Патент на изобретение №2183643

Published by on




РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ



ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(19) RU (11) 2183643 (13) C1
(51) МПК 7
C07K7/08, A61K38/10, A61P31/04
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

Статус: по данным на 10.05.2011 – действует

(21), (22) Заявка: 2000131492/04, 18.12.2000

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

18.12.2000

(45) Опубликовано: 20.06.2002

(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске:
RU 9023808/04 А1, 27.06.1996. GB 2156822 А, 16.10.1985. US 3929756 А, 30.12.1975. US 4457864 А, 03.07.1984.

Адрес для переписки:

193318, Санкт-Петербург, ул. Подвойского, 14, корп.1, кв. 741, В.А.Кузнецову

(71) Заявитель(и):

Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов

(72) Автор(ы):

Колодкин Н.И.,
Смирнова М.П.,
Тяготин Ю.В.,
Шпень В.М.

(73) Патентообладатель(и):

Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов

(54) ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ БИОЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ


(57) Реферат:

Изобретение относится к новым пептидам общей формулы 1 H-a-Lys-b-Trp-Lys-c- Pro-d-Lys-Pro-Trp-e-Arg-NH2, где а = -Ile- или -Lys-; b= -Pro – или -Lys-; с, d = -Lys- или -Trp-; е=Arg или Ala, обладающий биоцидной активностью, которые сочетают более высокую по сравнению с индолицидином биоцидную активность с отсутствием повреждающего воздействия на клетки крови. 4 табл.


Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к новым пептидным структурам, обладающим биоцидными, в частности антибактериальными свойствами.

Механизм уничтожения клеток микроорганизмов такими пептидами связан со способностью этих соединений образовывать при взаимодействии с двойным слоем липидной мембраны клеток амфипатичные спирали, для которых характерны катион обогащенные и гидрофобные участки, что приводит к лизису клетки.

Наиболее близким к заявляемому решению по структуре и свойствам являлся пептид индолицидин общей формулы (1):
(1) H-Ile-Leu-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2

Недостатком индолицидина является наличие высокой гемолитической активности.

Задачей, стоящей перед авторами при создании настоящего изобретения, являлась разработка более эффективных и безопасных пептидов, лишенных побочного цитотоксического эффекта в отношении эритроцитов крови, то есть не обладающих гемолитической активностью.

Было найдено, что стоящая перед авторами задача решается путем создания пептида общей формулы (2):
(2) H-a-Lys-b-Trp-Lys-c-Pro-d-Lys-Pro-Trp-e-Arg-NH2,
где а = -Ile- или -Lys-;
b = -Pro- или -Lys -;
c, d = -Lys- или -Тrр-;
e = -Arg- или -Ala-.

Лучшие результаты были получены при использовании пептидов (3-7)
(3) H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2,
(4) H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2,
(5) H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Ala-Arg-NH2,
(6) H-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Lys-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2,
(7) H-Ile-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2.

Для временной защиты -аминогрупп используют трет.-бутилоксикарбонильную защитную группировку. Индольные кольца триптофана блокируют формильной группой, гуаногруппы аргинина – нитрогруппами,

Полноту протекания реакции контролируют нингидриновым тестом. Отщепление от смолы и удаление защитных групп проводят в два этапа. На первом этапе, непосредственно на полимере с помощью пиперидина удаляют формильные группы, на втором этапе – фтористым водородом в присутствии анизола производят окончательное деблокирование и отщепление пептида от смолы.

Очистку синтезированных пептидов проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (ВЖХ) на обращенной фазе.

Чистота полученных при этом препаратов была более 95%. Все они имели удовлетворительный аминокислотный анализ и были индивидуальны по данным аналитической ВЭЖХ.

Промышленная применимость изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез пептида H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2 (3)
Для синтеза пептида загружали в реакционный сосуд 0.2 г. N-трет-бутилоксикарбонил-N-нитро-аргинин-метил-бензгидриламинополимера в 10 мл диметилформамида. Содержание аргинина 1,0 ммол/г полимера. Пептидную цепь далее наращивали с С-конца по программе, приведенной в табл. 1.

Если нингидриновый тест положителен, повторяли конденсацию, начиная с п. 7.

Для синтеза пептида (3) к исходному N-трет-бутилоксикарбонил-N-нитро-L-аргинин-метилбензгидриламинополимеру по программе, приведенной в табл. 1, последовательно присоединяли N-трет-бутилоксикарбонил-N-нитро-L-аргинин, N-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N-трет-бутил-оксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N-трет-бутил-оксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-L-изолейцин.

По завершении синтеза пептидил-полимер высушивали в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора и 0,2 г пептидил-полимера деблокировали по программе, приведенной в табл. 2.

Лиофилизат подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С 18 Nova Pack 19300 в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте. Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 2. Синтез пептида H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2 (4)
Синтез, деблокирование, очистка и характеристика пептида (4) осуществляли теми же способами, что и пептида (3) по примеру 1, за исключением того, что для его получения к исходному N-трет-бутилоксикарбонил-N-нитро-аргинин-метилбензгидриламино-полимеру по программе, приведенной в таблице 1, последовательно присоединяли N-трет-бутилоксикарбонил-N-нитро-L-аргинин, N-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-L-изолейцин.

Полученный в результате деблокирования по программе, приведенной в табл. 2, лиофильно высушенный пептид подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С 18 Nova Pack 19300 в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте.

Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 3. Синтез пептида H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Ala-Arg-NH2 (5)
Синтез, деблокирование, очистка и характеристика пептида (5) осуществляются теми же способами, что и пептида (3) по примеру 1, за исключением того, что для его получения к исходному N-трет-бутилоксикарбонил-N-нитро-L-аргинин-метилбензгидриламинополимеру по программе, приведенной в табл. 1, последовательно присоединяли N-трет-бутилоксикарбонил-L-аланин, N-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N-трет-бутилоксикарбонилхлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N-трет-бутилокси-карбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин,N-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-L-изолейцин.

Полученный в результате деблокирования по программе, приведенной в табл. 2, лиофильно высушенный пептид подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С 18 Nova Pack 19300 в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте.

Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 4. Синтез пептида H-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Lys-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2= (6)
Синтез, деблокирование, очистка и характеристика пептида (6) осуществляются теми же способами, что и пептида (3) по примеру 1, за исключением того, что для его получения к исходному N-трет-бутилоксикарбонил-N-нитро-L-аргинин-метилбензгидриламино-полимеру по программе, приведенной в табл. 1, последовательно присоединяли N-трет-бутилоксикарбонил-N-нитрo-L-аргинин, N-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин.

Полученный в результате деблокирования по программе, приведенной в табл. 2, лиофильно высушенный пептид подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С 18 Nova Pack 19300 в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте.

Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 5. Синтез пептида H-Ile-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2 (7)
Синтез, деблокирование, очистка и характеристика пептида (7) осуществляются теми же способами, что и пептида (3) по примеру 1, за исключением того, что для его получения к исходному N-трет-бутилоксикарбонил-N-нитро-L-аргинин-метилбензгидриламинополимеру по программе, приведенной в табл. 1, последовательно присоединяли N-трет-бутилоксикарбонил-N-нитро-L-аргинин, N-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N-трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофан, трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N-трет-бутилоксикарбонил-N-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-L-изолейцин.

Полученный в результате деблокирования по программе, приведенной в табл. 2, лиофильно высушенный пептид подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С 18 Nova Pack 19300 в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте.

Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 6. Влияние синтезированных пептидов на рост микроорганизмов.

Культуры клеток, выращенные на твердой питательной среде, выдерживали сутки в холодильнике при +6oС. Перед измерением клетки снимали петлей в жидкую среду LB и доводили концентрацию до 5106 -107 клеток/мл. В стерильные планшеты “Costar” для клеточных культур (96 ячеек) вносили по 50 мкл раствора пептида в воде (концентрация 200 мкг/мл) и по 100 мкл суспензии клеток в среде LB, и проводили далее разбавление с шагом 2. Инкубировали планшеты в течение 16 часов при 37oС, встряхивали планшеты при комнатной температуре в течение 20-30 минут для взвешивания клеток и снимали показатели оптической плотности на ридере для планшет при длине волны 490 нм.

Считали средний контроль (без пептида) и оценивали % подавления роста микроорганизма по сравнению с контролем.

Результаты испытаний приведены в табл. 3.

Пример 7. Гемолитическая активность пептидов.

Эритроциты человека (кровь берется на гепарин) отмывали 3 раза верональным буфером (VBS) и разводили до концентрации 0,5% (об.) в VBS. Образцы пептидов разводили в концентрации 200 мкг/мл в VBS, при этом начальная концентрация пептида в ячейке составляла 100 мкг.

Раствор пептида вносили в ячейки стерильной планшеты для клеточных культур фирмы “Costar”, начиная с концентрации 100 мкг препарата и 50 мкг эритроцитов человека в ячейку. Проводили раститровывание с шагом 2. Планшеты инкубировали 1 час при 37oС, центрифугировали, отбирали супернатант и проводили скрининг оптической плотности при 415 нм.

В качестве контроля использовали: К1 – VBS без пептида; К2 – VBS с 1% тритоном Х-100. Полученные показатели гемолиза обрабатывали по формуле:

Результаты испытаний приведены в табл. 4.

Полученные данные свидетельствуют, что пептиды заявляемой структуры сочетают более высокую по сравнению с индолицидином биоцидную активность с отсутствием повреждающего воздействия на клетки крови. Проведенные испытания пептидов при внутреннем введении в дозе до 1,5 мг/кг путем инъекции соединения в физиологическом растворе в хвостовую вену белых беспородных мышей показали отсутствие токсичности для всех предлагаемых пептидов.

Формула изобретения


Пептид общей формулы
H-a-Lys-b-Trp-Lys-c-Pro-d-Lys-Pro-Trp-e-Arg-NH2,
где а = -Ile- или -Lys-;
b = -Pro- или -Lys-;
с, d = -Lys- или -Trp-;
е = Arg или Ala,
обладающий биоцидной активностью.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4


MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 19.12.2008

Извещение опубликовано: 7.12.2010 БИ: 36/2010


NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 27.12.2010

Извещение опубликовано: 7.12.2010 БИ: 36/2010


PD4A Изменение наименования, фамилии, имени, отчества патентообладателя

(73) Патентообладатель(и):

Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства (RU)

Дата публикации: 10.05.2011


Categories: BD_2183000-2183999