализу и согласно изобретению сорбцию и хроматографическое разделение проводят на СМ-целлюлозе, а диализ полученной белковой фракции проводят против физиологического раствора, при этом ее стабилизацию осуществляют микрофильтрацией через полупроницаемую мембрану с селективностью более 50 кДа, после чего полученную БАД, включающую ангиогенин, панкреатическую РНКазу, лизоцим и полипептиды, направляют на расфасовку.

Возможно полученную БАД “Милканг” подвергнуть сушке перед фасовкой.

Кроме того, следует указать, что для получения БАД “Милканг” возможно использовать в качестве источника нативных низкомолекулярных катионных белковых веществ: молоко, молозиво, стародойное молоко и вторичное сырье молочной промышленности: обезжиренное молоко; подсырную и творожную сыворотку; ультрафильтрат цельного и обезжиренного молока; ультрафильтрат подсырной или творожной сыворотки.

Технический результат, полученный согласно данному способу производства, заключается в том, что БАД содержит в нативном виде ангиогенин, лицозим, панкреатическую РНКазу и полипептиды, которые обладают ранозаживляющим и общеукрепляющим действием.

Разработан простой современный способ получения БАД на основе низкомолекулярных белков молока, обладающих биологической активностью. Впервые получена фракция низкомолекулярных катионных белков, обогащенных ангиогенином, панкреатической РНКазой, лизоцимом и полипептидами в очищенном виде. Благодаря получению белков в нативном состоянии данную фракцию целесообразно использовать в качестве БАД к пище или в терапевтических целях. Для ее получения применена ионообменная хроматография на СМ-целлюлозе. Впервые для стерилизации (микробиологической очистки) БАД использована микрофильтрация через полупроницаемые мембраны. В качестве источника низкомолекулярных катионных белковых веществ молока, обладающих общеукрепляющим и ранозаживляющим свойством, использовано сырое молоко, молозиво, стародойное молоко, а также вторичное сырье молочной промышленности. Молоко млекопитающих и вторичное молочное сырье является ценным источником биологически активных веществ [Биологически активные вещества молока / А.М. Шалыгина, Н.А. Тихомирова, И. И. Ионова, А. А. Петухов, Г.С. Комолова. М.: АгроНИИТЭИПП. 1997, 16 с.] и может быть использовано для получения БАД. В частности, представляют интерес практически не используемые в традиционных технологиях низкомолекулярные катионные белки, обладающие полифункциональными свойствами: панкреатическая РНКаза (12 кДа, противовирусное действие), ангиогенин (14,5 кДа, полифункциональный белок: фактор роста кровеносных сосудов, иммунорегулятор, бактерицидное действие), лизоцим (около 14 кДа, бактерицидное действие), а также полипептиды (с молекулярным весом менее 8 кДа, обладающие иммунорегуляторным действием). Разработанный способ позволяет получать БАД, содержащую в концентрированном и при этом в нативном виде вышеперечисленные белки и полипептиды. Благодаря сохраненным их нативным свойствам она обладает бактерицидным, иммунорегулирующим, а также ангиогенным свойствами, что позволяет ее использовать как непосредственно, так и в виде добавки к молочным и другим продуктам питания, которые могут быть рекомендованы в качестве диетического и лечебно-профилактического питания в общеукрепляющей и ранозаживляющей терапии.

Белковый состав БАД проверяют электрофорезом в ПААГ, а нативность белков – по ферментативной активности (лизоцим и РНКаза) и по взаимодействию с плацентарным ингибитором (ангиогенин).

Для получения БАД “Милканг” берут молочное сырье с нативными низкомолекулярными катионными белковыми веществами, обезжиривают, подвергая центрифугированию, далее обезжиренную белковую фракцию наносят на колонку с сорбентом СМ-целлюлозой и проводят ионообменную хроматографию, элюируют, собирая фракции с А₂₈₀>0,1. Фракции объединяют и проводят диализ против физиологического раствора. Полученный диализат подвергают микрофильтрации через полупроницаемые мембраны селективностью более 50 кДа. В результате получают БАД в жидкой форме. Для получения сухой формы ее подвергают сушке.

Пример 1.

Молозиво в количестве 1 л обезжиривают центрифугированием, далее обезжиренную фракцию наносят на колонку с сорбентом СМ-целлюлозой и проводят ионообменную хроматографию, элюируют, собирая фракции с А₂₈₀>0,1. Фракции объединяют и проводят диализ против физиологического раствора. Полученный диализат подвергают микрофильтрации через полупроницаемые мембраны селективностью более 50 кДа. В результате получают 25 мл БАД, состав которой в сравнении с прототипом представлен в таблице. Для получения сухой формы ее высушивают и получают 1 г БАД.

Пример 2.

Пример 2 осуществляют по примеру 1, при этом в качестве сырья используют молоко и получают БАД, состав которой представлен в таблице.

Пример 3.

Пример 3 осуществляют по примеру 1, при этом в качестве сырья используют стародойное молоко и получают БАД, состав которой представлен в таблице.

Пример 4.

Пример 4 осуществляют по примеру 1, при этом в качестве сырья используют обезжиренное молоко и получают БАД, состав которой представлен в таблице.

Пример 5.

Пример 5 осуществляют по примеру 1, при этом в качестве сырья используют подсырную сыворотку и получают БАД, состав которой представлен в таблице.

Пример 6.

Пример 6 осуществляют по примеру 1, при этом в качестве сырья используют творожную сыворотку и получают БАД, состав которой представлен в таблице.

Пример 7.

Пример 7 осуществляют по примеру 1, при этом в качестве сырья используют ультрафильтрат молочного сырья (цельное молоко, или обезжиренное молоко, или подсырная сыворотка, или творожная сыворотка) и получают БАД, состав которой представлен в таблице.

Таким образом, в сравнении с прототипом в состав БАД “Милканг” входят лизоцим, панкреатическая РНКаза и полипептиды, обладающие парафармацевтическими свойствами. В связи с чем БАД обладает не только ранозаживляющим, но и общеукрепляющим свойством.

Формула изобретения

1. Способ получения биологически активной добавки (БАД), включающий очистку сырья центрифугированием, сорбцию белков на ионообменнике, хроматографическое их разделение, элюирование, определение фракций с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед. , диализ, стабилизацию, отличающийся тем, что в качестве сырья используют нативные низкомолекулярные катионные белковые вещества молочного происхождения, хроматографическое разделение проводят на СМ-целлюлозе, а диализ полученной белковой фракции проводят против физиологического раствора, при этом стабилизацию осуществляют микрофильтрацией через полупроницаемые мембраны с селективностью более 50 кДа, после чего полученную БАД направляют на фасовку.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полученную БАД перед фасовкой подвергают сушке.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника нативных низкомолекулярных катионных белковых веществ молочного происхождения используют цельное молоко.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника нативных низкомолекулярных катионных белковых веществ молочного происхождения используют молозиво.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника нативных низкомолекулярных катионных белковых веществ молочного происхождения используют стародойное молоко.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника нативных низкомолекулярных катионных белковых веществ молочного происхождения используют обезжиренное молоко.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника нативных низкомолекулярных катионных белковых веществ молочного происхождения используют подсырную сыворотку.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника нативных низкомолекулярных катионных белковых веществ молочного происхождения используют творожную сыворотку.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника нативных низкомолекулярных катионных белковых веществ молочного происхождения используют ультрафильтрат обезжиренного или цельного молока.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника нативных низкомолекулярных катионных белковых веществ молочного происхождения используют ультрафильтрат подсырной или творожной сыворотки.

11. Биологически активная добавка, полученная по п. 1, включающая ангиогенин, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит лизоцим, панкреатическую РНКазу и полипептиды при следующем соотношении указанных белковых веществ, мг/мл:
Ангиогенин – 0,1-0,3
Лизоцим – 1,010^-3-4,010^-3
Панкреатическая РНКаза – 0,7-2,4
Полипептиды – 0,1-0,3

РИСУНКИ