Патент на изобретение №2179392
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BAC. THURINGIENSIS VAR. KURSTAKI ВКМ В-2248Д, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
(57) Реферат: Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма, используемого для получения энтомопатогенных препаратов. Штамм Bacillus thuringiensis var. kurstaki выделен из природного материала с мест естественной гибели насекомых и депонирован в коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН под номеров ВКМ В-2248 Д. Штамм имеет повышенную биологическую активность и большую устойчивость к производственным фагам. 1 табл. Использование: изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма Bacillas thuringiensis var. kurstaki B-159/252B. t. Спорообразующие бактерии Вас. thuringiensis были выделены из природных очагов гибели насекомых более 80 лет назад и до настоящего времени являются наиболее известными во всем мире микроорганизмами, применяемыми в производстве энтомопатогенных препаратов. Энтомоцидные свойства клеток Вас. thuringiensis, каждая из которых продуцирует спору и ромбовидный белковый кристалл, принадлежат исключительно эндотоксину, который является основным компонентом кристалла. Кристалл в кишечном тракте насекомого переходит в растворимое состояние, вызывает образование протоксина, который активизируется в результате реакции протеолиза. Промышленное производство препаратов на основе Вас. thuringiensis var. kurstaki требует их отбора по параметрам технологичности для крупномасштабного культивирования: высокая продуктивность, устойчивость к спектру производственных фагов, высокая биологическая активность. Совместить эти параметры в одном продуценте очень сложно, что затрудняет текущую селекционную работу с производственными культурами. Известен импортный препарат дипел, получаемый с использованием штамма Вас. thuringiensis var. kurstaki NRRLB-18196 (а. с. СССР 1837773). В бывшем СССР отечественный препарат лепидоцид получали с использованием штамма Вас. thuringiensis var. kurstaki Z-52 (а. с. СССР 769787)и штамма Вас. thuringiensis var. kurstaki Z-86 (а. с. СССР 1530159). Целью изобретения является получение штамма Вас. thuringiensis var. kurstaki, способного обладать более высокой биологической активностью и большей устойчивостью к существующим фагам, чем известные штаммы. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г. Москва)под номером ВКМ В-2248Д. Сущность изобретения: штамм бактерий Вас. thuringiensis var. kurstaki В-159/252 В. t. ВКМ В-2248Д выделен из природного материала с мест естественной гибели насекомых. Штамм характеризуется повышенной биологической активностью и большей устойчивостью к производственным фагам. Полученный штамм обладает следующими свойствами. Морфолого-культуральные. Аэроб. Граммположителен. Вегетативные клетки – крупные палочки с закругленными концами, расположенные одиночно, парами или цепочками. Размер клеток-(1,7-1,9)  (3,5-6,9) мкм.
Морфологической особенностью является наличие в одной споре двух белковых патогенных для насекомых параспоральных включений – кристалл-токсинов ромбовидной и квадратной формы с четкими гранями.
Температура выращивания 30oС.
На мясопептонном бульоне образует гладкую сплошную пленку через 48-72 часа. Рост умеренный.
На ломтиках картофеля образует крупные плоские колонии с шероховатой матовой поверхностью. Рост обильный. Пигмент не образует.
На молочном агаре образует крупные, с шероховатой поверхностью колонии белого цвета, вокруг которых образуется зона просветления. Рост обильный.
На пептоно-кукурузном агаре образует крупные, плоские с шероховатой матовой поверхностью колонии с ветвистым краем. Рост обильный.
На кровяном агаре образует крупные с ветвистым краем колонии белого цвета. Поверхность колонии шероховатая, маслянистая. Рост обильный.
Культура на твердых средах растет 24 -48 часов.
Физиолого-биохимические.
Использует глюкозу, мальтозу, кукурузный и картофельный крахмал, соевую и кукурузную муку, кукурузный экстракт.
Отношение к источникам углерода.
Не использует лактозу, глицерин, сахарозу, ксилозу, маннозу.
Отношение к источникам азота.
Органические источники азота, используемые данными микроорганизмами: пептоны, мясные, рыбные и растительные экстракты, соевая, кукурузная и рыбокостная мука, автолизаты дрожжей и казеина, гидролизаты из кукурузной и соевой муки, кормовые дрожжи.
Усваивает аммонийные и нитратные формы азота.
Хранение культурыКультура хорошо хранится в холодильнике при температуре +4-6oС на косяках со средой “Б”, для длительного хранения помещается под слой стерильного вазелинового масла или лиофильно высушивается. Размножается на агаризованной среде МПА при температуре 28-30oС. Оценка свойств культуры проводится после ее культивирования на круговой качалке 200 об/мин на стерильной питательной среде следующего состава в %: Дрожжи кормовые – 2,8 Мука кукурузная – 2,0 Мука соевая – 0,8 Натрий хлористый – 0,1 Калий сернокислый – 0,1 Хлористый кальций – 0,1 Аммоний фосфорно- кислый однозамещенный – 0,2 рН среды – 6,8-7,2 в качалочных колбах с объемом среды 15 мл, Температура культивирования 28-30oС. Длительность ферментации 48 часов до высыпания спор на 70-90%. Сравнительные характеристики штамма Вас. thuringiensis var. kurstaki B-159/252B. t. и производственного штамма Z-52 и Z-86 при культивировании на ферментационной производственной среде при производстве лепидоцида приведены в таблице (данные 5 опытов в 3-х повторностях) Таким образом, представленные данные показывают, что штамм В-159 существенно превышает по биологической активности производственный штамм Z-52, сравним с ним по продуктивности и обладает устойчивостью к большему числу производственных фагов. Пример. В 5-параллельных опытах проведено культивирование штаммов В-159/252В. t, / Z-52 и Z-82 в качалочных колбах емкостью 750 мл с 30 мл дрожжеполисахаридной питательной среды. Количество посевного материала – 0,1% к объему питательной среды. Время ферментации на качалке с числом оборотов 200 об/мин при температуре 30+1oС – 48 часов. По окончании ферментации проведен анализ культуральной жидкости. Культура штамма B-159/252B. t. развивалась синхронно, освобождение спор и кристаллов происходило на 40-48 часов роста. Кристаллы крупные, хорошо видимые при окраске фуксином. Биологические пробы проведены на гусеницах непарного шелкопряда 2 возраста при свободном поглощении корма гусеницами. Отношение к фагам определялось методом скот-теста. Практическое использование штамма в производстве лепидоцида позволит сократить производственные потери от фаговых (трапных) операций и повысит качество выпускаемой продукции по уровню биологической активности. Формула изобретения
РИСУНКИ
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 28.12.2002
Номер и год публикации бюллетеня: 16-2004
Извещение опубликовано: 10.06.2004
|
||||||||||||||||||||||||||
– Endotoxin against the Common Cutworm, Spodopotera Litura, May 1995, vol. 30, № 2, p.369-374. Applied Entomology and Zoology. A Unique Insecticidal Activiti in Bacillus thiringiensis Growth Medium. February 1994, v ol. 29, № 1, p.39-45. SU 769787 A, 23.01.1984.