Патент на изобретение №2183218

(54) ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER ВКПМ F – 790 – ПРОДУЦЕНТ ГЛЮКОНОВОЙ И ЛИМОННОЙ КИСЛОТ

(57) Реферат:

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма гриба Aspergillus niger ВКПМ F-790. В зависимости от создания условий штамм продуцирует лимонную кислоту или ее соли и глюконовую кислоту (в виде ее солей или глюконолактонов). Штамм ВКПМ F-790 позволяет перестроить производства, использующие для биосинтеза гриб Aspergillus niger, с получения монопродукта на получение нескольких продуктов, что экономически более выгодно. Новый штамм более устойчив в кислых средах, что позволяет упростить производство глюконовой кислоты. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма гриба Aspergillus niger ВКПМ F- 790, продуцирующего в зависимости от созданных условий лимонную кислоту (ее соли) или глюконовую кислоту (ее соли или глюконолактоны).

Известны штаммы гриба Aspergillus niger ВКПМ F-501 и Aspergillus niger ВКПМ F-171. Оба штамма предназначены исключительно для биосинтеза лимонной кислоты в промышленных условиях на сахаросодержащих средах различного состава [1, 2].

В процессе биосинтеза лимонной кислоты указанными штаммами образуется около 10% глюконовой кислоты к сумме всех кислот биосинтеза, что составляет от 7 до 8% относительно введенного сахара. Для целевого производства глюконовой кислоты или ее производных такие показатели биосинтеза интереса не представляют.

При обеспечении особых, благоприятных для образования глюконовой кислоты или ее производных условий [3], выход этих продуктов возрастает до 75-85% к введенному сахару. В качестве побочных продуктов образуются лимонная и щавелевая кислоты, затрудняющие выделение целевого продукта и теряющиеся безвозвратно.

Задачей настоящего изобретения является получение нового штамма гриба Aspergillus niger, обладающего высокими показателями активности и продуктивности как при биосинтезе лимонной кислоты (ее солей), так и в процессе получения глюконовой кислоты (ее солей или глюконолактонов) в промышленных условиях.

Новый штамм получен селекцией из штамма мутанта Aspergillus niger ВКПМ F-171 (далее именуемого штамм Л-4) [2].

В течение пяти лет в условиях промышленного производства лимонной кислоты осуществляли отбор, рассев и изоляцию образцов культуры Л-4, подвергающихся в естественных условиях производства мутациям, которые сопровождались усилением кислотообразования, повышением устойчивости к бактериальному и дрожжевому инфицированию.

Особое внимание привлекают образцы культуры, обеспечивающие наряду с высокими технико-экономическими показателями в биосинтезе лимонной кислоты их существенное возрастание по сравнению с исходным штаммом Л-4 при получении глюконовой кислоты и ее производных.

О значении целевых продуктов биосинтеза, производство которых возможно на основе применения нового штамма, позволяет судить информация, представленная в работе [4].

Полученный в результате селекции штамм гриба Aspergillus niger имеет коллекционный номер ВКПМ F-790.

Культурально-морфологические признаки изучают у пятисуточных культур, выращенных на синтетической среде Чапека или сусло-агаровой питательной среде.

Культуральные признаки на среде Чапека.

Колония имеет диаметр 782 мм, окраска бежевая, в центре желтоватого цвета, приподнята над субстратом. Конидиальные головки в центре колонии крупные, расположены плотно, образуют возвышение, к краю их размер уменьшается. Размер аспорогенной зоны около 6 мм. Обратная сторона колонии складчатая, белая.

В таблице обобщены показатели вновь полученного штамма ВКПМ F-790 в сравнении с известным штаммом Л-4.

Как видно из таблицы, на среде Чапека штамм ВКПМ F-790 имеет иную окраску и внешний вид обратной стороны колонии.

Культуральные признаки на сусло-агаровой питательной среде.

Колония имеет в диаметре 951 мм. Окраска бежевая. Воздушный мицелий сильно развит. В центре конидиальные головки более крупные, расположены плотно, к краю мельчают. Размер аспорогенной зоны 14,51,5 мм. Обратная сторона колонии складчатая, белая.

В отличие от известного штамма (см. таблицу) штамм ВКПМ F-790 характеризует больший размер колоний, увеличение аспорогенной зоны и складчатость обратной стороны колонии.

Морфологические признаки идентифицируют у пятисуточных культур, выращенных на среде Чапека.

Конидиальные головки круглой формы, их диаметр 11061 мкм, вздутие конидиеносца шаровидной формы диаметром 314 мкм. Стеригмы двухслойные: стеригмы первого порядка длиной 155 мкм, стеригмы второго порядка длиной 7,52,5 мкм, их поверхность покрыта выростами. Конидии соединены в цепочки сплюснутыми сторонами, лишенными выростов. Средний размер конидий 3,30,3 мкм. Конидиеносцы прямые, бесцветные, длина конидиеносцев 867561 мкм, диаметр 10,53,5 мкм.

Сравнение с известным штаммом Л-4 показывает, что штамм ВКПМ F-790 имеет большие размеры конидиальных головок, меньше размер вздутия конидиеносцев, длину стеригм первого порядка, размер конидий и диаметр конидиеносца (см. таблицу).

Среди биохимических свойств штамма ВКПМ F-790 заслуживает упоминания его способность к росту и биосинтезу в более кислых средах, чем исходного штамма. При глубинном культивировании вновь полученный штамм ВКПМ F-790 имеет оптимум рН при биосинтезе глюконовой кислоты от 3,5 до 6,0 в отличие от известного штамма Л-4 (оптимум рН при аналогичном применении 5,5-6,0). Вероятно, именно этот признак штамма ВКПМ F-790 обеспечивает ему большую устойчивость по сравнению с Л-4 к бактериальному и дрожжевому инфицированию.

Новый штамм ВКПМ F-790 так же, как и известный Л-4, – аэроб, прототроф. Способен обеспечивать ферментацию от 20 ч до 12 суток. Хорошо хранится и воспроизводит свои свойства в виде сухих конидий (остаточная влажность 5-10 отн.%).

Активность и продуктивность нового штамма ВКПМ F-790 оценивают в промышленных (биосинтез лимонной кислоты и глюконата кальция) и лабораторных (биосинтез солей лимонной кислоты и глюконолактонов) условиях.

Под активностью понимают выход целевого продукта, полученный по отношению к введенному сахару за определенное время ферментации. О продуктивности процесса судят по объему продукта биосинтеза с единицы объема реактора в сутки.

Как видно из таблицы, при близких значениях активности и продуктивности нового и известного штаммов в биосинтезе лимонной кислоты штамм ВКПМ F-790 на 17-22% активнее и на 25-30 кг/м³ сутки продуктивнее Л-4 при производстве глюконовой кислоты или ее производных. Эти показатели сопровождают меньшие концентрации побочных продуктов биосинтеза (см. таблицу).

Отношение к источникам азота.

Усваивает азот из минеральных солей и органических соединений: белков, пептидов, аминокислот.

Отношение к источникам углерода.

Усваивает сахарозу, глюкозу, фруктозу, сорбозу, мальтозу; плохо утилизирует декстрин, крахмал, лактозу, галактозу.

Сущность изобретения поясняют некоторые конкретные примеры использования штамма ВКПМ F-790.

Пример 1.

Получение лимонной кислоты.

1.1. Получение посевного материала в виде конидий.

Конидии выращивают в камерах-термостатах с регулируемой температурой и влажностью на кюветах, заполненных слоем 1,5 см питательной средой состава, г/дм³:
Пивное сусло – 20
Мочевина – 1
Хлорид натрия – 20
Агар – 20
Артезианская вода – Остальное
рН перед стерилизацией 5,8.

Среду засевают культурой штамма F-790 и инкубируют в течение 7 суток в условиях принудительной аэрации стерильным воздухом, поддерживая следующий режим выращивания:
1-4 сутки: влажность – снижение от 80 до 60 отн.%;
5-7 сутки: влажность – снижение от 60 до 40 отн.%.

На 8 сутки температуру воздуха снижают до 18^oС и собирают конидии вакуумным устройством. Сушат конидии при 32^oС до остаточного содержания влаги 7 отн.%.

1.2. 3амачивание конидий.

4 г конидий замачивают в 1 дм³ стерильного водно-мелассного раствора, содержащего 50 г мелассы.

Выдерживают суспензию конидий на качалке с числом качаний 160 в мин в течение 7 ч при 34^oС.

1.3. Выращивание посевного материала – инокулюма.

В промышленном посевном ферментаторе – инокуляторе объемом 10 м³ готовят питательную среду следующего состава, г/дм³:
Меласса – 50
Ферроцианид калия – 0,25
Оксалат аммония – 2
Сульфат цинка – 0,005
Сульфат магния – 0,25
Фосфат калия однозамещенный – 0,16
Артезианская вода – Остальное
Засевают на подготовленную питательную среду набухшую суспензию конидий.

Далее посевной материал, инокулюм, выращивают, используя следующий воздушно-температурный режим:
время до 12 ч: температура 38^oC, расход воздуха 200 м³/ч;
время до 24 ч: температура 37^oC, расход воздуха 300 м³/ч.

1.4. Основная ферментация.

В промышленном ферментаторе объемом 100 м³ готовят 60 м³ питательной среды следующего состава, г/дм³:
Меласса – 60
Ферроцианид калия – 0,25
Оксалат аммония – 2
Сульфат цинка – 0,005
Сульфат магния – 0,25
Фосфат калия однозамещенный – 0,16
Артезианская вода – Остальное
рН 5,5.

Переводят инокулюм в ферментатор и ведут биосинтез в течение 5 суток, поддерживая следующий воздушно-температурный режим:
сутки 1: расход воздуха 1200 м³/ч, температура 37^oC;
сутки 2: расход воздуха 1500 м³/ч, температура 36^oC;
сутки 3: расход воздуха 1800 м³/ч, температура 36^oC;
сутки 4: расход воздуха 2000 м³/ч, температура 34^oC;
сутки 5: расход воздуха 2200 м³/ч, температура 34^oC.

Начиная с 3 суток, производят доливы по 0,25 м³ питательной среды следующего состава, г/дм³:
Меласса – 500
Ферроцианид калия – 0,5
Оксалат аммония – 3
Артезианская вода – Остальное
После отделения биомассы получают 68 м³ раствора с суммарной кислотностью 10 мас.% и концентрацией лимонной кислоты 9 мас.% (6120 кг). Выход к затраченному сахару (8100 кг) 75,6%.

Пример 2.

Получение цитрата натрия.

2.1. Получение посевного материала в виде конидий, как в примере 1.

2.2. Замачивание конидий.

0,1 г конидий замачивают в 700 см³ водно-мелассной среды, содержащей 40 г мелассы.

Выдерживают суспензию на качалке с числом качаний 160 в мин в течение 7 ч при 34^oС.

2.3. Основная ферментация.

В лабораторном ферментаторе объемом 10 дм³ готовят 7 дм³ питательной среды следующего состава, г/дм³:
Сахароза – 150
Сульфат цинка – 0,005
Сульфат магния – 0,25
Диаммонийфосфат – 0,4
Фосфат калия однозамещенный – 0,16
Мочевина – 2
Артезианская вода – Остальное
Засевают на стерильную питательную среду набухшую суспензию конидий.

Далее ведут процесс, используя следующий воздушно-температурный режим:
сутки 1: температура 38^oC, расход воздуха 100 дм³/ч,
сутки 2: температура 36^oC, расход воздуха 150 дм³/ч,
сутки 3-5: температура 34^oC, расход воздуха 220 дм³/ч.

Раствором 10 мас.% гидроксида натрия, начиная с 3 суток, поддерживают рН около 3,5.

По окончании утилизации сахара процесс прекращают, биомассу отделяют, рН раствора доводят до 6,5. Получают 810 г цитрата натрия. Выход по отношению к использованному сахару (1070 г) 75,7%.

Пример 3.

Получение глюконата кальция.

3.1. Получение посевного материала в виде конидий, как в примере 1.

3.2. Выращивание посевного материала – инокулюма.

В промышленном посевном ферментаторе – инокуляторе объемом 1 м³ готовят 600 дм³ питательной среды следующего состава, г/дм³:
Глюкоза – 25
Сульфат магния – 0,2
Сульфат марганца – 0,05
Диаммонийфосфат – 0,4
Калий фосфорнокислый однозамещенный – 0,2
Артезианская вода – Остальное
Засевают набухшую суспензию конидий на подготовленную стерильную питательную среду.

Далее инокулюм выращивают, используя следующий воздушно-температурный режим:
время до 12 ч: температура 38^oC, расход воздуха 4 м³/ч,
время до 24 ч: температура 37^oC, расход воздуха 5 м³/ч.

3.4. Основная ферментация.

В промышленном ферментаторе объемом 10 м³ готовят 7 м³ питательной среды следующего состава, г/дм³:
Глюкоза – 110
Сульфат магния – 0,2
Сульфат марганца – 0,05
Диаммонийфосфат – 0,2
Калий фосфорнокислый однозамещенный – 0,2
Артезианская вода – Остальное
Засевают на стерильную питательную среду набухшую суспензию конидий.

Далее ведут процесс, используя следующий воздушно-температурный режим:
время до 6 ч: температура 37^oC, расход воздуха 30 м³/ч,
время до 12 ч: температура 36^oC, расход воздуха 40 м³/ч,
время до 24 ч: температура 35^oC, расход воздуха 50 м³/ч.

В процессе ферментации 10 мас.% суспензией гидроксида кальция поддерживают рН среды 3,5-4,5.

По окончании утилизации сахара процесс прекращают, биомассу отделяют, доводят рН гидроксидом кальция до рН 6,5 и получают 820 кг глюконата кальция. Выход по отношению к затраченному сахару (785 кг) 104,4% (теоретический выход кальция глюконата моногидрата 113% по отношению к глюкозе моногидрату).

Пример 4.

Получение глюконо--лактона.

4.1. Получение посевного материала в виде конидий, как в примере 1.

4.2. Замачивание конидий, как в примере 2.

4.3. Основная ферментация.

В лабораторном ферментаторе объемом 10 дм³ готовят 7 дм³ питательной среды следующего состава, г/дм³:
Глюкоза – 110
Сульфат магния – 0,2
Сульфат марганца – 0,05
Диаммонийфосфат – 0,2
Калий фосфорнокислый однозамещенный – 0,2
Артезианская вода – Остальное
Засевают на стерильную питательную среду набухшую суспензию конидий.

Далее ведут процесс, используя следующий воздушно-температурный режим:
время до 3 ч: температура 37^oC, расход воздуха 10 дм³/ч,
время до 6 ч: температура 36^oC, расход воздуха 20 дм³/ч,
время до 12 ч: температура 34^oC, расход воздуха 25 дм³/ч,
время до 24 ч: температура 34^oC, расход воздуха 40 дм³/ч.

По окончании утилизации сахара процесс прекращают, биомассу отделяют, доводят рН до 3,5 суспензией гидроксида кальция, осадок отделяют.

Получают 770 г глюконовой кислоты с выходом к затраченному сахару (790 г) 97,5%.

Глюконовую кислоту выделяют в виде глюконо-5-лактона после упарки до 60 мас.% и кристаллизации при 40^oС.

С учетом потерь при кристаллизации выход глюконо--лактона по отношению к сахару составляет 65%.

Технико-экономическая эффективность штамма ВКПМ F-790.

Новый штамм ВКПМ F-790 расширяет номенклатуру биопродуктов, синтезируемых плесневыми грибами вида Aspergillus niger в промышленных условиях.

Подобно известному штамму Л-4 он обеспечивает высокие технико-экономические показатели в производстве лимонной кислоты (ее солей). Это ценное качество сочетается со способностью с более высоким выходом по сахару (на 17-22%) и продуктивностью (на 20-30 кг/м³сутки) по сравнению с известным штаммом производить глюконовую кислоту и ее производные.

Биосинтез глюконовой кислоты новым штаммом ВКПМ F-790 – высокоэффективный процесс, носящий характер биотрансформации.

Практические потери глюкозы связаны с ее расходом на накопление биомассы и дыхание. Высокая специфичность реакции, инициируемой штаммом ВКПМ F-790, приводит к снижению примесей побочных продуктов по сравнению с Л-4 от примерно 15% до 1,5%, определенных в сумме продуктов реакции.

Отмеченная большая устойчивость штамма ВКПМ F-790 к кислым средам в сравнении с Л-4 позволяет упростить производство глюконовой кислоты или глюконолактонов.

Из-за необходимости ведения процесса биосинтеза производных глюконовой кислоты при рН от 5,5 до 7 с помощью других штаммов-продуцентов глюконатов не удается получать глюконовую кислоту или глюконолактоны непосредственно в ходе биосинтеза. Обычно [4] получают глюконат кальция, кислотным разложением которого получают глюконовую кислоту. Штамм ВКПМ F-790 позволяет проводить биосинтез при рН около 3,5 и получать глюконовую кислоту в процессе биосинтеза.

Таким образом, штамм ВКПМ F-790 позволяет перестроить производства, использующие для биосинтеза гриб Aspergillus niger, с ориентации на монопродукт в гибкие современные производства, свободно ориентирующиеся по запросам и конъюнктуре рынка.

Информационные материалы.

1. SU1811697 A3, C 12 N 1/14.

2. SU 975799 С, C 12 N 15/08 (прототип).

3. RU 2132878 C1, C 12 P 7/40.

4. Промышленная микробиология. / Под ред. Н.С. Егорова. – М.; с.495 и 496, 498 и 499, 513 и 514.

Формула изобретения

Штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F- 790 – продуцент глюконовой и лимонной кислот.

РИСУНКИ

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Прежний патентообладатель:

Открытое акционерное общество Белгородский завод лимонной кислоты “Цитробел”

(73) Патентообладатель:

Закрытое акционерное общество “Цитробел”

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 19.05.2006 № РД0008897

Извещение опубликовано: 10.07.2006 БИ: 19/2006

PC4A Государственная регистрация перехода исключительного права без заключения договора

(73) Патентообладатель(и):

Закрытое акционерное общество “Цитробел”

(73) Патентообладатель:

Общество с ограниченной ответственностью “Цитробел”

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 09.06.2010 № РП0000823

Извещение опубликовано: 20.07.2010 БИ: 20/2010