Патент на изобретение №2182529

(54) КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ: BACILLUS SPECIES, AEROMONAS SPECIES, ALCALIGENES EUTROPHUS, ALCALIGENES DENITRIFICANS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ПОЧВОГРУНТОВ И ВОД ОТ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при биологической очистке нефтяного загрязнения почв, почвогрунтов и вод на территориях нефтебаз, нефтепромыслов, промышленных предприятий и других объектах. Консорциум выделен из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами, прибрежной зоны юга Дальнего Востока. Это природные ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов, которые сформировались в почве в результате длительного воздействия нефтепродуктов на почвенную биоту. Окислительная активность консорциума по конечному продукту окисления составляет 2091 мг СО₂ за 30 сут. Преимущество консорциума заключается в способности расти на обедненной питательной среде, а также с высокой скоростью окислять нефть и нефтепродукты.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при биологической очистке нефтяного загрязнения почв, почвогрунтов и вод на территориях нефтебаз, нефтепромыслов, промышленных предприятий и других объектах.

Известен консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов: Alcaligenes denitrificans, Bacillus species, Pseudomonas putida, Aeromonas species, предназначенный для очистки почв, почвогрунтов, вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности и выделенный из почв, загрязненных нефтепродуктами, прибрежной зоны юга Дальнего Востока. Окислительная способность консорциума составляет 1981 мг СО₂ за 30 сут (патент РФ 2115629, кл. С 02 F 3/34, публ. 1998).

Недостатком консорциума является низкая окислительная способность.

Известен консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов: Aeromonas species, Alcaligenes denitrificans, Arthrobacter species, предназначенный для очистки почв, почвогрунтов, вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности и выделенный из почв, загрязненных нефтепродуктами, прибрежной зоны юга Дальнего Востока. Окислительная способность консорциума составляет 2041 мг СО₂ за 30 сут (патент РФ 2127310, кл. С 12 N 1/20, публ. 1999).

Недостатком консорциума является низкая окислительная способность.

Задача изобретения – получение консорциума штаммов микроорганизмов-деструкторов для очистки почв, почвогрунтов и вод от нефтяных загрязнений.

Для решения поставленной задачи из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами, прибрежной экосистемы юга Дальнего Востока (морской порт г. Владивостока), выделен консорциум микроорганизмов-деструкторов: Bacillus species КММ НФ 8-3 (КММ НФ – коллекция морских нефтеокисляющих микроорганизмов), Aeromonas species КММ НФ 8-18, Alcaligenes eutrophus КММ НФ 8-8, Alcaligenes eutrophus КММ НФ 8-10, Alcaligenes denitrificans КММ НФ 8-12.

Это природные ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов, которые сформировались в почве в результате длительного воздействия на нее нефтепродуктов.

Выделенные штаммы микроорганизмов депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, где им присвоены номера ВКМ В-2078 Д, ВКМ В-2079 Д, ВКМ В-2075 Д, ВКМ В-2076, ВКМ В-2077 Д соответственно.

Для характеристики структуры консорциума применяли два критерия широко используемых в эколого-микробиологическом анализе: частота встречаемости и оценка доминантности различных видов микроорганизмов.

В данном сообществе микроорганизмы рода Alcaligenes – доминантные виды и относятся к типично часто встречаемым видам (48%). Виды Bacillus species и Aeromonas species относятся к содоминантным культурам (по 26%).

Таким образом, штаммы микроорганизмов в консорциуме представлены в следующих количествах, %:
Bacillus species КММ НФ 8-3 – 26
Aeromonas species КММ НФ 8-18 – 26
Крахмал, агар-агар, желатин не гидролизуют. Твин-80 гидролизуют. Арабинозу, рибозу, сорбозу, лактозу, меллибиозу, трегалозу не утилизируют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4-35^oС, рН 7,0-7,5. Не патогенен.

Характеристика штамма Alcaligenes eutrophus КММ НФ 8-10.

Морфолого-культуральные признаки. Одиночные палочки размером 1,0х2,0 мкм, подвижные, перетрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют растекающиеся, полупрозрачные слизистые колонии беловатого цвета. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный. Оксидазо- и каталазоположительные. Уреазу не образуют. Крахмал, агар-агар, желатин не гидролизуют. Твин-80 гидролизуют. Арабинозу, рибозу, сорбозу, лактозу, меллибиозу, трегалозу не утилизируют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4-35^oС, рН 7,0-7,5. Не патогенен.

Характеристика штамма Alkaligenes denitrificans КММ НФ 8-12.

Морфолого-культуральные признаки. Одиночные прямые палочки размером 0,8х1,8 мкм, перетрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют круглые, гладкие полупрозрачные слизистые колонии желтоватого оттенка. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы со строго дыхательным типом метаболизма. Оксидазо- и каталазоположительные. Уреазу не образуют. Крахмал, твин-80, желатин не гидролизуют. Сорбозу, раффинозу, лактозу, меллибиозу, трегалозу не утилизируют. Способность окислять углеводороды нефти высокая. Температура роста 4-35^oС, рН 7,0-7,5. Не патогенен.

Предлагаемый консорциум микроорганизмов хорошо растет на жидкой среде Ворошиловой – Диановой следующего состава, г/л: NH₄NO₃ – 1,0, К₂НРO₄ – 1,0, КН₂РO₄, – 1,0, MgSO₄ – 0,2, CaCl₂, – 0,02, FeCl – 2 капли концентрированного раствора, вода дистиллированная – 1000 мл.

Alcaligenes eutrophus KMM НФ 8-8 – 16%
Alcaligenes eutrophus KMM НФ 8-10 – 16%
Alcaligenes denitrificans KMM НФ 8-12 – 16%
Характеристика штамма Bacillus species КММ НФ 8-3.

Морфолого-культуральные признаки.

Клетки представлены крупными неподвижными палочками размером 1,2х2,6 мкм. Споры элипсовидные, по одной в каждой клетке. Окраска по Грамму вариабельная. На агаризованных средах образуют округлые, беловатые, слизистые колонии. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства.

Хемоорганотрофы. Метаболизм и дыхательный, и бродильный. Оксидазоотрицательные, каталазоположительные. Крахмал, твин-80, желатин гидролизуют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4-35^oС, рН 7,0-7,5. Не патогенен.

Характеристика штамма Aeromonas species КММ НФ 8-18.

Морфолого-культуральные признаки. Палочки с закругленными концами, почти овоидные, размером 1,0х1,8 мкм. Движение направленное. Грамотрицательные. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм и дыхательный, и бродильный. Оксидазо- и каталазоположительные. Глюкозу, фруктозу, мальтозу, трегалозу утилизируют. Гидролизуют казеин, желатин, крахмал. Сорбозу, ксилозу не сбраживают. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4-30^oС, рН 7,0-7,5, не патогенен.

Характеристика штамма Alcaligenes eutrophus КММ НФ 8-8.

Морфолого-культуральные признаки. Одиночные палочки размером 1,0×2,0 мкм, подвижные, перетрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют растекающиеся, полупрозрачные слизистые колонии беловатого цвета. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный. Оксидазо- и каталазоположительные. Уреазу не образуют.

В качестве единственного источника углерода добавляют 10 мл нефтепродукта. Оптимальная температура роста 25-30^oС, рН 7,0-7,2.

Интенсивный рост консорциума наблюдается при использовании среды следующего состава, г/л: К₂НРO₄ – 10,0, КН₂РO₄ – 1,0, NH₄NO₃ – 2,0, вода дистиллированная – 1000 мл, нефтепродукт – 10 мл.

Активному нарастанию биомассы консорциума способствует среда, состоящая из 0,3% водного раствора нитроаммофоски, где азот, фосфор и калий сбалансированы по 17%.

Заявленный консорциум был выделен из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами, путем высева почвенного образца на агаризованную и жидкую питательные среды. Чтобы повысить активность выделенных нефтеокисляющих микроорганизмов к повышенным концентрациям нефтепродуктов, проводят их адаптацию путем частых пересевов на свежую питательную среду. Это позволяет выделить наиболее устойчивые, физиологически активные особи нефтеокисляющих микроорганизмов и получить активный консорциум штаммов микроорганизмов. Математически устанавливают, что в данном консорциуме микроорганизмы рода Alcaligenes являются доминантными и относятся к типично часто встречаемым (48%).

Из них на Alcaligenes eutrophus приходится 32% от всех изолятов в ассоциации, Alcaligenes denitrificans составляет 16% и относится к типично редким видам. Виды Bacillus species и Aeromonas species относятся к содоминантным видам (по 26%).

Окислительную активность консорциума определяют по конечному продукту окисления, т.е. по выделению СО₂.

В колбы емкостью 500 мл, соединенные последовательно герметично, вносят поглотитель углекислоты ВаОН. В колбу, где находится инокулянт, вносят 250 мл среды Ворошиловой-Диановой, 2,5 мл нефтепродукта и 5 мл трехсуточной культуры консорциума с содержанием 1,010⁵ клеток/мл. С помощью дозатора, со скоростью 34 мл/мин подают атмосферный воздух. Чтобы в колбу с инокулянтом не поступал СО₂, воздух пропускают через 2 колбы с поглотителем СО₂ и аэрация инокулянта проходит без углекислоты. После окисления нефтепродуктов в колбе с инокулянтом, аэрируемый воздух дополнительно проходит через две колбы с поглотителем СО₂, затем ВаОН оттитровывают НСl и определяют окислительную способность культуры консорциума по количеству выделенного углекислого газа.

Для установления чистоты опыта одновременно ставят при таких же условиях еще 2 контроля. Один – с реактивами без консорциума и нефтепродуктов, другой – с реактивами, нефтепродуктами, но без консорциума. В контроле содержание СО₂ не обнаружено. Длительность опыта 30 суток. Окислительная способность консорциума составляет 2091 мг СО₂.

Применение консорциума. Для очистки нефтяного пятна на почве размером 20×5,0 м, глубиной загрязнения 0,1-0,2 м с содержанием нефтепродуктов 23% берут 0,7 кг минерального удобрения нитроаммофоски, в котором азот, фосфор и калий сбалансированы по 17%, растворяют в 200 л воды и поливают участок из расчета 1 л на 1 м² за 2 дня до вспашки. После вспашки, через 2 дня вновь вносят раствор на участок из расчета 1 л/м². Это необходимо для активизации как сапрофитной, так и аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры. Через неделю после внесения минеральных удобрений вносят инокулянт консорциума (водный раствор). Титр 1,010¹² клеток в 1 мл. Норма полива 1 л/м². Через месяц содержание нефтепродукта в почве составляет 10%, через 2 месяца – 5%, через 3 месяца нефтепродуктов в почве не обнаружено.

Таким образом, предлагаемый консорциум штаммов микроорганизмов обладает большой скоростью окисления нефтепродуктов и обеспечивает высокую степень очистки от нефтяных загрязнений.

Преимуществом предлагаемого консорциума штаммов микроорганизмов является способность расти на обедненной питательной среде, а также высокая скорость окисления нефти и нефтепродуктов, что позволяет эффективно использовать его при биологической очистке почв, почвогрунтов и вод, загрязненных нефтепродуктами.

Формула изобретения

Консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов: Bacillus species ВКМ В – 2078 Д, Aeromonas species BKM В – 2079 Д, Alcaligenes eutrophus ВКМ В 2075 Д, Alcaligenes eutrophus ВКМ В – 2076 A, Alcaligenes denitrificans ВКМ В 2077 Д, используемый для очистки почв, почвогрунтов, вод от нефтяных загрязнений.