Патент на изобретение №2178806

(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHSVD1, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЭКСПРЕССИЮ ФРАГМЕНТА ГЕНА US6 ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА 1-ГО ТИПА, КОДИРУЮЩЕГО ИММУНОДОМИНАНТНУЮ ЧАСТЬ ГЛИКОПРОТЕИНА D (gD) HSV-1, В КЛЕТКАХ БАКТЕРИЙ ESCHЕRICHIA COLI

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую фрагмент гена US6 вируса простого герпеса типа 1 (HSV-1), который кодирует иммунодоминантную часть гликопротеина D (gD) вируса HSV-1 с 269 по 392 а. к. Конструкция обеспечивает в клетках бактерий E. coli биосинтез полипептида в виде фрагмента -галактозидазы E. coli (с 1 по 376 а. к. ) с полигистидиновым (6-His) трактом для аффинной очистки, обладающего антигенными свойствами вируса простого герпеса типа 1. Очищенный рекомбинантный белок может быть использован в качестве HSV-1 антигена для серологического тестирования HSV-1 в клинической практике. 5 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную “in vitro” рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую фрагмент гена US6 вируса простого герпеса тип 1: (HSV-1), кодирующий иммунодоминантную часть гликопротеина D (gD) вируса HSV-1 с 269 по 392 а. к.

Конструкция обеспечивает в клетках бактерий Е. coli биосинтез полипептида в виде фрагмента gD HSV-1 и фрагмента -галактозидазы E. coli (с 1 по 376 а. к. ) с полигистидиновым (6*His) трактом для аффинной очистки, обладающего антигенными свойствами вируса простого герпеса тип 1. Этот очищенный с помощью аффинной хроматографии рекомбинантный белок может быть использован в качестве HSV-1-антигена для серологического тестирования HSV-1 в клинической практике. Использование этого антигена для выявления специфичных к HSV-1 иммуноглобулинов G (IgG-HSV-1) показывает 98-99 % чувствительности и специфичности в иммуноферментном анализе.

Гликопротеин D (gD) вируса простого герпеса тип 1, кодируемый геном US6, представляет собой гликозилированный белок с молекулярной массой 55-60 килодальтон и является одним из белков, составляющих оболочку вируса. Этот гидрофобный вирусный белок gD обладает свойствами антигена HSV-1, содержит 3 антигенных эпитопа, обладающих высокой специфичностью по отношению к HSV-1-специфичным антитенам. Описанный белок не имеет серологического сродства с другими герпесвирусными белками [3, 4, 6] .

В настоящее время неизвестны способы получения этого белка в чистом виде [3] из очищенного вируса. Существует возможность использования в иммунологическом анализе этого белка-антигена только в составе вирусной суспензии или в виде лизата клеток, инфицированных HSV-1. Недостатками этих способов является использование вируса, патогенного для человека, а также использование дорогостоящей наработки вирусного материала, требующей больших расходов человеческой эмбриональной сыворотки, других дорогостоящих материалов и дорогих технологических приемов, таких как ультрацентрифугирование. При этом полученный высокоочищенный вирус не гарантирует от перекрестных неспецифических реакций с другими вирусами семейства Herpesvuidae при использовании этого антигена в иммуноферментном анализе (ИФА).

Известны способы получения вирусного белка gD микробиологическим синтезом [5] , показывающие его иммунохимическую активность. Однако согласно предложенным способам экспрессируемая часть гена кодирует только часть уникальных антигенных детерминант и области, гомологичные с аналогичным пептидом для HSV-2, а также в них отсутствует аффинная мишень для последующей хроматографической очистки синтезируемого белка.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению (прототипом) является способ, описанный в работе [5] . Рекомбинантная плазмидная ДНК содержит фрагмент гена US6. Описанная плазмидная конструкция позволяет экспрессировать рекомбинантный белок в виде слитого с полноразмерной -галактозидазой белка. Уровень экспрессии в штамме – продуценте Е. coli достигает 1-3 % от суммы клеточных белков.

Недостатками конструкции прототипа является экспрессия лишь части последовательности, кодирующей N-концевой район иммунодоминантный район (5-55 а. к. ); относительно низкий уровень синтеза кодируемого полипептида gD (1-3 % от суммарного клеточного белка) и наличие полноразмерной -галактозидазы как неспецифического антигена в последующем ИФА, а также низкий уровень хроматографической очистки, составляющий не более 50-60 % от -галактозидазы и суммарного клеточного белка.

Технической задачей изобретения является получение рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей экспрессию фрагмента гена US6 HSV-1, кодирующего всю иммунодоминантную часть gD с 269 по 392 а. к. , в составе бактериального плазмидного вектора, кодирующего фрагмент -галактозидазы (с 1 по 376 а. к. ) и 6*Нis-мишень для аффинной очистки белка. Конструкция должна обеспечивать более высокий уровень биосинтеза рекомбинантного gD HSV-1 в клетках Е. coli и уровень аффинной очистки с использованием 6*Нis-мишени не менее 95-98 % рекомбинантного белка.

Поставленная задача решается путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pHSVDl, кодирующей IPTG- индуцируемый биосинтез полипептида, обладающего антигенными свойствами вируса простого герпеса 1 типа, в клетках Е. coli в виде фрагмента -галактозидазы (с 1 по 376 а. к. ) и фрагмента gD HSV-1 (с 269 по 392 а. к. ), с 6*His на N-конце для аффинной очистки.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pHSVDl, кодирующая иммунодоминантную часть гликопротеина gD вируса простого герпеса тип 1, характеризуется следующими признаками
– имеет молекулярную массу 2,5 мегадальтон (3,793 т. п. о. );
– содержит участок начала репликации (позиция 3612 п. о. );
– кодирует аминокислотную последовательность иммунодоминантной части гликопротеина gD HSV-1 (с 269 по 392 а. к. );
– состоит из:
– HindIII/EcoRV – фрагмента ДНК векторной плазмиды pUR290 (3386 т. п. о. ) [2] ;
– фрагмента гена US6 (372 п. о. ), кодирующего всю иммунодоминантную часть гликопротеина gD HSV-1 (с 269 по 392 а. к. ), фланкированного 5^‘-GAT и GTCGAC-3^‘;
– содержит:
– в качестве генетического маркера ген blа -лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой рН SVD1 клеток Е. coli к ампициллину;
– нуклеотидную последовательность, кодирующую полигистидиновый тракт (с 1725 по 1798 п. о. ) в рамке считывания гена кодирующего слитый с фрагментом -галактозидазы фрагмент gD1 белка, состоящий из 6 молекул аминокислоты гистидина и затем стоп-кодона, для последующей очистки с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA-resin;
– уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты:
EcoRI (EcoRI) – 1782 (G| AATTC);
SalI (SalI) – 1720 (G| TCGAC);
Mlyl131 (Narl) – 1477 (GG| CGCC);
MroNI (NgoMI) – 1573 (G| CCGGC).

Существенными преимуществами предложенной плазмидной конструкции в отличие от прототипа является наличие экспрессируемого фрагмента гена US6, кодирующего только иммунодоминантную часть гликопротеина gD HSV-1 без полноразмерной -галактозидазы и наличие в N-концевой области полигистидинового тракта, что в совокупности обеспечивает уровень синтеза целевого белка 40-50 % с выходом очищенного продукта после аффинной хроматографии до 98-99 % от суммарных клеточных белков.

Перечень графических материалов
Фиг. 1. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pHSVD1.

Фиг. 2. Нуклеотидная последовательность гена US6, кодирующая гидрофильную иммунодоминантную часть гликопротеина gD.

Фиг. 3. Нуклеотидная и аминокислотная последовательность гена рекомбинантного белка, кодируемого рекомбинантной плазмидой pHSVD1.

Фиг. 4. Схема сборки плазмиды pHSVD1.

Фиг. 5. Электрофореграмма лизатов клеток Е. coli (штамм TG-1), трансформированных плазмидой pHSVD1, синтезирующих gD HSV-1 (дорожка 2); штамма реципиента (дорожка К); рекомбинантного белка gD HSV-1, очищенного аффинной хроматографией на Ni-NTA-resin (дорожка 1); рекомбинантного белка, синтезирующегося клетками Е. coli (штамм TG-1), трансформированных плазмидой pUR290-D1-6*his (дорожка 3); маркер белковых весов Sigma (дорожка М). Стрелкой указаны рекомбинантные белки.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pUC(US6) (фиг. 4).

10 мкг плазмидной ДНК pUC19 [7] обрабатывают рестриктазами BamHI и SalI в соответствии с методикой, описанной в работе [1] , и из полученного гидролизата выделяют в 4 % полиакриламидном геле векторный фрагмент длиной 2,664 т. п. о.

10 мкг ДНК из реакционной смеси после проведения полимеразной цепной реакции с геномной ДНК HSV-1 в соответствии с методикой, описанной в работе [1] , обрабатывают рестриктазами BamHI и SalI и из полученного гидролизата выделяют в 4 % полиакриламидном геле фрагмент длиной 372 п. о.

Полученный фрагмент и векторную часть плазмиды pUC19 сшивают при помощи лигазной реакции в 30 мкл буфера для лигирования. 10-20 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coli TG-1 [1] . Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК и анализируют рестрикционным анализом. Отбирают ДНК клонов по наличию теоретически предсказанных фрагментов.

Пример 2. Конструирование промежуточной плазмидной ДНК pUR290-6*his (см фиг. 4), кодирующей последовательность из 6-ти гистидинов после сайта узнавания эндонуклеазой рестрикции SalI.

10 мкг плазмидной ДНК pUR290 [2] обрабатывают последовательно эндонуклеазой рестрикции HindIII, фрагментом Кленова и SalI и сшивают с синтетическим адаптером длиной 50 пар нуклеотидов, обработанным последовательно эндонуклеазой рестрикции KpnI, фрагментом Кленова и SalI:

в лигазной реакции в 20 мкл лигазного буфера. 10 мкл лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E. coli TG-1 [1] . Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших за 1 сутки колоний клонов выделяют плазмидную ДНК. ДНК каждого клона проверяют на присутствие вставки обработкой эндонуклеазой рестрикции EcoRI (116 п. н. ) и отсутствие сайта эндонуклеазы рестрикции PstI – выбирают нужный клон, плазмидная ДНК (pUR290-6*his) которого содержит последовательность синтетического адаптера.

Пример 3. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pHSVD1 (фиг. 1, 4).

10 мкг плазмидной ДНК pUC(US6) обрабатывают последовательно эндонуклеазами рестрикции BamHI и SalI в соответствии с методикой, описанной в работе [1] , и из полученной реакционной смеси выделяют в 4 % полиакриламидном геле фрагмент ДНК длиной 372 п. о.

10 мкг плазмидной ДНК pUR290-6*his обрабатывают рестриктазами BamHI и SalI в соответствии с методикой, описанной в работе [1] , и из полученного гидролизата выделяют в 4% полиакриламидном геле векторный фрагмент длиной 5370 п. о.

Концы полученного фрагмента и вектора соединяют при помощи лигазной реакции в 30 мкл буфера для лигирования. 5-10 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток TG-1[1] . Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК pUR290-D1-6*his и анализируют ее путем обработки набором эндонуклеаз рестрикции по наличию уникальных сайтов с последующим электрофоретическим анализом длин рестрикционных фрагментов в 4 % полиакриламидном геле. Из 10 проанализированных клонов 10 показали нужный набор рестрикционных фрагментов. Целевая плазмида pHSVD1 получается в результате обработки плазмидной ДНК pUR290-D1-6*his эндонуклеазами рестрикции BamHI, EcoRV, фрагментом Кленова и затем сшивания в лигазной реакции в 30 мкл лигирующего буфера. Лигазная смесь (10-20 мкл) используется для трансформации клеток E. coli штамм TG-1. Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших за 1 сутки колоний клонов выделяют плазмидную ДНК (pHSVD1). ДНК каждого клона проверяют на отсутствие сайта EcoRV, BamHI и наличие уникальных сайтов.

Окончательную структуру рекомбинантной ДНК pHSVDl подтверждают определением нуклеотидной последовательности в районе встроенного фрагмента, содержащего фрагмент гена US6 (Фиг. 2).

Экспрессию целевого гена US6 проверяют по наличию рекомбинантного белка 45 килодальтон (фиг. 3), выделяемого с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA-resin, после индукции IPTG трансформированной целевой плазмидой pHSVDl клеток Е. coli TG-1 (Фиг. 5).

Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить экспрессирующую плазмидную ДНК pHSVDl, кодирующую фрагмент гена US6 HSV-1. Трансформированная этой плазмидой культура клеток Е. coli TG-1 при индукции IPTG осуществляет биосинтез полипептида размером 45 килодальтон, состоящего из фрагмента гликопротеина gD (с 269 по 392 а. к. ) вируса простого герпеса тип 1, содержащего 3 антигенных эпитопа и расположенного на N-конце полигистидинового тракта и фрагмента -галактозидазы на С-конце (1-376 а. к. ). Все это позволяет по сравнению с прототипом упростить процесс получения высокоочищенного до 98-99 % рекомбинантного антигена gD HSV-1, а также увеличить синтез целевого полипептида в 40-50 раз. Этот рекомбинантный белок после аффинной хроматографии может быть использован в качестве HSV-1-антигена для серологического анализа вируса простого герпеса в клинической практике. Уровень выявления специфичных к HSV-1 иммуноглобулинов в крови пациентов при использовании этого белка показывает 98-99 % чувствительности и специфичности к IgG-HSV-1 и IgM-HSV-1 в иммуноферментном анализе.

Список литературы.

Формула изобретения

Рекомбинантная плазмидная ДНК pHSVD1, обеспечивающая экспрессию фрагмента гена US6 вируса простого герпеса тип 1 в клетках бактерий Escherichia coli, имеющая размер 3,793 т. п. о. и молекулярную массу 2,5 мегадальтон, состоящая из Hind III/EcoRV – фрагмента ДНК плазмиды pUR290 (3386 т. п. о); фрагмента гена US6 (372 п. о. ), представленного на фиг. 2, кодирующего всю иммунодоминантную часть гликопротеида gD HSV-1, представленную на фиг. 3, фланкированного 5′ – GAT и GTCGAC – 3′; участка репликации (позиция 3612 п. о. ); генетического маркера гена bla -лактамазы, определяющего устойчивость трансформированных плазмидой pHSVD1, клеток E. coli к ампицилину; нуклеотидной последовательности, кодирующей полигистидиновый тракт (с 1725 по 1798 п. о. ) в рамке считывания гена, кодирующего слитый с фрагментом -галактозидазы фрагмент gD1 белка, состоящий из 6 молекул аминокислоты гистидина и стоп-кодона, для последующей очистки с помощью аффинной хромотографии на Ni – NTA – resin; уникальных сайтов узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты:
EcoRI(EcoRI)-1782(G|AATTC),
SalI(SalI)-1720(G|TCGAC),
Mly1131(NarI)-1477(GG|CGCC),
MroNI(NgoMI)-1573(G|CCGGC).

РИСУНКИ