Патент на изобретение №2181886

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННОСТИ ЭНТЕРОВИРУСНЫХ ШТАММОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ДЕТЕЙ, БОЛЬНЫХ РАЗЛИЧНЫМИ ФОРМАМИ НЕЙРОИНФЕКЦИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, в эпидемические и межэпидемические периоды. Сущность способа заключается в индикации репродукции вируса в тканевой культуре при 37^oС и тестировании синтеза -интерферона в лейкоцитах человека, при этом дополнительно используют Rct-маркеры , при 28 и 40^oС определяют репродукционную активность с последующим выявлением синтезируемого альфа- и гамма-интерферона в крови доноров и определяют степень патоггенности выделенного штамма энтеровируса и по превалированию накопления вируса при 40^oС по сравнению с 28^oС и по 8-16-кратному увеличению синтеза альфа-интерферона над гамма-интерфероном. Преимущество изобретения заключается в повышении специфичности способа. 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к определению патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, в эпидемические и межэпидемические периоды.

По данным вирусологической лаборатории института детских инфекций в структуре всех обнаруженных сероваров энтеровирусов за 1995-1999 гг., до 15% составляли “новые”, не встречающиеся в последние 20 лет в нашем регионе штаммы. Это обусловлено большими миграционными волнами, особенно из южных стран ближнего зарубежья.

В связи с этим вирусологическим лабораториям принадлежит решающая роль не только в обнаружении таких штаммов, но и определении их патогенности для детей.

Известно, что Rct-маркер является одним из основных маркеров вирусной патогенности, так как штаммы, размножающиеся в условиях повышенной температуры, более устойчивы и не только активнее репродуцируются в месте первичного размножения, но и имеют особенность диссеминировать по организму. Еще в 60-е годы Львовым и сотрудниками было показано, что аттенуация вирусов полиомиелита, относящихся к группе энтеровирусов, легко осуществляется путем пассирования их при пониженной температуре. Если же аттенуированные вирусы полиомиелита “приучить” к размножению в культуре ткани при +40^oС, то происходит постепенное вытеснение патогенных вариантов и вирус приобретает нейропатогенные свойства. Связь между патогенностью и Rct-маркером известна у арбовирусов, миксовирусов и других. С другой стороны, одним из показателей вирулентности является отношение выделенных изолятов от больных к системе интерферона. Известно, что штаммы различных вирусов, выделенных от больных, обладали широкой вариабельностью в отношении продукции или интерферона и чувствительностью к интерферону (Came Paul E., Schafer Thomas N., Silver Gerald H. Sensitivity of rhinoviruseas to human leukocyte and fibroblast interferons. “J. Infect. Diseases”, 1976, 133, 6, suppl. To, A.136-A.139).

Trousdael et al. установили, что дикий вирус Коксаки В₃ обладал большей репродукционной способностью у мышей по сравнению с ТС-мутантами (Rсt 28) и вырабатывал большие концентрации интерферона у этих животных. Работы, касающиеся изучения интерферонных характеристик энтероизолятов от больных, различающихся по температурочувствительности, отсутствуют. В то же время для более полной характеристики выделенных штаммов энтеровирусов, учитывая их многообразие, сочетанная характеристика температурочувствительности и продукции интерферона является чрезвычайно важной (Trousdael Melvin D., Poque Ronald E. , Nealon Timothy, Gauntt Charles J. Assessment of coxsackie virus В₃ ts mutants for induction of myocarditis in a murine model. “Infec. and Immun.”, 1979, 23, 2, 486-495).

Все представленные выше аналоги изучают либо один из этих маркеров, либо изучаются на животных с вирусными штаммами, длительно пассируемыми в лабораториях, а не с первично выделенными изолятами.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ оценки изолята энтеровируса 71 типа в отношении его репродукции при 35 и 39,5^oС (Hagiwara A. , Yoneyama Т., Takami S., Hashimoto I.Genetic and phenotypic characteristics of enterovirus 71 isolates from patients with encephalitis and with hand, foot and mouth disease. “Arch. Virol.”, 1984, 79, 3-4, 273-283). Авторами показано, что 57,1% штаммов, выделенных от больных менингоэнцефалитом и ящуром, имели более высокий Rct-маркер (39,5^o) и обладали большей нейровирулентностью для обезьян. В то же время существенных изменений в структуре РНК таких изолятов не обранужено.

Фингер-принты этих РНК не отличались от аналогичных фингер-принтов температурочувствительных изолятов. Авторы делают достоверный вывод о том, что нейровирулентность энтеровирусных штаммов, главным образом, оценивается по Rct-маркеру.

Более того, авторы заключают, что присутствует достоверная корреляция между нейровирулентностью и генетическими факторами, влияющими на репродукцию энтеровируса в культуре ткани почки обезьян при повышенной температуре.

В то же время недостатками прототипа являются следующие моменты:
– авторы используют очищенные энтеровирусы 71 типа, а не первично выделенные изоляты;
– тестировался только один маркер – температурочувствительность, при выполнении способа не исследовалась способность штаммов продуцировать различные типы интерферонов в клетках-продуцентах. В то же время способность к продукции интерферона является одним из свойств патогенности энтеровирусов.

Устранению данных недостатков может помочь предлагаемый авторами способ определения патогенности энтеровирусов.

Поставленная цель достигается тем, что оценивают репродукционную активность при 40 и 28^oС с последующим выявлением синтезируемого альфа- и гамма-интерферона в изучаемых изолятах в крови доноров и по превалированию накопления вируса при 40^oC по сравнению с 28^oС, а также 8-16-кратному увеличению синтеза альфа-интерферона над гамма-интерфероном устанавливают степень патогенности выделенного штамма энтеровируса.

Отличительными признаками заявляемого способа является обязательное использование двух маркеров патогенности: температурорезистентного и интерферонного. Оценка вирулентности по одному фактору не правомочна, так как при наличии одного маркера патогенности (температурорезистентности Rсt 39-40) выделенный изолят может иметь высокую способность продуцировать -инф. и его вирулентность, в частности способность вызывать осложненные формы, будет сниженной из-за внутриклеточного защитного действия, вырабатываемого организмом интерферона. С другой стороны, при наличии низкой интерфероно-продуцирующей способности выделенного вируса его репродукционная активность при повышенной температуре может быть умеренной или низкой, в связи с чем его вирулентность будет слабой.

Способ осуществляется следующим образом.

В культуру ткани фибробластов человеческого эмбрионного легкого в виде сплошного монослоя в лунках полистероловых панелей, вносятся первичный 2% экстракт отработанных по классическим методам фекалиев в объеме 100 мкл. Экстракт вносится в десятичной раститровке 1:10 до 1:100000 по 2 лунки на каждое разведение. Исследуемые три панели, приготовленные вышеописанным способом, помещаются в термостат с температурой 40, 37 и 28^oС. Через 48 часов проводят контрольную оценку ЦПД. При его наличии в одной из инкубируемых панелей, изымается надосадочная жидкость из 1-й лунки, где обнаружено цитопатогенное действие (это могут быть панели на 40 или 28^oС). Эта надосадочная жидкость в объеме 50 мкл вносится в 0,4 мл гепаринизированной венозной крови нормального, здорового донора и помещается в термостат при 37^oС на 24 часа. Такую же процедуру проводят и с исследуемым материалом, помещенным на 37^oС, в независимости от наличия или отсутствия ЦПД. Данная процедура предназначена для оценки способности выделенного штамма индуцировать интерферон в лейкоцитах крови человека.

Сыворотку после индукции интерферона титруют на наличие различных типов интерферона в культуре ткани L-41. Дифференцировку -, – и -интерферона проводят путем отработки сывороток 1-нормальной соляной кислотой и температурной инактивации при 56^o 30 минут. Титры выявляемого интерферона сравнивают у вирусов, полученных при 40^o (или 28^o) и 37^oС. Контролем в определении интерферона являются пробы, полученные при внесении в донорскую кровь вируса Сендай, индицирующего стандартный уровень -интерферона в пределах 256МЕ/мл – 512МЕ/мл. Сравнение репродукционной активности выделяемого изолята при 40^o (или 28^o) и 37^oС с продукцией интерферона в донорских лейкоцитах при аналогичных температурах позволяет установить:
– эндогенную принадлежность штаммов, циркулирующих в регионе (доминантных и сопутствующих);
– “привнесенные” в регион штаммы:
a) южный вариант;
b) северный вариант;
– окончательную вирулентность штамма.

Дифференцировка вирулентных и авирулентных штаммов проводится по разнице в активности выделенного штамма при 40^oC по сравнению с 37^oC (или 28^oC), а также по большей продукции альфа-интерферона в клетках крови доноров при внесении в клетки штаммов, выделенных при 40^oC, по сравнению со штаммами, выделенными при 37^oC (или 28^oC). В то же время уровень этого интерферона при вирулентных штаммах существенно снижен и не превышает 16-32 MЕ (международных единиц). В соответствии с этим концентрация гамма-интерферона у таких штаммов минимальна и не превышает 2-4 MЕ. Соотношение альфа-интерферона к гамма-интерферону должно быть у вирулентных вирусов в 8-16-кратным. Если уровень гамма-интерферона равен или превышает уровень альфа-интерферона, штаммы этеровирусов оказываются авирулентными и не вызывают острой энтеровирусной инфекции (в частности, серозного менингита). В то же время, если уровень альфа-интерфорона у испытуемого штамма достаточно высок (в пределах 64 MЕ и более), то выработка высоких концентраций интероферона в организме ребенка ограничивает репродукцию такого вируса и острого заболевания не происходит. В таблице приводятся примеры таких выделенных штаммов энтеровирусов с их характеристиками.

Обосновываются эти варианты по Rct-маркированию и способностью этих штаммов вырабатывать интерферон. Оценка вышесказанных свойств основывается на следующем:
I. Эндогенные варианты энтеровирусов, циркулирующих в регионе, без связи с пейзажем в регионе характеризуются повышенным Rct-маркером, т.е. выделение вируса легче осуществляется и он накапливается в больших титрах с культивированием его в культуре при 37^oС. Репродукция такого штамма при 40^oС резко отстает или полностью отсутствует, тогда как при 28^oС эти титры незначительно (в пределах 2-2,5 lg) снижены при сравнении с таковыми при 37^oС. Если у этих штаммов продукция интерферона находится в пределах 32-128 МЕ/мл, то эти вирусы не отличаются значительной вирулентностью и до 72% выделяется от больных без клинических проявлений, осложненных энтеровирусной инфекцией (менингиты, менингоэнцефалиты, миокардиты и др.). При минимальной продукции интерферона (<8 МЕ/мл) такие штаммы с Rсt 37 являются основными возбудителями осложненных форм нейроинфекций в регионе. Соответственно частота обнаружения таких штаммов при осложненных формах составляет 81,4%.

В то же время в популяции региона существуют эндогенные штаммы, изоляты которых имеют Rсt 28, т.е. они лучше размножаются при 28^oС, чем при 37^oС или 40^oС, но продукция – и -интерферона у них обязательно существенно снижена (<4 МЕ/мл).

Эти штаммы, как правило, обнаруживаются у больных в периоды подъема простудных заболеваний, т.е. в осенне-зимнее время, когда они активируются при дополнительном охлаждении носовых раковин (Маянский А.Н. Клиническая медицина, 1998, 12, с.19-25).

II. Привнесенные или новые для региона штаммы подразделяются на две группы: северные и южные, т.е. размножающиеся лучше при 28 и 40^oС соответственно. Нами обнаружено, что примерно в 15% из всех выделенных серотипов энтеровирусов принадлежит к “новым” для региона СПб штаммам. В 100% это были южные штаммы, т.е. лучше размножающиеся при повышенной температуре.

Учитывая, что первичное размножение энтеровирусов происходит в эпителии носовых раковин, подверженных температуре окружающей среды, такие штаммы являются эндемичными для южных регионов земного шара. В регионах с умеренной континентальной изотермой они попадают эксквизитно и являются экзогенными. По нашим предположениям, большая часть их погибает, но при создании благоприятных условий (теплое лето, ослабление резистентности организма и т.д. ), они пассируются у детей, вызывая ограниченные осложненные формы энтеровирусных инфекций. В то же время выделенные нами штаммы такого рода в 70% обнаруживались у временных переселенцев из южных регионов России и в 30% у коренных. По нашему мнению, они не вызвали развития больших эпидемических вспышек энтеровирусной инфекции в связи с тем, что в отличие от эндогенных штаммов способность их к продукции интерферона была высокой (64-128 МЕ/мл). В связи с этим видимо происходит самоограничение вирусной репродукции, учитывая, что при попадании в кишечник эти вирусы падают в своей репродукционной активности на фоне уже выработанных высоких концентраций -интерферона при отсутствии -интерферона.

Основываясь на предлагаемом способе, отражающем зависимость репродукции вируса от температуры и способности продуцировать интерферон, оказывается возможным тестировать не только южные штаммы, но и штаммы, привнесенные в регион из северных стран. В этом случае, очевидно, что такие вирусы будут существенно лучше размножаться при низкой температере (28^oC) по сравнению с 37^oС, а при 40^oС их репродукционная активность исчезает. Такие штаммы будут вызывать осложненные формы нейровирусных инфекций только при полном отсутствии способности индуцировать – и -интерферон.

III. Таким образом, представлен способ, с помощью которого удается дифференцировать эндогенные, вирулентные (Rсt 37 и ИФ_{8-16 МЕ}) и авирулентные (Rсt 37 и ИФ_{64-128 МЕ}) от южных вариантов (Rсt 40 и ИФ_{64-128 МЕ}) вирулентных, вызывающих спородические случаи заболевания и вирулентных (Rсt 40 и ИФ_8МЕ), могущих вызвать эпидемические вспышки и северных сероваров, никогда не вызывающих эпидемического подъема заболевания, в связи с резким снижением репродукции вируса при 28^oС.

Формула изобретения

Способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных у детей, больных различными формами нейроинфекций, путем индикации репродукции вируса в тканевой культуре с использованием маркера Rct 40, отличающийся тем, что используют два маркера патогенности, сначала определяют дополнительно репродукционную активность вируса по маркеру Rсt 28 с последующим выявлением этими изолятами синтеза альфа- и гамма-интерферона в лейкоцитах крови человека и по превалированию репродукции вируса при 40^oС по сравнению с 28^oС, а также по 8-16-кратному увеличению синтеза альфа-интерферона над гамма-интерфероном считают выделенный штамм энтеровируса патогенным.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 27.01.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 10-2003

Извещение опубликовано: 10.04.2003