Патент на изобретение №2180350

(54) ШТАММ BACILLUS ANTHRACIS KM 91 – ОСНОВА ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНСТРУИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ АНТИГЕНОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии, генетике, конструировании продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ, входящих в состав химических сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов. Получен стабильный аспорогенный штамм B.anthracis с низкой активностью протеолитических ферментов и отсутствием антибиотикорезистентности для использования в качестве основы при конструировании продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ. Штамм сохраняет свойства при хранении, культивировании на питательных средах и в результате пассажей через организм лабораторных животных. Аспорогенность штамма дает преимущество при дальнейшем использовании сконструированных на его основе продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ, так как отсутствует вероятность обсеменения рабочих помещений, лабораторного и промышленного оборудования спорами возбудителя сибирской язвы. Штамм обладает низкой активностью протеолитических ферментов, разрушающих белковые препараты на этапах их выделения и очистки, что обеспечивает оптимальный выход белковых сибиреязвенных антигенов и исключает необходимость применения ингибиторов протеаз. Штамм характеризуется отсутствием резистентности к антибиотикам, что может быть важным при генетическом конструировании и последующем использовании аспорогенных штаммов B.anthracis.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии, генетике, конструировании продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ, входящих в состав химических сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов.

Однако перечисленные выше штаммы – основы для генетического конструирования, как и все представители рода Bacillus, являются спорообразующими. Способность сибиреязвенного микроба к образованию спор при культивировании в лабораторных или промышленных условиях требует соблюдения строгих правил безопасности работы, пренебрежение которыми может привести к обсеменению помещения и оборудования спорами В. anthracis – возбудителя опасного инфекционного заболевания, сибирской язвы. Споры – основная форма сохранения В. anthracis в объектах внешней среды. В воде они сохраняются до 18 лет, в почве – до 300 лет и более. При температуре 120-140^oС споры погибают только через 2-3 ч. Обычные обеззараживающие средства, принятые для работы с необразующими спор видами, на них не действуют. При попадании в благоприятные условия споры прорастают и образуют полноценные вегетативные клетки. Следовательно, использование в качестве основы для генетического конструирования продуцентов биологически активных веществ, в том числе сибиреязвенных антигенов, штамма В. anthracis, не способного к образованию спор (аспорогенного), более целесообразно.

Однако данный аспорогенный штамм обладает высокой активностью протеолитических ферментов, разрушающих синтезируемые белковые антигены. Активность протеолитических ферментов, приводящая к частичной потере выделяемого белка, является серьезной проблемой получения и очистки белковых препаратов. Для купирования разрушающего действия протеолитических ферментов на белковый препарат необходимо использование ингибиторов протеаз и специальных сред выращивания, что усложняет и удорожает процесс выделения.

Задачей изобретения является получение стабильного аспорогенного штамма В. anthracis с низкой активностью протеолитических ферментов и отсутствием антибиотикорезистентности для использования в качестве основы при конструировании продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ.

Сущность изобретения заключается в получении стабильного аспорогенного штамма – основы для конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ.

Заявляемый штамм возбудителя сибирской язвы получен на основе бесплазмидного производного вакцинного штамма В. anthracis СТИ1 с использованием разработанного нами способа получения аспорогенного штамма В. anthracis.

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий “Микроб” (Саратов) под номером КМ91.

Основные свойства штамма В. anthracis KM91:
– аспорогенность – аспорогенность штамма дает преимущество при его использовании в качестве продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ – компонентов сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов, так как отсутствует вероятность обсеменения рабочих помещений, лабораторного и промышленного оборудования спорами возбудителя сибирской язвы;
– авирулентность – не содержит плазмид возбудителя сибирской язвы, где располагаются структурные и регуляторные гены синтеза двух основных факторов патогенности В. anthracis – токсина и капсулы;
– низкая активность протеолитических фермеров, разрушающих белковые препараты на этапах их выделения и очистки – это обеспечивает оптимальный выход белковых сибиреязвенных антигенов и исключает необходимость применения ингибиторов протеаз;
– отсутствие резистентности к антибиотикам (заявляемый штамм – спонтанный аспорогенный мутант), что может быть важным при генетическом конструировании и последующем использовании аспорогенных штаммов В. anthracis;
– стабильность – сохраняет свойства при хранении, культивировании на питательных средах и в результате пассажей через организм лабораторных животных.

Морфологические признаки: грамположительные, необразующие спор палочки, капсулы не имеют.

Культуральные признаки: на твердых питательных средах клетки штамма образуют колонии с гладкой поверхностью и ровным краем (в S-форме). При выращивании в жидких питательных средах – равномерное помутнение с придонным осадком.

Биохимическая активность штамма и другие свойства: обладает низкой протеолитической и гемолитической активностями, не сорбирует конго красный, не синтезирует и не экскретирует в среду культивирования желтый пигмент. Оптимальная температура роста – 37^oС, оптимум рН 7,2.

Питательные потребности: является ауксотрофом, зависим в росте от метионина, треонина и тиамина.

Плазмидный состав: не содержит в составе генома плазмид В. anthracis (рХО1^–рХО2^–).

Пример 1 – определение способности к спорообразованию.

Колонии с посевов, инкубировавшихся при температуре 37^oС в течение 5 сут на агаре Хоттингера, суспендируют в физиологическом растворе. В качестве контроля используют спорообразующий штамм В. anthracis Sterne 34F2. Пробирки с культурой помещают в водяную баню и прогревают при температуре 65^oС в течение 30 мин или при 80^oС – 10 мин. Наличие роста до прогрева и отсутствие роста после прогрева при высеве по 0,1 мл культуры на агар Хоттингера свидетельствует о неспособности клеток сибиреязвенного микроба к образованию полноценных спор.

Дополнительно способность к образованию спор проверяют при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных фуксином Циля. В качестве контроля используют спорообразующий штамм В. anthracis Sterne 34F2. В опытном мазке отмечается отсутствие характерно окрашенных спор.

Пример 2 – определение стабильности свойства аспорогенности.

Штамм несколько раз (не менее трех) пассируют на питательной среде (L-aгap) при температуре 37^oС. После последнего пассажа делают высев на L-aгap и проверяют способность к спорообразованию у 20 изолированных клонов. Отсутствие спорообразования у всех тестированных клонов свидетельствует о стабильности признака. После трех пассажей на питательной среде проводят три пассажа через организм лабораторных животных. Для этого белой мыши вводят подкожно 0,2 мл клеточной суспензии штамма в концентрации 10 млн. спор. У павшей особи делают высев из головного мозга и выделяют чистую культуру В. anthracis. Выделенной чистой культурой возбудителя сибирской язвы в той же концентрации проводят заражение следующей мыши и так повторяют всего 3 раза. Затем проверяют признак спорообразования по изложенной выше схеме. Отсутствие способности к образованию спор свидетельствует о стабильности признака.

Пример 3 – определение протеолитической активности.

Субстратами для определения активности протеолитичеких ферментов являются казеин и бычий сывороточный альбумин.

Казеиновая среда для определения протеолитической активности содержит (г/л): бакто-агар – 15,0, казеин – 2,0, трис – 1,21, К₂НРО₄ – 0,5, MnSО₄7H₂O – 0,05, MgSО₄ – 0,2, CaCl₂ – 0,08, ZnSО₄7Н₂О – 0,005, CuSО₄5H₂O – 0,005, (NH₄)₂SО₄ – 2,0.

Изолированные колонии с помощью петли наносят бляшкой на поверхность казеиновой среды и выращивают в термостате при 37^oС в течение 24 ч. На каждую чашку наносят не более 16 колоний. На мутном фоне среды вокруг колоний штамма с высокой активностью протеолитических ферментов образуются зоны просветления шириной до 10 мм. Зоны просветления у штамма с низкой активностью протеолитических ферментов до 1 мм.

Альбуминовая среда для определения протеолитической активности – состав, способ приготовления и применения среды указан в “Методическом пособии по генетике возбудителя сибирской язвы” – Саратов, 1991, с.28-30 (утверждено заместителем начальника главного эпидемического управления Минздрава СССР Онищенко Г.).

Таким образом, получен стабильный аспорогенный штамм В.anthracis KM90, обладающий низкой активностью протеолитических ферментов и отсутствием антибиотикорезистентности, который рекомендуется в качестве основы для конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ – компонентов химических вакцин и диагностических препаратов.

Формула изобретения

Штамм Bacillus anthracis КМ91 – основа для генетического конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 22.05.2003

Извещение опубликовано: 20.03.2005 БИ: 08/2005