Патент на изобретение №2180002

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНАЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству бактериальных ферментных препаратов, и может быть использовано в медицине при терапии ожоговых и инфицированных ран, в парфюмерной промышленности, а также в научно-исследовательской работе, например, для определения структуры коллагенов. Культивирование Clostridium histolyticum ведут на казеиново-соево-пепсинной среде, содержащей, г/л: гидролизат казеина и соевого шрота 958,8-979,2, гидрофосфат натрия однозамещенный 1,4-1,6, дигидрофосфат калия двузамещенный 1,4-1,6, пиридоксин 0,0019-0,0021, рибофлавин 0,0019-0,0021, тиамина бромид 0,0019-0,0021, фолиевая кислота 0,0019-0,0021, пантотенат кальция 0,0019-0,0021, никотиновая кислота 0,0019-0,0021, липоевая кислота 0,0019-0,0021, биотин 0,0009-0,0011, вода дистиллированная до 1 л, а очистку и концентрирование фермента проводят на ультрафильтрационных мембранах с порогом задержания веществ по молекулярной массе 50 кД. Изобретение позволяет создать простой, легко масштабируемый и экологически чистый процесс выделения и очистки коллагеназы Clostridium histolyticum с высоким выходом целевого продукта при небольших затратах материалов, рабочего и технологического времени и сырья. 1 з.п.ф-лы.

Изобретение относится к области микробиологии, в частности к производству бактериальных ферментных препаратов, и может быть использовано в медицине при терапии ожоговых и инфицированных ран, в парфюмерной промышленности, а также в научно-исследовательской работе, например, для определения структуры коллагенов.

Известен способ выделения колагеназы с использованием в качестве продуцента актиномицета Streptomyces lavendulae, при котором культивирование продуцирующего микроорганизма проводят на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода кукурузную муку, в качестве источника азота – белковый препарат 1, с последующим центрифугированием и осаждением ферментного препарата ацетоном при 0 -5^oС. (Авторское свидетельство 1822879, кл. C 12 N 9/58, 1993).

Недостатком данного метода является применение в больших количествах органического растворителя – ацетона, являющегося взрывоопасным веществом (температура вспышки ацетона равна -18^oС), способным нарушить экологическое равновесие окружающей среды, а также необходимость создания низких температур при осаждении фермента.

Также известен способ получения коллагеназы путем культивирования продуцента Clostridium histolyticum штамм 468 в анаэробных условиях на бульоне Рамона с добавлением 1% (по объему) глюкозы с последующим осаждением 60% сульфатом аммония и очисткой методом гельфильтрации на колонке, заполненной сефадексом G-100. (Авторское свидетельство 694534, кл. С 12 D 13/10, 1979). Однако этот способ является многостадийным, трудоемким и не позволяет полностью автоматизировать процесс получения фермента. Кроме того, для приготовления питательной среды используется говяжье мясо, являющееся достаточно нестандартным и дорогостоящим сырьем.

Технический результат изобретения заключается в увеличении выхода целевого продукта, а также в упрощениии и удешевлении способа получения коллагеназы.

Сущность изобретения заключается в том, что культивирование Clostridium histolyticum ведут на казеиново-соево-пепсинной среде в анаэробных условиях при следующем соотношении компонентов среды, г/л: гидролизат казеина и соевого шрота с содержанием аминного азота 85-105 мг% – 958,8-979,2, гидрофосфат натрия однозамещенный 1,4-1,6, дигидрофосфат калия двузамещенный 1,4-1,6, пиридоксин 0,0019-0,0021, рибофлавин 0,0019-0,0021, тиамина бромид 0,0019-0,0021, фолевая кислота 0,0019-0,0021, пантотенат кальция 0,0019-0,0021, никотиновая кислота 0,0019-0,0021, липоевая кислота 0,0019-0,0021, биотип 0,0009-0,0011, вода дистиллированная – до 1 л. Очистку и концентрацию коллагеназы проводят на ультрафильтрационных мембранах с порогом задержания веществ по молекулярной массе 50 кД с последующей диафильтрацией дистиллированной водой и 0,9% раствором хлорида натрия.

Штамм продуцента Clostridium histolyiticum 468 хранится в коллекции культур микроорганизмов Государственного контрольного института медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича.

Использование казеиново-соево-пепсинной среды для культивирования Clostridium histolyticum обеспечивает получение нетоксичного, высокоактивного препарата коллагеназы. Увеличение или уменьшение вышеуказанных концентраций компонентов среды отрицательно влияет на синтез коллагеназы – активность снижается на 10-50%.

Применение ультрафильтрации позволяет упростить способ получения ферментного препарата, что открывает перспективу использования его в лечебных целях. Объединение стадий очистки и концентрирования сокращает технологические потери и упрощает процесс получения препарата, а применение отечественного серийно выпускаемого оборудования для ультрафильтрации позволяет полностью автоматизировать весь технологический процесс и увеличить выход целевого продукта.

Способ получения коллагеназы осуществляется следующим образом.

Готовят казеиново-соевый гидролизат путем гидролиза казеина и соевого шрота пепсином в водной среде, при этом казеин предварительно смешивают с соевым шротом и полученную смесь гидролизуют до содержания аминного азота 0,85-1,05 мг/мл. Приготовление питательной среды проводят по следующей схеме: прозрачный гидролизат нагревают до 60-70^oС, вносят соли, витамины и биотин и стерилизуют 30 мин при давлении 0,05 МПа.

Культуру Clostridium histolyticum засевают в казеиново-соево-пепсинную среду и проводят культивирование в течение 72 ч при температуре 37^oС. Культуральную жидкость отделяют от микробной массы микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм и очищают на ультрафильтрационных мембранах с порогом задержания веществ по молекулярной массе 50 кД. Выделенную фракцию последовательно промывают дистиллированной водой и 0,9%-ным раствором хлорида натрия, затем проводят концентрацию целевого продукта. После стерилизующей фильтрации концентрированный очищенный препарат лиофилизируют. Коллагеназная активность ферментного препарата определяется с помощью нингидринового метода и выражается в ед. лейцина / мг лиофилизированного препарата. Коллагеназная активность 1 мг лиофилизированного препарата составила 0,20-0,25 ед. лей (в мкмоль лейцина) за 20 мин инкубации в реакционной смеси.

Получение коллагеназы. Пример.

В реактор со стерильной дистиллированной водой объемом 16015 л засыпают 4,800,45 кг казеина и 1,60,15 кг соевого шрота. Растворение ведут при перемешивании при температуре 405^oС и рН 1,50,1 в течение 3,50,5 ч. Коррекцию рН выполняют 10%-ным раствором соляной кислоты. Затем в реактор загружают 0,3500,002 кг очищенного пепсина. Гидролиз ведут при рН 1,5+0,1 и температуре 400,2^oС до содержания аминного азота в гидролизате 85-105 мг%. Затем рН доводят до 4,50,1 20 %-ным раствором гидроксида натрия и кипятят в течение 20 минут. Гидролизат охлаждают до температуры 202^oС и отстаивают 191 ч. Затем прозрачный гидролизат декантируют в реактор-культиватор, нагревают до 60-70^o С и доводят рН до 8,5+0,1 20%-ным раствором гидроксида натрия. К полученным 130 л гидролизата, добавляют по 195 г гидрофосфата натрия однозамещенного и дигидрофосфата калия двузамещенного и витамины: пиридоксин 0,26 г, рибофлавин 0,26 г, тиамина бромид 0,26 г, фолиевая кислота 0,26 г, пантотенат кальция 0,26 г, никотиновая кислота 0,26 г, липоевая кислота 0,26 г, биотин 0,13 г. Питательную среду стерилизуют 30 минут при давлении 0,05 МПа. Стерильная питательная среда должна иметь следующие показатели: рН 7,80,1, аминный азот 0,950,1 мг/мл.

К стерильному бульону объемом 130 литров добавляют 61 л маточной культуры Clostridium histolyticum. Культивирование ведут в течение 721 ч при температуре 360,5^oС. Культуральную жидкость отделяют микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм. Получают 100 л нативной коллагеназы. Нативную коллагеназу концентрируют до 1/10 от первоначального объема на ультрафильтрационном аппарате с полыми волокнами марки ВПУ-50 под давлением 0,06+0,02 МПа. После этого проводят отмывку концентрированной коллагеназы последовательно стерильной апирогенной дистиллированной водой и 0,9%-ным раствором хлорида натрия до исчезновения азотистых веществ в фильтрате (по показаниям спектрофотометра при 280 нм). Очищенный препарат стерилизуют через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм. Получают 10 л очищенного концентрированного препарата коллагеназы. Затем препарат лиофилизируют. Режим сушки: замораживание при 442^oС не менее 16 часов, продожительность высушивания 55 часов при температуре не выше +35^oС. Активность 1 мг готового препарата составляет 0,20-0,25 ед. лейцина за 20 мин инкубации в реакционной смеси.

Таким образом, изобретение позволяет создать простой, легко масштабируемый и экологически чистый процесс выделения и очистки коллагеназы Clostridium histolyiticum при небольших затратах материалов, сырья, рабочего и технологического времени с высоким выходом целевого продукта.

Формула изобретения

1. Способ получения коллагеназы путем культивирования продуцента Clostridium histolyticum 468 в анаэробных условиях на питательной среде, содержащий источники углерода и азота, дистиллированную воду с последующим выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что культивирование ведут на казеиново-соево-пепсинной среде, содержащей гидролизат казеина и соевого шрота с содержанием аминного азота 85-105 мг%, гидрофосфат натрия однозамещенный, дигидрофосфат калия двузамещенный, пиридоксин, рибофлавин, тиамина бромид, фолиевую кислоту, пантотенат кальция, никотиновую кислоту, липоевую кислоту, биотин при следующем соотношении компонентов среды, г/л:
Гидролизат казеина и соевого шрота с содержанием аминного азота 85-105 мг% – 958,8-979,2
Гидрофосфат натрия однозамещенный – 1,4-1,6
Дигидрофосфат калия двузамещенный – 1,4-1,6
Пиридоксин – 0,0019-0,0021
Рибофлавин – 0,0019-0,0021
Тиамина бромид – 0,0019-0,0021
Фолиевая кислота – 0,0019-0,0021
Пантотенат кальция – 0,0019-0,0021
Никотиновая кислота – 0,0019-0,0021
Липоевая кислота – 0,0019-0,0021
Биотин – 0,0009-0,0011
Вода дистиллированная – До 1 л
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что коллагеназу очищают и концентрируют на ультрафильтрационных мембранах с порогом задержания веществ по молекулярной массе 50 кД с последующей диафильтрацией дистиллированной водой и 0,9%-ным раствором хлорида натрия.

PD4A – Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:

Федеральное государственное унитарное предприятие “Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам “Микроген”

Извещение опубликовано: 27.08.2004 БИ: 24/2004

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 17.08.2007

Извещение опубликовано: 10.03.2009 БИ: 07/2009