Патент на изобретение №2181891
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТИВОМИКРОБНЫМИ И ПРОТИВОВИРУСНЫМИ СВОЙСТВАМИ, IN VITRO
(57) Реферат: Изобретение относится к медицине и может быть использовано, в частности, в фармакологии. Способ выявления веществ, обладающих противомикробными и противовирусными свойствами, in vitro заключается в использовании тест-объектов. При этом в качестве тест-объекта используют фермент глутатионредуктазу и один из антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазу, или глутатионпероксидазу, или каталазу, определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть меньше 1. Способ обладает высокой специфичностью и чувствительностью. 3 табл. Изобретение относится к медицине и может быть использовано, в частности, в фармакологии. Разработка современных эффективных экспресс-методов для скрининга веществ, обладающих противомикробной и противовирусной активностью, является актуальной в связи с необходимостью сокращения сроков исследования веществ, обладающих различной биологической активностью. Эта задача может быть решена путем разработки молекулярных тест-систем с использованием ферментов в качестве тест-объектов. Противомикробную и противовирусную активность оценивают на различных моделях. Так известно определение противовирусной активности испытуемого соединения методом скрининга по отношению к следующим тест-вирусам: а) РНК-содержащим КА 13 (Flores), KB 3 (Nancy), ECHO 11 (Upsala), ВВС (Indiana), б) ДНК-содержащему ВПГ-1 (патент РФ 2072865). Известно определение противовирусной активности с использованием в качестве тест-объекта микроорганизмов, при этом определялась полная задержка роста микроорганизмов с добавлением исследуемого вещества по сравнению с контролем (без добавления исследуемого вещества) (патент РФ 2105564). Известны стандартные микробиологические методы, позволяющие выявлять вещества, обладающие противомикробной активностью, с помощью тест-объекта, в качестве которого используется набор штаммов, и позволяющие выявлять вещества, обладающие противовирусной активностью с помощью тест-объекта, в качестве которого используются культуры клеток /Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармокологических веществ, Минздрав РФ, 2000г/. Данный метод выбран нами в качестве прототипа. Недостатком этих способов выявления веществ, обладающих противомикробными и противовирусными свойствами, является большая трудоемкость и необходимость постоянного поддерживания клеточной популяции в условиях длительного перевиваемого культивирования и контроля за сохранностью и чистотой стандартных штаммов микроорганизмов, что значительно увеличивает экономические и временные затраты на первичный скрининг. Цель данного изобретения – создание способа, обладающего высокой специфичностью и чувствительностью, хорошей воспроизводимостью, меньшей трудоемкостью, более высокой экономичностью, чем известные способы. Поставленная цель достигается за счет использования в качестве тест-объектов фермента глутатионредуктазы и одного из антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы, или глутатионпероксидазы, или каталазы, определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть меньше 1. Фермент глутатионредуктаза (далее ГР) катализирует восстановление дисульфида глутатиона (окисленного глутатиона) в глутатион (восстановленный глутатион) /Классификатор ферментов, М., 1995 год, 1.6.4.2./. Фермент супероксиддисмутаза (далее СОД) катализирует реакцию дисмутации супероксидного аниона (02 –) /Классификатор ферментов, М., 1995 год, 1.15.11. /. Фермент глутатионпероксидаза (далее ГП) катализирует окисление восстановленной формы глутатиона в присутствии гидропероксида (Н2O2) или липидного пероксида (LOOH) /Классификатор ферментов, М., 1995 год, 1.11.1.9./. Фермент каталаза расщепляет перекись водорода и присутствует во всех животных и растительных клетках и органах /Классификатор ферментов, М., 1995 год, 1.11.1.6./. Для доказательства специфичности заявляемого способа выявления веществ, обладающих противомикробными и противовирусными свойствами in vitro, с применением заявляемых ферментов были изучены препараты: – с установленной противомикробной и противовирусной активностью, принадлежащие к различным химическим классам; – с неизвестной биологической активностью; – вещества, относящиеся к другим фармакологическим группам и не обладающие искомыми свойствами. Изученные вещества и их характеристика приведены в таблице 1 и 3. Изучали влияние веществ, указанных в таблице 1, на скорость реакций, катализируемых ферментами ГР, СОД, ГП и КАТ in vitro. Скорости реакций, катализируемых заявляемыми ферментами, определяли спектрофотометрически известными методами. Скорость ГП и ГР реакций определяли по убыли НАДФН (никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный) при длине волны 340 нм. Скорость СОД-реакции определяли в присутствии тетразолия нитросинего и фенозинмета сульфата по приросту НАДН (никотинамидадениндинуклеотид восстановленный) при длине волны 540 нм. Скорость КАТ-реакции определяли по убыли субстрата (H2O2), которую измеряли в виде комплекса с молибдатом аммония по поглощению при длине волны 410 нм. Измеряли скорость ферментативной реакции без добавления изучаемого вещества (контроль) и после добавления изучаемого вещества (опыт). Полученные результаты представлены в таблице 2. В таблице 2 приводятся средние арифметические значения из 2-3-х параллельных определений и стандартные отклонения среднего результата (М  m). В примерах приведены результаты, полученные при оптимальных концентрациях вещества в пробе. Из представленных примеров видно, что вещества с противомикробными и противовирусными свойствами угнетают ферменты ГР, СОД, ГП, КАТ. Вещества, не обладающие противомикробными и противовирусными свойствами, не угнетают заявляемые ферменты.
Выводы: Заявляемый способ выявления веществ, обладающих противомикробной и противовирусной активностью, подтвердил наличие у объектов 1-7 известной противомикробной и противовирусной активности. У изучаемого объекта 8 и 9 была определена заявляемым способом противомикробная и противовирусная активность. У объекта 10, обладающего другими фармакологическими свойствами, не обнаружена противомикробная и противовирусная активности.
Формула изобретения
РИСУНКИ
QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения
Лицензиар(ы): Научно-исследовательский и учебно-методический центр биомедицинских технологий ВИЛАР
Вид лицензии*: НИЛ
Лицензиат(ы): ЗАО “Фармцентр ВИЛАР”
Договор № РД0008769 зарегистрирован 11.05.2006
Извещение опубликовано: 7.06.2006 БИ: 18/2006
* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия
QZ4A – Регистрация изменений (дополнений) лицензионного договора на использование изобретения
Лицензиар(ы): Научно-исследовательский и учебно-методический центр биомедицинских технологий ВИЛАР
Вид лицензии*: НИЛ
Лицензиат(ы): Закрытое акционерное общество “Фармцентр ВИЛАР”
Характер внесенных изменений (дополнений):
Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения:
Извещение опубликовано: 10.10.2006 БИ: 28/2006
* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия
PD4A – Изменение наименования обладателя патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение
(73) Новое наименование патентообладателя:
Адрес для переписки:
Извещение опубликовано: 10.10.2008 БИ: 28/2008
|
||||||||||||||||||||||||||
