Патент на изобретение №2181890
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ АДАПТОГЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ, IN VITRO
(57) Реферат: Изобретение относится к медицине и может быть использовано, в частности, в фармакологии. При этом в качестве тест-объектов используют ферменты глутатионредуктазу или супероксиддисмутазу и глутатионпероксидазу или катализу, определяют скорости ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте глутатионредуктазе или супероксиддисмутазе после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть больше 1, а соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте каталазе или глутатионпероксидазе после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть меньше 1. Изобретение позволяет определять вещества с высокой точностью. 3 табл. Изобретение относится к медицине и может быть использовано, в частности, в фармакологии. Разработка современных эффективных экспресс-методов для скрининга веществ, обладающих адаптогенной активностью, является актуальной в связи с необходимостью сокращения сроков исследования веществ, обладающих различной биологической активностью. Эта задача может быть решена путем разработки молекулярных тест-систем с использованием ферментов в качестве тест-объектов. Адаптогенную активность оценивают на различных моделях с использованием в качестве тест-объекта подопытных животных, в частности крыс и мышей. Известен способ выявления веществ, обладающих адаптогенной активностью, заключающийся в определении физической работоспособности животных (патент РФ 2135198). Опыты проводили на белых беспородных крысах, одной группе которых вводили внутрижелудочно в эксперементально-терапевтической дозе исследуемое вещество, а другой группе препарат сравнения, один раз в день в течение 10 суток. Влияние вещества на выносливость животных определяли по длительности бега в третбане до полного утомления. Известен способ выявления веществ, обладающих адаптогенной активностью, заключающийся в определении иммунного статуса (патент РФ 2108108). Исследования проводили на мышах линии BDF1 и BALB/c. Известно, что защита организма от вредного воздействия окружающей среды во многом зависит от состояния иммунной системы, базирующейся на клеточном и гуморальном уровнях. Влияние изучаемого средства на иммунный статус оценивали по изменению активности НК-клеток и пролиферативной активности спленоцитов, стимулированных in vitro митогеном, а также по пролиферативной и цитолитической активности Т-киллеров в смешенной культуре лимфоцитов. Наиболее близким способом к заявляемому относится известный физиологический метод определения адаптогенной активности с использованием в качестве тест-объекта мышей или крыс. Метод заключается в определении физической работоспособности, выносливости, устойчивости к экстремальным температурам, к гипоксии [Razbun W.B., Bovis M.G.., Holle Sahau A.M. Curr. Eye Res., 1986. V.5 – P.195-199]. Недостатком известных способов выявления веществ, обладающих адаптогенной активностью, является большая трудоемкость и необходимость использования большого количества лабораторных животных, длительность эксперемента, что значительно увеличивает экономические и временные затраты на первичный скрининг. Цель данного изобретения – создание способа, обладающего высокой специфичностью и чувствительностью, хорошей воспроизводимостью, меньшей трудоемкостью, более высокой экономичностью, чем известные способы. Поставленная цель достигается за счет использования в качестве тест-объектов ферментов глутатионредуктазы или супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы или каталазы, определения скорости ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте глутатионредуктазе или супероксиддисмутазе после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть больше 1, а соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте каталазе или глутатионпероксидазе после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть меньше 1. Фермент глутатионредуктаза (далее ГР) катализирует восстановление дисульфида глутатиона (окисленного глутатиона) в глутатион (восстановленный глутатион) [Классификатор ферментов. М., 1995 г., 1.6.4.2.]. Фермент супероксиддисмутаза (далее СОД) катализирует реакцию дисмутации супероксидного аниона (О2) [Классификатор ферментов. М., 1995 г., 1.15.11.]. Фермент глутатионпероксидаза (далее ГП) катализирует окисление восстановленной формы глутатиона в присутствии гидропероксида (Н2О2) или липидного пероксида (LOOH) [Классификатор ферментов. М.,1995 г., 1.11.1.9.]. Фермент каталаза расщепляет перекись водорода и присутствует во всех животных и растительных клетках и органах [Классификатор ферментов. M., 1995 г., 1.11.1.6.]. Для доказательства специфичности заявляемого способа выявления веществ, обладающих адаптогенной активностью, in vitro, с применением заявляемых ферментов были изучены вещества: – с установленной адаптогенной активностью, принадлежащие к различным химическим классам; – с неизвестной биологической активностью; – вещества, относящиеся к другим фармакологическим группам и не обладающие искомыми свойствами. Изученные вещества и их характеристика приведены в таблицах 1 и 3. Изучали влияние веществ, указанных в таблице 1 на скорость реакций, катализируемых ферментами ГР, СОД, ГП, и КАТ in vitro. Скорости реакций, катализируемых заявляемыми ферментами, определяли спектрофотометрически известными методами. Скорость ГП и ГР реакций определяли по убыли НАДФН (никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный ) при длине волны 340 нм. Скорость СОД-реакции определяли в присутствии тетразолия нитросинего и феназинметасульфата по приросту НАДН (никотинамидадениндинуклеотид восстановленный) при длине волны 540 нм. Скорость КАТ-реакции определяли по убыли субстрата (Н2О2), которую измеряли в виде комплекса с молибдатом аммония по поглощению при длине волны 410 нм. Измеряли скорость ферментативной реакции без добавления изучаемого вещества (контроль) и после добавления изучаемого вещества (опыт). Полученные результаты представлены в таблице 2. В таблице 2 приводятся средние арифметические значения из 2-3-х параллельных определений и стандартные отклонения среднего результата (М  m). В примерах приведены результаты, полученные при оптимальных концентрациях вещества в пробе. Из представленных примеров видно, что вещества с адаптогенной активностью активизируют ферменты ГР, СОД и угнетают ферменты ГП, КАТ.
Из представленных примеров видно, что вещества, обладающие адаптогенной активностью, при непосредственном взаимодействии с ферментами повышают скорость глутатионредуктазной и супероксиддисмутазной реакций, снижая при этом скорость каталазной и глутатионпероксидазной реакций ( 1-7). Вещества, не обладающие адаптогенными свойствами, влияют на эти скорости иным способом. Например, активируют оба фермента ( 10), ингибируют оба фермента ( 8, 9).
Способ выявления веществ, обладающих адаптогенной активностью, на заявляемых четырех ферментах позволяет добиться высокой степени точности при определении искомой активности.
Формула изобретения
РИСУНКИ
PD4A – Изменение наименования обладателя патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение
(73) Новое наименование патентообладателя:
Адрес для переписки:
Извещение опубликовано: 10.10.2008 БИ: 28/2008
|
||||||||||||||||||||||||||
