Патент на изобретение №2180584

(54) ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к созданию церебропротектора растительного происхождения с антигипоксической активностью для профилактики состояний, сопровождающихся гипоксией. Предложен церебропротектор из экстракта всех видов водяники, полученного путем трехступенчатого экстрагирования хлороформом в соотношении сырье : экстрагент 1 : 10, ацетоном – экстракт : экстрагент 1 : 10, гексном – экстракт : экстрагент 1 : 5. Предложен также способ получения церебропротектора. Предложенный церебропротектор обладает антигипоксической активностью в диапозоне больших доз – 200 мг/кг, низкими побочными эффектами и малой токсичностью. 2 с. и 3 з.п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается способа получения церебропротектора из растительного сырья. Оно может быть использовано для фармакологической коррекции состояний сопровождающихся гипоксией мозга и усилением процессов перекисного окисления липидов (сопровождают любой патологический процесс в организме).

Известным церебропротектором синтетического происхождения является пирацетам [6, 12] . Однако большое число случаев непереносимости синтетических лекарственных препаратов, побочные эффекты при их применении, а иногда и возникновение лекарственной болезни из-за их токсичности заставляет обращать внимание на возможность использования в медицине препаратов растительного происхождения, не создающих ксенобиотической нагрузки на организм.

В настоящее время в медицине известно использование церебропротекторов с антигипоксической активностью растительного происхождения для профилактики состояний, сопровождающихся гипоксией, например бадан толстолистный [8].

Прототипом является церебропротектор – экстракт шлемника байкальского (ЭШБ).

Шлемник байкальский это многолетнее травянистое растение, содержащее ряд биологически активных веществ: флавоноиды, дубильные вещества пирокатехиновой группы, эфирные масла [2].

Известен способ получения церебропротектора бадана толстолистного. Церебропротектор получен путем экстрагирования измельченных листьев растения 70% этиловым спиртом [9].

Наиболее близким (прототипом) способом получения церебропротектора, является способ получения шлемника байкальского. ЭШБ получен путем экстрагирования измельченной подземной части растения 70% этиловым спиртом в колбе в течение 1 часа. Объединенные извлечения упаривают под вакуумом досуха [7]. Однако данные церебропротекторы обладают антигипоксической активностью в диапазоне больших доз – 200 мг/кг.

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала средств защиты головного мозга за счет обнаружения препаратов с более высокой специфической активностью, низкими побочными эффектами, малой токсичностью и действующих в диапазоне малых доз (2-5 мг/кг).

Поставленная задача решается церебропротектором – высушенный экстракт из воздушно-сухих побегов всех видов водяники, полученного путем трехступенчатого экстрагирования хлороформом в соотношении сырье : экстрагент 1 : 10, ацетоном экстракт : экстрагент 1 : 10, гексаном экстракт : экстрагент 1 : 5. Причем экстракцию хлороформом проводят трижды при температуре 60-62^oС в течение одного часа, экстракцию ацетоном проводят трижды при комнатной температуре, ацетоновый экстракт выпаривают и высушивают до получения вязкой массы, высушенный ацетоновый экстракт экстрагируют трижды гексаном при температуре 60^oС, отфильтровывают теплым и подвергают сублимационной сушке.

Растения рода водяника и в особенности водяника черная в народной медицине применяют как средство купирования судорожных и эпилептиформных припадков, лечения длительно не заживающих ран, при заболеваниях печени и почек. Экстракты видов водяники были нами исследованы как противосудорожный препарат [5, 10]. В качестве церебропротектора с антигипоксической активностью в литературе не описан. Виды водяники – Empetrum nigrum, Empetrum hermaphroditum, Empetrum Subhobrcticum представляют собой вечнозеленые, сильно ветвистые и распластанные по почве кустарники до 1 м длиной, относящиеся к семейству Empetrceae. В побегах растения присутствуют восстанавливающие вещества (аскорбиновая кислота), тритерпеноиды (урсоловая кислота), органические кислоты (бензойная, кофейная), макроциклические алканы, дубильные вещества и флавоноиды различной степени окисленности: кемпферол, кверцетин и его гликозиды, 2, 4-дигидроксихалкон, дигидроксихалконы эмпетрон и метилэмпетрон [1].

Способ получения экстракта осуществляют следующим образом. Измельченные воздушно-сухие побеги водяники заливают хлороформом и экстрагируют трижды при температуре 60-62^oС в течение 1 часа при соотношении сырье : экстрагент 1 : 10. Полученные извлечения процеживают, объединяют и удаляют растворитель под вакуумом досуха. Сухой хлороформный экстракт при комнатной температуре трижды обрабатывают ацетоном (соотношение экстракт : экстрагент 1 : 10) при растирании до получения однородной массы, дают отстояться и фильтруют. Объединенные ацетоновые экстракты упаривают при пониженном давлении и высушивают в вакуум-сушильном шкафу до получения вязкой темно-коричневой массы (выход ацетонового экстракта по загруженному сырью составляет 8,94%). Полученный ацетоновый экстракт обрабатывают при растирании трижды теплым гексаном (60^oС) (соотношение экстракт : экстрагент 1 : 5) и отфильтровывают теплым (Э. В. 1), а оставшийся после экстракции гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы (Э.В.2). Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,4%.

Пример 1.

50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) экстрагируют трижды хлороформом (соотношение сырье : экстрагент 1 : 10) в колбе, снабженной обратным холодильником при температуре кипения растворителя (60^oС) в течение 1 часа. Объединенные извлечения упаривают под вакуумом досуха. Полученный сухой экстракт (6, 7 г) обрабатывают ацетоном трижды при комнатной температуре, растирая до получения однородной массы при соотношении хлороформный экстракт : экстрагент 1 : 10, осадок отфильтровывают, объединенные ацетоновые экстракты упаривают при пониженном давлении и сушат в вакуум-сушильном шкафу до получения темно-коричневой вязкой массы. 4,47 г ацетонового экстракта растирают с 23 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, дважды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,4%.

Пример 2.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 9 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, дважды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,9%.

Пример 3.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 14 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, дважды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,7%.

Пример 4.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 36 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, дважды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,3%.

Пример 5.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 45 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, дважды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,2%.

Пример 6.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 23 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, еще 1 раз. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 67%.

Пример 7.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 23 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, трижды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,2%.

Пример 8.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 23 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, четырежды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,0%.

Пример 9.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники гермафродитной (Empetrum hermaphroditum) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 23 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, дважды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,3%.

Пример 10.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники субголарктической (Empetrum subholarcticum) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 23 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, дважды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,2%.

В результате исследований выяснено, что все используемые виды водяники (растения рода Empetrum) имеют идентичный химический состав и незначительно отличаются по количественному содержанию.

В процессе поиска оптимальных условий получения целевого продукта после обработки гексаном ацетонового экстракта всех видов водяники было изучено влияние ряда факторов (соотношения ацетоновый экстракт – гексан, кратность экстракции, температурный режим) на выход целевого продукта (табл. 1-4). При этом установлено, что обработку гексаном ацетонового экстракта следует вести при температуре 60^oС: понижение температуры нецелесообразно, так как снижается степень очистки целевого продукта от сопутствующих веществ из-за уменьшения их растворимости в гексане; повышение температуры до температуры кипения гексана (68^oС) также нецелесообразно, т.к. это существенно не влияет на степень очистки целевого продукта (табл. 2) и ведет к значительной потере растворителя за счет интенсивного испарения.

Оптимальное соотношение сырье : экстрагент 1 : 10. При уменьшении количества хлороформа, например 1 : 7, происходит снижение степени очистки целевого продукта от сопутствующих веществ.

Оптимальное соотношение хлороформный экстракт : экстрагент 1 : 10. При уменьшении количества ацетона, например 1 : 7, происходит уменьшение выхода целевого продукта.

Оптимальное соотношение ацетоновый экстракт : экстрагент 1 : 5. При уменьшении количества гексана, например, 1 : 3, происходит снижение степени очистки целевого продукта от сопутствующих веществ. Сдвиг в сторону увеличения соотношения нецелесообразен, т. к. это существенно не влияет на выход целевого продукта (табл. 3).

Наилучшая кратность экстракции равна 3. При уменьшении кратности экстракции до 2 степень очистки целевого продукта от сопутствующих веществ уменьшается, а увеличение, например до 4, существенно не влияет на выход целевого продукта (табл. 4).

Таким образом, предлагаемый авторами способ, позволяет получить средство, обладающее значительно большей церебропротекторной активностью: положительный эффект достигнут благодаря трехступенчатой экстракции: хлороформом, ацетоном, гексаном и подобранному оптимальному режиму получения целевого продукта.

Новый способ получения экстрактов, повышающий содержание биологически активных веществ в целевом продукте, позволил нам увеличить антигипоксическую активность экстрактов растения (увеличивать время жизни животных в условиях НГГ) и тормозить в ткани мозга процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), вызванные гипоксической травмой.

В результате получили новый церебропротектор растительного происхождения. Церебропротекторное действие изучалось на предложенной модели гипоксии экспериментальным путем.

Пример 11.

Антигипоксическое действие воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) изучали на модели нормабарической гиперкапнической гипоксии (НГГ), животных помещали в сосуд объемом 0,2 л. Скрининг проводился на белых мышах (самцы, беспородные), ЭВ вводили профилактически (1 раз/сутки, 5 дней, внутрижелудочно), в дозах 2, 5, 10, 50 и 200 мг/кг. В качестве препарата сравнения использовали пирацетам в антигипоксических дозах 100, 200, 300, 400 и 500 мг/кг [3]. Контрольная группа получала эквиобъемное количество (0,3 мл/20 г) растительного масла. Последнее введение препаратов проводили за сутки до гипоксии. Регистрировали время жизни животных до первого агонального вдоха. Установлено, что экстракты водяники в отличие от пирацетама оказывают отчетливое антигипоксическое действие при НГГ. Максимальный эффект проявлялся у Э.В.1 в дозе 2 мг/кг, а Э.В.2 в дозе 5 мг/кг и составлял соответственно 18,7% и 24% увеличения времени жизни при гипоксии (р<0.05).

Пример 12.

Антигипоксическое действие воздушно-сухих побегов водяники субголарктической (Empetrum subholarcticum) изучали на модели НГТ, животных помещали в сосуд объемом 3 л. Скрининг проводился на белых крысах (самцы, беспородные), Э.В.2 вводили профилактически (1 раз/сутки, 5 дней, внутрижелудочно), в дозе 300 мг/кг [3] . Контрольная группа получала эквиобъемное количество растительного масла. Последнее введение препаратов проводили за сутки до гипоксии. Регистрировали время жизни животных до первого агонального вдоха. Установлено, что Э. В. 2 проявляет отчетливое антигипоксическое действие при НГТ, увеличивая временя жизни при гипоксии на 38,8% (р<0.05).

Пример 13.

Антиоксидантное действие воздушно-сухих побегов водяники гермафродитной (Empetrum hermaphroditum) изучали на модели ННГ в сосуде объемом 3 л. Исследование проводили на крысах (белых беспородных самцах массой 170-200 г). Э. В.1 и 2 вводили профилактически (1 раз/сутки, 5 дней внутрижелудочно) в дозе 312 мг/кг. В качестве препарата сравнения использовали пирацетам в антигипоксической дозе 400 мг/кг [3]. Контрольная группа получала эквиобъемное количество растительного масла. Последнее введение препаратов проводили за сутки до гипоксии. После появления агонального дыхания животное извлекали из сосуда, декапитировали, извлекали мозг и гомогенизировали в охлажденной до 0^oС среде гомогенизации: 2,510^-1 М КС1, 17.510^-2 М Hepes-буфер, (рН 7,2). По уровню накопления малонового диальдегида (реакция с тиобарбитуровой кислотой), регистрировали интенсивность развития спонтанного и Fe-аскорбат – индуцированного ПОЛ. Уровень накопления МДА выражали в условных единицах. ТБК-активные продукты определяли в пробе через каждые 15 минут в течение часа [4]. Исследования проводили на флуориметре Hitachi М-850 (eх = 355 нм и ем = 450 нм) [11].

Установлено, что все исследованные препараты ограничивают развитие спонтанного ПОЛ в ткани мозга после ННГ.

Таким образом, экспериментальные исследования показали, что экстракты водяники в качестве церебропротектора обладают выраженным антигипоксическим и антиоксидантным действием. Применение экстрактов водяники в клинической практике в свете вышесказанного даст более высокий эффект и позволит не только расширить арсенал препаратов растительного происхождения, обладающих церебропротекторной активностью, но и использовать биологически активные вещества экстрактов, которые являются отходами производства в технологической схеме получения противосудорожного средства “Эмпетрин”.

Список литературы
1. Васильев В.Н. Род Empetrum. – 1961. -М.-Л.: АН СССР. – 132 с.

2. Гольдберг Е.Д. Шлемник байкальский, Томский университет, Томск -1994.

3. Колла В. Э., Сыропятов Б.Я. Дозы лекарственных средств и химических соединений для лабораторных животных. М.: Медицина – 1998. – С. 107.

5. Патент РФ 1647966. Способ получения средства, обладающего противосудорожным действием.

8. Смирнова Н. Б. Церебопротекторное действие экстракта листа бадана толстолистного при гипоксии головного мозга крыс: Автореф. Дис…к.м.н. – Томск, 1999.

9. Суслов Н.И. Патогенетическое обоснование психофармакологических эффектов препаратов природного происхождения; Дисс…. доктора мед. наук. – Томск, 1995.

10. Ханин Г.З. Противосудорожный препарат из водяники черной: Автореф. Дисс…к.м.н. – Томск, 1988.

12. H. Van Hoof., Nootropil: Basik scientific and clinical data. Medical Profession prepared Pharmaceutical Division, Brussel, 1980, P. 12.

Формула изобретения

1. Церебропротектор, содержащий высушенный экстракт из растительного сырья, отличающийся тем, что он содержит экстракт из воздушно-сухих побегов видов водяники, полученный трехступенчатым экстрагированием хлороформом в соотношении сырье: экстрагент 1: 10, ацетоном – экстракт: экстрагент 1: 10, гексаном – экстракт: экстрагент 1: 5.

2. Способ получения церебропротектора путем экстракции растительного сырья, отличающийся тем, что измельченные воздушно-сухие побеги всех видов водяники трижды экстрагируют хлороформом при соотношении сырье: экстрагент 1: 10, сухой хлороформный экстракт трижды экстрагируют ацетоном при соотношении экстракт: экстрагент 1: 10 до получения однородной массы, полученный высушенный ацетоновый экстракт экстрагируют при растирании трижды теплым гексаном при соотношении экстракт: экстрагент 1: 5, отфильтровывают и подвергают сублимационной сушке.

3. Способ получения церебропротектора по п. 2, отличающийся тем, что экстракцию хлороформом проводят при температуре 60-62^oС в течение часа.

4. Способ получения церебропротектора по п. 2, отличающийся тем, что экстракцию ацетоном проводят при комнатной температуре, ацетоновые экстракты упаривают при пониженном давлении и высушивают до получения вязкой массы.

5. Способ получения церебропротектора по п. 2, отличающийся тем, что высушенный ацетоновый экстракт экстрагируют теплым гексаном при растирании при температуре 60^oС и отфильтровывают теплым.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 12.10.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 13-2004

Извещение опубликовано: 10.05.2004

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 10.10.2004 БИ: 28/2004

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 12.10.2004

Извещение опубликовано: 10.04.2008 БИ: 10/2008