Патент на изобретение №2183670
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КУЛЬТУРЫ ГРИБА PENICILLIUM CANESCENS-ПРОДУЦЕНТА ЭНДО-(1-4)-БЕТА-КСИЛАНАЗЫ И БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ
(57) Реферат: Изобретение относится к микробиологической промышленности и предназначено для получения эндо-(1-4-)-бета-ксиланазы и бета-галактозидазы. Питательная среда содержит грубо размолотый овес, соевую муку, калий фосфорнокислый однозамещенный и воду. Среда позволяет повысить продуктивность гриба, является более дешевой и технологически более удобной. Изобретение относится к микробиологической промышленности и предназначено для использования в технологических процессах получения ферментных препаратов эндо-(1-4)-бета-ксиланазы и бета-галактозидазы при культивировании штаммов гриба Penicillium canescens. Для культивирования штаммов гриба Penicillium canescens – продуцентов бета-галактозидазы известна питательная среда (авторское свидетельство СССР 1120700), содержащая в качестве источника углерода свекловичный жом, а в качестве источника азота белково-витаминный концентрат, следующего состава, г/л: свекловичный жом – 30, белково-витаминный концентрат – 50, натрий фосфорнокислый однозамещенный – 15-25, остальное – вода до 1 л. При культивировании на этой среде штамма гриба Penicillium canescens F-178 выход бета-галактозидазы составлял 42 ед/мл после четырех суток роста. Штамм Penicillium canescens ВКПМ F-436 на этой среде продуцировал 100-130 ед бета-галактозидазы в 1 мл культуральной жидкости через 120-144 ч культивирования (авторское свидетельство СССР 1738854). Для культивирования штаммов гриба Penicillium canescens продуцентов бета-галактозидазы известна питательная среда, содержащая, г/л: свекловичный жом – 30, соевый шрот – 50, натрий фосфорнокислый однозамещенный – 25, остальное – вода до 1 л. Эта среда рассматривается нами в качестве ближайшего аналога На этой среде рекомбинантный штамм Penicillium саnеsсens ВКПМ F-725 продуцировал 600-700 единиц бета-галактозидазы в 1 мл культуральной жидкости за 120 ч культивирования (патент РФ 2126049). Свекловичный жом в питательной среде для Penicillium canescens является не только источником углерода, но и выполняет важнейшую функцию поставщика арабинозы, которая необходима как индуктор генов секретируемой бета-галактозидазы и эндоксиланазы (Николаев, Винецкий, Биохимия, т. 63. с.1523, 1998). Ферментные комплексы гриба Penicillium canescens гидролизуют пектин свекловичного жома с образованием в среде арабинозы. Использование свекловичного жома при ферментации Penicillium canescens в колбах на качалке дает хорошие результаты, но для заводских многотоннажных ферментеров этот компонент среды создает много проблем. Помимо сезонного дефицита и дороговизны, свекловичный жом вследствие своей слоисто-комковатой консистенции требует предварительного размола, так как в противном случае происходит забивка трубопроводов ферментеров. В этой связи возникает задача замены свекловичного жома на другой компонент. Задачей изобретения является разработка доступной в любое время года, дешевой и технологически более удобной питательной среды для культивирования штаммов гриба Penicillium canescens продуцентов ферментов бета-галактозидазы и эндо-(1-4)-бета-ксиланазы. Для решения задачи предлагается среда, содержащая в качестве источника углерода грубо размолотый овес, а в качестве источника азота соевую муку при следующем соотношении компонентов, г/л: Размолотый овес – 30 – 50 Соевая мука – 25 – 40 KH2PO4 – 15 – 25 Вода – Остальное до 1 л Размолотый овес содержит ксилан, основная часть которого содержится в пленках семенной кожуры (техническое название “лузга”). Ксилан овса, как и у большинства зерновок злаковых, относится к типу L-арабино-D-ксиланов с арабинозными боковыми группами, которые гидролизуются ферментными комплексами гриба Penicillium canescens с образованием арабинозы, являющейся индуктором генов бета-галактозидазы и эндоксиланазы. Из всех доступных злаковых именно у овса самый высокий весовой процент ксилан-содержащих пленок – 23-45% (Мальцев. Технология бродильных производств. М., Пищепромиздат, 1960). Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Сравнение продуктивности штамма Penicillium canescens ВКПМ F725 на заявляемой и известной средах. Для получения посевного материала штамм Penicillium canescens ВКПМ F-725 выращивают на косяках на агаризованной среде Роулен-Тома при 30oС в течение 5-7 суток. Водной суспензией конидий (107 конидий/мл) инокулируют 100 мл известной среды следующего состава: свекловичный жом (30 г/л), соевый шрот – 50 г/л и КН2РO4 – 25 г/л, и 100 мл заявляемой среды следующего состава: размолотый овес – 40 г/л, соевая мука – 30 г/л, КH2РО4 – 25 г/л и культивируют в качалочных колбах объемом 750 мл при 30oС в течение 120 ч на круговой качалке при 240 об/мин. Затем культуральную жидкость отделяют от мицелия и твердых остатков среды центрифугированием (10000 g, 15 мин) и в супернатанте определяют активность бета-галактозидазы. Для определения активности бета-галактозидазы реакционную смесь, содержащую 3 мг О-нитрофенил-бета-галактопиранозида (ОНФГ) в 1,9 мл 0,05 М Na-ацетатного буфера, рН 4,5, и 100 мкл культуральной жидкости соответствующего разведения инкубируют 15 мин при 30oС, затем добавляют 1 мл 1 М Na2CO3 и измеряют оптическую плотность раствора при 420 нм. За единицу активности бета-галактозидазы принимают количество фермента, которое освобождает из субстрата ОНФГ 1 мкмоль О-нитрофенола за 1 мин при данных условиях реакции. При росте мультикопийного продуцента бета-галактозидазы Penicillium canescens ВКПМ F-725 на известной среде за 120 ч культивирования продуктивность штамма составила 565 ед бета-галактозидазы в 1 мл культуральной жидкости. На заявляемой среде продуктивность штамма составила 626 ед/мл. Пример 2. Сравнение продуктивности штамма Penicillium canescens ВКПМ F832 на заявляемой и известной средах. Получение посевного материала и условия культивирования, как в примере 1. Активность эндо-(1-4)-бета-ксиланазы определяют по количеству восстанавливающих сахаров, выделяемых при гидролизе ксилана из лиственницы. Инкубацию субстрата и фермента проводят при 50oС в течение 10 мин. Проба включает 0.45 мл 1% раствора ксилана в 0.1М ацетатном буферном растворе, рН 5.0, и 0.05 мл фермента в соответствующем разведении. За единицу активности эндо-(1-4)-бета-ксиланазы принимают количество фермента, высвобождающее 1 мкмоль/мин восстанавливающих сахаров при указанных выше условиях. Восстанавливающие сахара определяют методом Шомоди-Нельсона. При росте мультикопийного продуцента эндо-(1-4)-бета-ксиланазы Penicillium canescens ВКПМ F-832 на известной среде за 120 ч культивирования продуктивность штамма составила 629 единиц эндо-(1-4)-бета-ксиланазы в 1 мл культуральной жидкости. На заявляемой среде продуктивность штамма составила 648 ед/мл. Формула изобретения
Грубо размолотый овес – 30-50 Соевая мука – 25-40 Калий фосфорнокислый однозамещенный – 15-25 Вода – Остальное до 1 лв QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения
Лицензиар(ы): ФГУП “Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов”
Вид лицензии*: НИЛ
Лицензиат(ы): ОАО “Восток”
Договор № РД0005446 зарегистрирован 26.12.2005
Извещение опубликовано: 20.02.2006 БИ: 05/2006
* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия
QZ4A – Регистрация изменений (дополнений) лицензионного договора на использование изобретения
Лицензиар(ы): Федеральное государственное унитарное предприятие “Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов”
Вид лицензии*: НИЛ
Лицензиат(ы): Открытое акционерное общество “Восток”
Характер внесенных изменений (дополнений):
Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения:
Извещение опубликовано: 20.01.2010 БИ: 02/2010
* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия
|
||||||||||||||||||||||||||
