Патент на изобретение №2182596

(54) ШТАММ ARTHROBOTRYS LONGA MECHT – ПРОДУЦЕНТ ЛОНГОЛИТИНА – КОМПЛЕКСА ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИХ И ТРОМБОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ СО СПЕЦИФИЧЕСКОЙ СПОСОБНОСТЬЮ К АКТИВАЦИИ ПЛАЗМИНОГЕНА И НАРУЖНОЕ СРЕДСТВО ЛЕЧЕНИЯ ТРОМБОЗОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, может найти применение в медицине. Сущность изобретения: получен новый штамм гриба Arthrobotrys longa Mecht 2 – продуцент лонголитина – комплекса тромболитических и фибринолитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена. Предложено наружное применение лонголитина при лечении тромбозов путем нанесения его на кожные покровы в виде раствора в глицерине с концентрацией 3-100 мг/мл. Штамм накапливает до 2-4 г сырца с 1 л культуральной жидкости. Применение лонголитина исключает отрицательные последствия лечения. 2 с.п.ф-лы, 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и может найти применение при лечении тромбозов.

Тромболитические препараты – естественные патогенетические средства лечения тромбозов, осложняющих течение как сердечно-сосудистых, так и инфекционно-аллергических заболеваний. При опасных сосудистых заболеваниях – инфаркте миокарда, инсульте – применение их обязательно, если препараты есть в клинике и не противопоказаны пациенту. Для менее тяжелых, но также довольно распространенных ситуаций тромбоза, например при тромбофлебите, тромболитическая терапия как метод консервативного лечения используется не всегда, во-первых, из-за хорошо известных ее осложнений (кровотечения, ретромбозы), во-вторых, из-за высокой стоимости лечения. Поэтому актуальным остается как создание недорогих тромболитических средств, так и поиск способов нейтрализации их опасных побочных действий.

Известен штамм Arthrobotrys longa Mecht 1 – продуцент комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена (Авторское свидетельство СССР 745943, С 12 N 1/14, 1980 [1]).

Однако фибринолитическая и тромболитическая активность данного известного комплекса ферментов, выделенного из культуральной жидкости данного известного штамма гриба, недостаточно высокая.

Известно применение лонголитина – комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов в качестве средства, вызывающего растворение экспериментальных тромбов у лабораторных животных при его внутривенном введении (Г.В. Андреенко и др. ж. Гематология и трансфузиология, 1983, вып.12, стр.48-50 [2]).

Однако наружное применение комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов в качестве средства лечения тромбозов не описано.

Использование фибринолитических и тромболитических ферментов в качестве наружного тромболитического средства для лечения тромбозов при тромбофлебитах перспективно, так как при наружном применении уменьшается риск развития осложнений, связанных с внутривенным введением любого лекарственного средства (пирогенное, аллергическое действие, заражение гепатитом, вирусом СПИДа). Кроме того, при наружном применении могут быть смягчены специфические побочные эффекты тромболитической терапии – ретромбозы и кровотечения.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является получение нового штамма – продуцента лонголитина – комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов с повышенной активностью, упрощение лечения тромбозов и снижение нежелательных последствий лечения за счет наружного применения лонголитина – комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена.

Указанный технический результат достигается тем, что получен новый штамм – продуцент лонголитина – комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена: гриб Arthrobotrys longa Mecht 2. Впервые рекомендовано применение комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов в качестве наружного средства лечения тромбозов.

Данный технический результат достигается также тем, что в способе лечения тромбозов, включающем использование тромболитических ферментных препаратов, препараты используют путем их нанесения на кожные покровы. При этом в качестве тромболитического препарата используют лонголитин. Его рекомендуют использовать в виде раствора в глицерине преимущественно с концентрацией 3-100 мг/мл.

На фиг. 1 представлена динамика биохимических показателей гемостаза и фибринолиза (%-ное отношение к фоновым значениям) при применении препарата лонголитина и после его отмены.

На фиг.2 представлено изменение (%) биохимических показателей гемостаза и фибринолиза через 7 дней после отмены лонголитина.

Ниже приведены примеры реализации изобретения.

Пример 1. Мицелий штамма Arthrobotrys longa Mecht 2 в течение 20 лет инкубировали на агаризованной среде Чапека следующего состава, г/л: Na₂NO₃ 29-31; KH₂PO₄ 0,9-1,1; KCl 0,4-0,5; Mg₂SO₄ 0,4-0,6; сахароза 24-26; вода водопроводная – остальное. По истечении 20 лет селекционных работ на данной среде был получен новый штамм Arthrobotrys longa Mecht 2, депонированный в коллекции лаборатории биологически активных веществ кафедры микробиологии биологического факультета Московского государственного университета.

Полученный штамм является плесневым грибом и относится к классу Fungi Imperfecti, род Arthrobotrys.

На агаризованной среде Чапека указанного выше состава новый штамм образует широкорастущие ворсистые колонии, белые, с возрастом розовеющие. Макроконидиальное спороношение отсутствует. Наблюдается обильное образование микроконидий на вегетативных гифах. Обратная сторона колонии бесцветная или желтоватая. На сусло-агаре (5^o БЛГ, агар-агар – 20 г/л) в центре ворсистой белой, розовеющей с возрастом колонии образуются более высокие выросты-столоны, представляющие слабоветвящиеся мицелиальные тяжи. Обратная сторона колонии с радиальными складками, коричневатая.

Культуральные признаки. При росте в погруженной культуре в колбах на качалке, имеющей 240 об/мин, при 25-26^oС в течение 144-168 часов на сусле (4^o БЛГ) и на синтетической среде, содержащей в г/л: КH₂PО₄ 4,2-4,4; NaNO₃ 18-20; KNO₃ 2,2-2,8; сахарозу 20-40; воду водопроводную – остальное, наблюдается образование одноклеточных микроконидий величиной в 3-5 мкм. Микроконидии образуются непосредственно на гифах вегетативного мицелия. Культуральная жидкость имеет вид разведенного молока, плохо фильтруется, пигментов во внешнюю среду не выделяет.

Описание культивирования. Споры с агаризованной среды Чапека – глубинное культивирование в 2 этапа: выращивание посевного мицелия и проведение собственно биосинтеза комплекса ферментов.

Посевной мицелий выращивали в течение 36-48 ч на среде, содержащей, г/л: КН₂PO₄ 2,0-2,4; NaNO₃ 9,3-9,8; KNO₃ 1,15-1,35; сахарозу 18-20; воду водопроводную – остальное. Биосинтез проводили в течение 144-148 ч на среде того же состава с более концентрированным (в 2 раза) содержанием исходных компонентов в качалочных колбах объемом 750 мл с 200 мл питательной среды на качалке с 240 об/мин при температуре 25-26^oС.

Фибринолитические и тромболитические ферменты образуются в глубинных условиях при росте на качалке с 240 об/мин на синтетической среде при температуре 25-26^oС в течение 144-168 ч в количестве 2-4 г сырца с 1 л культуральной жидкости. Новый штамм сохраняет специфическую способность к активации плазминогена (для сравнения: исходный штамм Arthrobotrys Mecht 1 при культивировании в этих же условиях накапливает комплекс ферментов в количестве 0,75 г сырца с 1 л культуральной жидкости).

Пример 2. Препарат лонголитина получили путем осаждения из культуральной жидкости Arthrobotrys longa Merch 2 2-кратным объемом охлажденного ацетона. Полученный препарат лонголитина в виде раствора в глицерине наносили крысам на освобожденный участок кожи внутренней поверхности бедра размером около 10 мм 10 мм и легким массажем втирали в ткань ежедневно в течение 10 дней. Каждое животное получало однократно примерно 0,16 мл раствора. Кровь для исследований брали из яремной вены до опыта, через 7, 10 дней от начала процедуры и спустя неделю после отмены препарата. Использовали две дозы: 5 мг/мл (активность 25 усл. ед.) и 30 мг/мл (активность 60 усл. ед.). Контрольным животным на кожу наносили глицерин. В крови определяли биохимические параметры свертывания крови и фибринолиза: концентрацию фибриногена по Лазару, время рекальцификации, время лизиса эуглобулиновой фракции по Ниверовскому, фибринолитическую активность на стандартных фибриновых пластинках по Аструпу, уровень ингибиторов фибринолиза – ₂-антиплазмина по Нордо и антиактиватора по Беннет.

Результаты представлены в таблице и на фиг.1 и фиг.2. Из данных, приведенных в таблице и на фиг.1, видно, что после 7 дней ежедневного втирания препарата в кожный лоскут он проникает через мягкие ткани в общий кровоток. В крови опытных крыс развивается незначительно выраженное состояние гиперкоагуляции и депрессии фибринолиза, регистрируемое укорочением времени рекальцификации, увеличением концентрации фибриногена, снижением фибринолитической активности, измеренной как на фибриновых пластинках, так и по времени лизиса эуглобулиновой фракции, увеличением уровня ₂-антиплазмина. Наоборот, состояние контрольных животных к 7 дню эксперимента можно охарактеризовать как стабильное с некоторой тенденцией к гиперкоагуляции.

Таким образом, в основном разнонаправленные сдвиги изучаемых показателей в опытной и контрольной группах экспериментальных животных свидетельствуют об активном воздействии препарата лонголитина на систему гемостаза и фибринолиза при нанесении его на кожный лоскут. Лонголитин проникает сквозь эпидермис в субэпидермальное пространство, распространяется по системе микроциркуляции и, действуя на систему гемостаза и фибринолиза, вызывает их ответную реакцию, регистрируемую в системном кровотоке в виде слабовыраженной гиперкоагуляции и подавления фибринолиза. Такой ответ типичен для фибринолитических и протеолитических ферментов при попадании их в кровоток и представляет регуляторные противодействия организма агрессивной протеолитической активности с возможным развитием как тромбоза, так и кровоточивости.

Пример 3. Наркотизированным крысам в изолированный лигатурой участок вены вводили раствор тромбина, что приводило к образованию тромбов внутри сегмента V. Jugularis. На участок вены с тромбом наносили раствор лонголитина в глицерине. Наблюдали полное растворение тромбов в 85% случаев, частичное – в 9%. В 6% случаев тромбы не растворялись. Время лизиса тромба составляло от 30 мин до 4 ч, что зависело от их размеров, времени стабилизации и активности препарата. Контрольные тромбы не растворялись в течение всего опыта (7-8 ч).

Таким образом, при реализации изобретения, используя новый штамм – продуцент лонголитина – путем его поверхностного применения, можно лечить тромбозы, исключая отрицательные последствия лечения, наблюдающиеся при внутривенном введении тромболитических ферментов. Лонголитин – это первый тромболитический препарат, впервые успешно применный поверхностно при лечении тромбозов.

Формула изобретения

1. Штамм Arthrobotrys longa Mecht 2 – коллекция лаборатории биологически активных веществ кафедры микробиологии биологического факультета Московского государственного университета – продуцент лонголитина – комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена.

2. Применение лонголитина – комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена в качестве наружного средства лечения тромбозов.

РИСУНКИ

QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Институт молекулярной генетики Российской академии наук

Вид лицензии*: ИЛ

Лицензиат(ы): Общество с ограниченной ответственностью “Лонгофарм”

Договор № РД0011930 зарегистрирован 11.09.2006

Извещение опубликовано: 20.10.2006 БИ: 29/2006

* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия

QZ4A – Регистрация изменений (дополнений) лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Институт молекулярной генетики Российской академии наук

Вид лицензии*: ИЛ

Лицензиат(ы): Общество с ограниченной ответственностью “Лонгофарм”

Характер внесенных изменений (дополнений):

расторжение договора №РД0011930 по обоюдному согласию сторон.

Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения:

11.09.2006 № РД0011930

Извещение опубликовано: 10.01.2009 БИ: 01/2009

* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия