Патент на изобретение №2178264

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПО РАСПРЕДЕЛЕНИЮ КЛЕТОК ПО РАЗМЕРАМ И ФОРМЕ

(57) Реферат:

Способ может быть использован в медицине и ветеринарии для диагностики различных заболеваний. Для исследования осуществляют отбор определенного типа клеток, который задается характером предполагаемого заболевания. Готовят суспензию из отобранных клеток. Осуществляют морфометрический анализ с одновременным анализом двух типов распределений всех клеток в исследуемой пробе. Морфометрический анализ осуществляют по объемному, численному распределению и по форме. Диагностику заболеваний осуществляют по изменению субпопуляционного состава суспензии клеток. Способ высокоспецифичен, быстрый по исполнению, с низкой себестоимостью, позволяющий диагностировать широкий спектр заболеваний. 1 з. п. ф-лы. , 2 ил.

Данное изобретение относится к области медицинской (ветеринарной) диагностики. Оно может быть применено для диагностики инфекционных, онкологических, иммунных заболеваний, заболеваний, связанных с мутациями или с нарушением развертывания генетической программы (например, при гемопоэзе), а также при отравлениях или передозировке токсических, наркотических веществ и фармацевтических препаратов.

Исследования размерных распределений частиц в суспензии проводятся в различных областях знания от коллоидной химии до океанографии [1] . В биологических исследованиях такие задачи возникали при изучении гомогенности и размерных характеристик препаратов (например, липосомальных [1] ) или при исследовании субпопуляционного состава клеточных культур [2] . В последнем случае на сегодняшний день рутинно применяются флуоцитометры, комбинирующие данные по флуоресценции специфических красителей [3] . Конечно, изменение морфологии клеток при различных патологиях и изменениях состояния окружающей среды хорошо известны цитологам, медикам и другим специалистам. Однако результаты таких исследований не поддаются математической обработке, не формализованы (а следовательно, трактовка зависит от исследователя). Использование же точных математических параметров, отражающих клеточную морфологию, в научно-медицинской исследовательской практике нашло применение лишь в качестве источника дополнительной информации в гематологии при анализе эритроцитов с помощью гематоанализатора [4,5] . В то же время современное состояние исследований в области биологии клетки позволяет создать новые, высокоспецифичные и информативные способы прямого выявления заболеваний различной природы.

Целью настоящего изобретения является создание высокоспецифичного, быстрого по исполнению, с низкой себестоимостью способа диагностики широкого спектра заболеваний по следующим характеристикам клеточных популяций (как человека (или животного), так и популяций, поддерживаемых в культуре): распределения по линейным размерам и форме.

Для достижения данной цели нами была проанализирована концепция о строгом генном контроле формообразования у клеток, что подтверждается данными эмбриологии, биометрическим изучением различных клеток, например рода Amoeba [6] , и данными по влиянию токсикантов на формообразование клеток/колоний низших грибов [7] . Оказалось, что представления о неупорядоченной форме простейших рода Amoeba являются неверными: параметр отношения площади проекции клетки на плоскость к квадрату периметра – строго видовой признак. Мы предположили, что ионы меди и цинка, будучи жизненно необходимыми микроэлементами, и в то же время оказывающие влияние на процессы апоптоза и вызывающие генотоксические эффекты, будут влиять не только на рост культуры, но и на формообразование клеток/колоний дрожжей Sacchаromyces cerevisiae. Действительно, ионы меди и цинка вызывали два процесса – образования гигантских (> 10 мкм) клеток и усиление почкования вплоть до образования колоний с линейными размерами до 80 мкм. Более того, ответ на действие ионов таких d-элементов оказался строго специфичным: по виду гистограмм численного и объемного распределений можно оценить соотношения ионов меди и цинка. Из проведенных нами исследований и анализа цитологических и эмбриологических данных мы сделали вывод о том, что гистограммы численного и объемного распределений могут являться графическим портретом определенного типа клеток с возможностью межвидовой, тканевой и субпопуляционной дифференциацией.

Описание изобретения.

Поскольку распределение клеток по размерам и форме находится в строго однозначном соответствии с источником клеточного материала (вида организма, органа, ткани), состоянием клеток (распределения по фазам клеточного цикла, состояния нарушенности/ненарушенности программы реализации генетической информации от гена до посттрансляционных модификаций белков) и состояния окружающей среды (в том числе и межклеточной тканевой жидкости), то любое заболевание от инфекционного до генетического будет строго специфическим образом отражаться на виде (функции) указанных распределений. Возможность проявления указанных взаимооднозначных соответствий “состояние клеток – вид функции распределений” обусловлен двумя причинами:
1) проведением статистической морфометрической оценки состояния всей клеточной популяции, т. е. с учетом всех клеток в пробе, а не выборки в 10-1000 штук при рутинном цитологическом анализе;
2) одновременным анализом, как минимум, двух видов распределений, например численного и объемного, что и позволяет делать выводы об изменении распределения по формам и, в частности, выявлять субпопуляции малой численности.

Отбор определенного типа клеток для исследования задается каждый раз характером предлагаемого заболевания. Так, для диагностики заболеваний, происходящих вследствие нарушения эритро- и лейкопоэза, следует исследовать фракции эритроцитов и лейкоцитов соответственно. Разумеется, в качестве контроля должны присутствовать и образцы от здоровых пациентов. Исследованию можно подвергать не только клеточный материал от пациента, но и использовать клетки лабораторных животных или культивируемые клетки для биодетекции различных проб, полученных от пациента или из внешней среды, на предмет присутствия в них инфекционного возбудители (и/или токсиканта, фармпрепарата и т. д. ). Детали пробоподготовки варьируют в зависимости от выбранного конкретного метода, с помощью которого можно получить графики функций n_i(r) и v_i(r) (как минимум – 2-х), где r – линейный размер клетки, n_i – доля данной размерной группы (для гистограммы) от общего числа клеток, v_i – доля данной размерной группы (для гистограммы) от общего внутреннего объема клеток.

Характеристика распределения клеток по линейным размерам и форме может в принципе осуществляться следующими методами, применяемыми для исследования гетерогенных сред (суспензий, эмульсий, аэрозолей и т. д. ) и в цитологии:
1) микроскопия (различные виды от световой и флуоресцентной до электронной) с ручным или автоматическими способами сортировки и учета клеток;
2) седиментационные методы анализа с различными способами детекции зон:
3) электрофоретические методы;
4) методы, использующие определение дзета-потенциала:
5) рассеяние ультразвуковых волн:
6) методы, использующие дифракцию лазерного света в различных модификациях: от фирменных “определителей размеров частиц” (“particle sizer”) до отечественных установок с использованием лазерной корреляционной спектроскопии, поляриметров-гониометров, приборов на основе когерентно- оптического метода и т. д.

Среди всех перечисленных методов наиболее удобен по пробоподготовке, обработке и трактовке результатов метод исследования гистограмм численного и объемного распределений по дифракции лазерного света в суспензии клеток. Для данного метода разработаны фирменные приборы, удобное математическое обеспечение, а чувствительность аппаратуры позволяет работать с количеством клеток – 100-1000 штук (в зависимости от их формы), что приближается к чувствительности микробиологических методов анализа.

Найден способ диагностики заболеваний по распределению клеток по размерам и форме, при этом:
1) использовано явление строго генетического контроля формообразования клеток;
2) впервые применен метод статистической морфометрической оценки всех клеток в пробе;
3) в соответствии с пп. 1) и 2) данный способ диагностики обладает специфичностью, приближающейся к специфичности методов ДНК-анализа, т. е. значениям в 95-97% аналитической специфичности и 93-95% диагностической специфичности;
4) разработан подход строгой математической обработки результатов в виде, как минимум, двух типов гистограмм распределения – численного и объемного, что позволяет формализовать учет распределения клеток по форме и выявлять субпопуляции малой численности;
5) себестоимость анализа с помощью данного метода минимальна, так как обусловлена только стоимостью расходных материалов, рутинно применяемых в любой медицинской лаборатории.

Пример 1. Дифференциальная диагностика возбудителя туберкулеза.

Материал, содержащий различные виды частиц 1) – Mycobacleria tuberculosis, 2) -Francisella tularensis, 3) латексные шарики, – вводили внутрибрюшинно лабораторной мыши (возраст от 4 до 6 недель). 4 группа мышей – контрольная. Через 1 сутки стандартным способом получают суспензии перитонеальных макрофагов [3] в среде RPMI. При концентрации клеток около 1-2 млн. в мл инкубировали выделенные макрофаги в плотно закрытых полипропиленовых пробирках при температуре 38^oC требуемое время. Исследовали численное и объемное распределение распределение макрофагов в суспензии среде RPMI (конечная концентрация 50000-200000 штук/мл). Концентрации клеток могут значительно отличаться – на порядок и более в сторону увеличения или уменьшения – в зависимости от прибора. Используемая нами установка давала возможность работать в очень широком диапазоне концентраций (здесь указан технически удобный интервал). Как видно из фиг. 1, только макрофаги из мышей, инфицированных штаммом Mycohacteria tuberculosis, дают графики численного (черные кружки) и объемного распределений (белые кружки) с двумя максимумами в области от 3 до 20 мкм (интервал размеров, в который попадают линейные характерные размеры макрофагов). Последнее отражает скорее всего возникновение новых фагоцитирующих субпопуляций макрофагов.

Пример 2. Дифференциальная диагностика заболеваний крови.

Из венозной крови с гепарином путем дифференциального центрифугирования получали фракции лейкоцитов и эритроцитов. Последние разводили в экспериментальной кювете в физиологическом растворе в 10-100000 раз для подбора оптимальных условий измерения кривых распределения. Огибающие к гистограммам численного и объемных распределений представлены на фиг. 2. Данные для здоровых пациентов отмечены словом “Норма”. Видно появление новых субпопуляций эритроцитов при остром миеломонобластном лейкозе (ОММЛ) и 2-х субпопуляций лейкоцитов при хроническом миелоейкозе (ХМЛ). Диагнозы предварительно были установлены классическими методами. Изменение субпопуляционного состава обусловлено пролиферацией менее дифференцированных клеток и бесконтрольным ростом определенных клонов кроветворных клеток вследствие механизмов нарушения синтеза ДНК и механизмов генного контроля.

Источники информации:
1. Спектроскопические методы исследования в физиологии и биохимии. – Л. , Наука, 1987. 205 с.

2. Адам P. Методы культуры клеток для биохимиков. – М. Мир. 1983. 264 с.

3. Las Heras G. , Milla F. Ribera J. M. Oriol A. Feliu E. Evaluation of the System 9000-AX autoanalyzer, – Sangre (Barc). 1993, 38(2), p. 97-102.

4. Dixon L. R. The coplete blood count: physiologic and clinical usage. – J. Perinat. Neonatal Nurs, 1997. 11(3), p. 1-18.

5. Patton W. N. Cave R. J. . Harris R. I. A study of changes in red cell volume and haemoglobin concentration during phlebotomy induced iron defeiciency and iron repletion using the Technicon H1. -Clin. Lab. Haematol. 1991. 13(2), p. 153-161.

6. Микрюков К. А. Изучение ультраструктуры и сравнение генов рРНК как методы построения системы протистов. – Зоологический журнал. 1999, т. 79, вып. 8, с. 1-15.

7. Сыроешкин А. В. , Плетенева Т. В. , Плетенев С. С. , Синюк Т. Ф. , Лебедев И. М. Антагонизм в токсическом действии ионов меди и цинка в водных растворах. – Гальванотехника и обработка поверхности. 1999, т. 7, N 3, с. 54-55.

Формула изобретения

1. Способ исследования клеток биологического материала для диагностики заболеваний, включающий их морфометрический анализ, отличающийся тем, что готовят суспензию клеток того типа, который задается характером предполагаемого заболевания, а морфометрический анализ осуществляют с одновременным анализом не менее двух типов распределений всех клеток в исследуемой пробе по форме, объемному и численному распределению.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что диагностику заболеваний осуществляют по изменению субпопуляционного состава суспензии клеток.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 09.12.2003

Извещение опубликовано: 10.03.2005 БИ: 07/2005

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 27.04.2005 БИ: 12/2005

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 09.12.2006

Извещение опубликовано: 20.06.2008 БИ: 17/2008