Патент на изобретение №2179188

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПУРИННУКЛЕОЗИД-ФОСФОРИЛАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pERPUPHO1 И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/pERPUPHO1 ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии, и решает задачу получения высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента пуриннуклеозид-фосфорилазы. Рекомбинантная плазмидная ДНК рERPUPHO1, кодирующая аминокислотную последовательность пуриннуклеозид-фосфорилазы Е. coli, состоит из: NcoI/EcoRI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ23d, содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген -лактамазы, и NcoI/EcoRI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена пуриннуклеозид-фосфорилазы Escherichia coli. Штамм-продуцент Е. coli ВL21(DE3)/рERPUPHO1, полученный трансформацией клеток Е. coli плазмидной ДНК рERPUPHO1, культивируют до накопления рекомбинантной пуриннуклеозид-фосфорилазы в количестве 60-70% от суммарного белка, клетки разрушают ультразвуком в буферном растворе и отделяют растворимую фракцию. Штамм-продуцент Е. coli ВL21(DE3)/рERPUPHO1 выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др. ) (или индуцируют изопропилтио--D-галактозидом, и снова выращивают) до достижения максимальной плотности культуры. Изобретение позволяет получать пуриннуклеозид-фосфорилазу Е. coli с высоким выходом и по упрощенным технологиям. 3 с. п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно включает сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК pERPUPHO1, обусловливающую биосинтез пуриннуклеозид-фосфорилазы штамм Е. coli, штамм Е. coli BL21(DE3)/pERPUPHO1 – суперпродуцент пуриннуклеозид-фосфорилазы и способ получения пуриннуклеозид-фосфорилазы на основе вышеуказанной рекомбинантной ДНК и штамма-продуцента для реакции трансгликозилирования при синтезе нуклеозидов.

Пуриннуклеозид-фосфорилаза Escherichia coli (КФ 2.4.2.1) представляет собой белок с мол. м. 24 КДа, функционирующий в виде гексамера с мол. м. 122 КДа [1] и катализирует катаболическую реакцию фосфоролиза пуриновых нуклеозидов в клетках Е. coli [1,2] . Ферментативная активность пуриннуклеозид-фосфорилазы позволяет использовать ее в реакции трансгликозилирования при синтезе модифицированных нуклеозидов, которые находят применение в медицине в качестве терапевтических препаратов [3] .

Для практических целей до последнего времени использовали не только изолированную из Е. coli пуриннуклеозид-фосфорилазу, но главным образом ферментативную активность целых бактериальных клеток Е. coli, либо смесь нуклеозид-фосфорилаз из этих клеток без обогащения или разделения [5-12] .

Наиболее близким к заявке является способ получения пуриннуклеозид-фосфорилазы из штамма-продуцента Е. coli, полученного при помощи методов микробиологической селекции [4] . Этот способ включает культивирование штамма-продуцента, разрушение клеток в буферном растворе и хроматографическую очистку фермента. Его недостатком является невысокий выход фермента (10-15%).

Настоящее изобретение решает задачу получения высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантную пуриннуклеозид-фосфорилазы с высоким выходом и по упрощенной технологии.

Поставленная задача решается за счет того, что штамм-продуцент, полученный трансформацией клеток Escherichia coli плазмидной ДНК, культивируют до накопления рекомбинантной пуриннуклеозид-фосфорилазы в количестве 60-70% от суммарного белка клеток, разрушают клетки в буферном растворе и отделяют растворимую фракцию. Содержание в этой фракции пуриннуклеозид-фосфорилазы составляет до 80% суммарного содержания белка, и фермент может быть использован без дополнительной очистки или очищен до гомогенного состояния стандартными методами.

Используют штамм-продуцент Escherichia coli BL21(DE3), содержащий плазмидную ДНК pERPUPHO1 – суперпродуцент пуриннуклеозид-фосфорилазы Е. coli.

Используют рекомбинантную плазмидную ДНК pERPUPHO1
– кодирующую аминокислотную последовательность пуриннуклеозид-фосфорилазы Е. coli
– имеющую молекулярную массу 2,90 МДа;
– состоящую из:
NcсI/EcoRI-фрагмента ДНК плазмиды pET23d(+)[14] , содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген -лактамазы, NcoI/EcoRI -фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена пуриннуклеозид-фосфорилазы Escherichia coli,
– содержащую:
в качестве генетического маркера ген – -лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой клеток Е. coli к пенициллиновым антибиотикам;
уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NcoI: XbaI – 38 п. о. , BglII – 96 п. о. , PvuII – 741 п. о. , BglI – 2163 п. о. , PvuI – 2413 п. о. , EcoRl – 4389 п. о.

Используют штамм-продуцент Escherichia coli BL21 (DE3), содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pERPUPHO1 – продуцент пуриннуклеозид-фосфорилазы.

Изобретение позволяет получать рекомбинантную пуриннуклеозид-фосфорилазу по простой технологии и с высоким выходом.

Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pERPUPHO1 обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в ней гена пуриннуклеозид-фосфорилазы.

Для конструирования плазмиды использован химический подход, позволяющий использовать для экспрессии клонированного структурного гена оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию.

Источником структурного гена пуриннуклеозид-фосфорилазы служит хромосомная ДНК Е. coli. Рекомбинантный ген выделяют с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами и затем клонируют в векторную плазмиду pET-23d(+) [14] .

Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL21(DE3)/pERPUPHO1 характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре “Дифко” – колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или YT-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4 до 40^oC при оптимуме pH от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т. д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).

Штамм-продуцент Е. coli BL21(DE3)/pERPUPHO1 отличается от штамма-реципиента Е. coli BL21(DE3) только наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pERPUPHO1, которая и придает ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.

Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток Е. coli BL21(DE3) соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.

Клетки Е. coli BL21(DE3)/pERPUPHO1 являются суперпродуцентом пуриннуклеозид-фосфорилазы. При индукции изопропилтио –-D-галактозидом, а также и без индукции происходит эффективный биосинтез пуриннуклеозид-фосфорилазы, которая накапливается в клетках в количестве более 60% суммарного белка бактерий.

Штамм-продуцент депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, N ВКПМ В-7888 от 11.01.2000 г.

Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pERPUPHO1, для чего ген пуриннуклеозид-фосфорилазы выделяют из хромосомной ДНК Е. coli с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (см. чертеж), содержащими сайты рестриктаз Ncol(N-конец гена, праймер A1) и SalI(С-конец гена, праймер B1), полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с расщепленной по тем же сайтам векторной плазмидой pET-23d(+) [14] .

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки Е. coli BL21(DE3) и высевают на YT-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют гибридизацией ³²P-мечеными олигонуклеотидами A1 и B1 (см. чертеж), и из гибридизующихся клонов выделяют плазмидную ДНК, которую подвергают рестриктному анализу с помощью рестриктаз Ncol и SalI.

Штамм-продуцент Е. coli BL21(DE3)/pERPUPHO1 выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др. ) (или индуцируют изопропилтио –– D-галактозидом, и снова выращивают) до достижения максимальной плотности культуры.

Выделение пуриннуклеозид-фосфорилазы из клеток продуцента включает следующие стадии:
– разрушение выращенных клеток при помощи ультразвука;
– отделение растворимой фракции центрифугированием; содержание в этой фракции пуриннуклеозид-фосфорилазы составляет до 80% суммарного содержания белка, и фермент может быть использован без дополнительной очистки;
– из растворимой фракции целевой белок может быть очищен до гомогенного состояния стандартными методами.

На чертеже изображена структура гена пуриннуклеозид- фосфорилазы и синтетических праймеров, использованных для выделения гена с помощью ПЦР и отбора клонов путем гибридизации.

Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pERPUPHO1
Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3′-конца к 5′-концу с помощью защищенных фосфамидитов – 5′- диметокситритил-N-ацил-2′-дезоксинуклеозид-3′-O- -(-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 А), к которому через 3′- сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл, описанный в работе [13] .

Для приготовления вектора ДНК плазмиды pET-23d(+) (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера Y (33 мМ трис-ацетат, pH 7,9, 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат 1, 0,5 мМ DTT, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой Ncol (10 ед. акт. ), а затем – в 40 мкл буфура R (10 мМ трис-HCl, pH 8,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ KCl, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой EcoRI (10 ед. акт. ) в течение 1 ч при 37^oC. Векторный фрагмент величиной 3,6 т. п. о. после электрофореза в 1% агарозном геле электрофоретически перемещают в слой DEAE-бумаги, затем элюируют 1M NaCI и осаждают ДНК из раствора этанолом.

Для приготовления фрагмента гена пуриннуклеозид-фосфорилазы проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК E. coli (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров – синтетические олигонуклеотиды A1 и B1 (по 60 пмоль каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, содержащем каждый из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация – 1 мин при 94^oC, отжиг – 30 с при 60^oC, элонгация – 40 с при 72^oC, 30 циклов ПЦР. После этого реакционную смесь депротеинизируют хлороформом, упаривают досуха, остаток растворяют в 20 мкл воды, затем расщепляют теми же рестриктазами, которые использовались при приготовлении вектора, и выделяют целевой фрагмент из агарозного геля.

Полученный синтетический фрагмент с геном пуриннуклеозид-фосфорилазы в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, pH 7,56, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ rАТР, 10 мМ дитиотреит) и лигируют с помощью 10 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10^oC.

Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coli BL21(DE3). Трансформанты высевают на чашки с YT-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью гибридизации колоний in situ с ³²P-меченым олигонуклеотидом A1 (см. чертеж). Из гибридизующихся клонов выделяют ДНК плазмиды pERPUPHO1 и анализируют с помощью эндонуклеаз NcoI и EcoRI.

Пример 2. Получение штамма Е. coli BL21(DE3)/ pERPUPHO1 (ВКПМ В-7888) продуцента пуриннуклеозид-фосфорилазы и определение его продуктивности.

Клетки Е. coli BL21(DE3), несущие плазмиду pERPUPHO1, структура которой подтверждена данными анализа (см. пример 1), являются суперпродуцентом пуриннуклеозид-фосфорилазы.

Штамм продуцента Е. coli BL21(DE3)/pERPUPHO1 выращивают при 37^oC в 100 мл YT-бульона (pH 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А₅₅₀ 0,7-0,8, прибавляют изопропилтио –-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают процесс еще 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А₅₅₀ и количество культуры, соответствующее 1 мл с А₅₅₀ 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим обрабатывают 20 с ультразвуком, нагревают 3 мин при 100^oC и пробы по 1 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют для определения относительного количества белка в полосе целевого белка.

Пример 3. Получение пуриннуклеозид-фосфорилазы.

Влажные клетки (10 г) суспендируют в 20 мл буфера (30 мМ Na- фосфат, pH 7,0, 5% глицерин) и разрушают ультразвуком с помощью ультразвукового дезинтегратора Sonifier 240 (Branson) (3 импульса по 20 сек при А 2,0 и 0^oC). Гомогенат центрифугируют 10 мин при 10000 g и полученный супернатант с содержанием фермента до 80% от суммарного белка используют для реакции трансгликозилирования.

ЛИТЕРАТУРА

6. Jap. Pat. 5170767, 09.07.93.

7. Jap. Pat. 06217784, 09.08.94.

8. US Pat. 4374315, 31.08.82.

11. WO Pat. 9421118, 29.09.94.

12. WO Pat. 9507718, 23.03.95.

14. Novagen Catalog 1996-1997.

Формула изобретения

1. Способ получения пуриннуклеозид-фосфорилазы Е. coli, включающий культивирование в богатой среде штамма-продуцента, полученного трансформацией клеток Escherichia coli плазмидной ДНК с последующим разрушением клеток в буферном растворе с помощью ультразвука, отличающийся тем, что в качестве плазмидной ДНК используют специально сконструированную ДНК рERPUPHO1, в качестве штамма-продуцента используют штамм Escherichia coli ВL21 (DE3)/ рERPUPHO1, и отделяют растворимую фракцию, содержащую пуриннуклеозид-фосфорилазу.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК рERPUPHO1, кодирующая аминокислотную последовательность пуриннуклеозид-фосфорилазы Е. coli, имеющая мол. м. 2,90 МДа, состоящая из: NcoI/EcoRI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ23d(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген -лактамазы, и NcoI/EcoRI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена пуриннуклеозид-фосфорилазы Escherichia coli; содержащая: в качестве генетического маркера ген -лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой рERPUPHO1 клеток E. coli к пенициллиновым антибиотикам; уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NcoI : XbaI – 38 п. о. , BglII – 96 п. о. , PvuII – 741 п. о. , BglI – 2163 п. о. , PvuI – 2413 п. о. , EcoRI – 4389 п. о.

3. Штамм Escherichia coli BL21 (DE3), содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК рERPUPHO1, суперпродуцент пуриннуклеозид-фосфорилазы Е. coli (ВКПМ В-7888).

РИСУНКИ