Патент на изобретение №2178173

(54) СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ И ОНКОГЕННЫХ ВИРУСОВ, ИНТЕГРИРОВАННЫХ В ХРОМОСОМЫ ИНФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины и, в частности, касается обнаружения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток. Обнаружение производится в биопсийных гистологических срезах, которые обрабатывают раствором протеиназы К, инкубируют, дегидратируют спиртом и наносят специфический олигонуклеотидный зонд, далее инкубируют с буфером-детектором, срезы заключают в канадский бальзам и исследуют под световым микроскопом. Кроме того, предложен тест-набор для осуществления способа, названный “Микро-вирус”. Изобретение позволяет повысить специфичность определения вирусов в инфицированных клетках. 2 с. п. ф-лы.

Изобретение относится к области медицины и, в частности, касается обнаружения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток. Такое обнаружение производится в биопсийных гистологических препаратах.

Среди вирусов, инфекционных для человека и животных, существует большое количество таких, которые в ходе инфекционного цикла включают свой генетический материал (т. е. молекулу ДНК) в состав хромосомы инфицированной клетки, после чего генетическая информация вируса передается потомству данной инфицированной клетки. По этой схеме построен инфекционный цикл вирусов папилломы (вызывает инфекционную папиллому, кандилому и ряд злокачественных опухолей) и полиомы человека, вируса иммунодефицита человека (вызывает СПИД), интеграция часто наблюдается при инфекции вирусами герпеса различных типов, в т. ч. т. н. вирусом Эпштейна-Барр или герпес-4 (вызывает инфекционный мононуклеоз и ряд злокачественных опухолей)) и др. Эти группы вирусов в высшей степени важны, поскольку вызываемые ими заболевания широко распространены и представляют существенную опасность, а их диагностика и клинический прогноз в настоящее время несовершенны.

Основной метод определения вирусной ДНК, используемый в настоящее время, – метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Его принципиальный недостаток – невозможность определить, в каких именно клетках или тканях больного присутствует вирус (т. е. можно определить только сам факт наличия вируса в крови больного или биопсийном материале).

Принцип способа и набора для определения инфекционных и онкогенных вирусов основан на
– денатурации ДНК в клеточных ядрах (на микроскопических срезах) и последующей ренатурации со специфическим олигонуклеотидным зондом – такая ренатурация происходит только при наличии в данной клетке вирусной ДНК;
– присоединении к специфическому олигонуклеотидному зонду, модифицированному биотином, комплекса стрептавидина и щелочной фосфатазы;
– получении окрашенного продукта щелочной фосфатазы и его регистрация при помощи светового микроскопа.

Принцип специфической денатурации-ренатурации является фундаментальным принципом физико-химии нуклеиновых кислот. В общем он описан во многих руководствах по нуклеиновым кислотам, например “Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот”, под ред. А. С. Спирина, 1990. В применении к вирусу папилломы человека (ВПЧ) он описан:
Boshart M. et. al. A new type of papillomavims DNA, its presence in genital cancer biopsies. . . EMBO J. 1984, 3, 1151-1157.

Lorincz A. T. et. al. A new type of papillomavims associated with cancer. . . Virology 1987, 159, 187-190.

Принцип использования биотиновой модификации с последующим присоединением фермента и получением окрашенного продукта также является общепринятым; в применении к ВПЧ он описан:
Brigati D. J. et. al. Detection of viral genomes in cultured cells and paraffin-embedded tissue. . . Virology 1983, 126, 32-50.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа и набора, которые способны решить проблему специфического определения вирусов в инфицированных клетках.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Способ определения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток, проводят на гистологических срезах. Последние обрабатывают раствором протеиназы К и инкубируют во влажной камере при 37^oС 15 минут, далее раствор протеиназы сливают, а срезы промывают дистиллированной водой и дегидратируют спиртом, повышая концентрацию спирта при каждой последующей обработке, затем срезы высушивают и наносят олигонуклеотидный зонд, выбранный из группы:
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac – тип 6 зонд
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta – тип 11 зонд
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg – тип 18 зонд
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa – тип 16 зонд
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct – тип 6/11 зонд
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag – тип 16 зонд
объединенные в наборы
ВПЧ универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 – универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18-зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 – онко-зонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 – онко-зонды 3,4,6
и инкубируют во влажной камере при 37^oС 90-120 мин, далее срезы промывают раствором, содержащим формамид 50% SSC 0,5х, рН 7,0 и раствором, содержащим трис-HCL рН 8,0 и NaCl, наносят буфер-детектор, содержащий стрептавидин и щелочную фосфатазу в соотношении 10: 2: 1, инкубируют при 37^oС в течение 30 мин, неоднократно промывают раствором солей Трис-НСl и NaCl, наносят раствор реагента, включающего Трис-НСl рН 9,5, NaCl, MgCl, NAN₃ и левамизол, инкубируют во влажной камере в темноте при 37^oС 30 мин, неоднократно промывают раствором, содержащим Трис-НСl и NaCl, затем дистиллированной водой, дегидратируют спиртом и ксилолом, срезы заключают в канадский бальзам и исследуют под световым микроскопом.

Кроме того, предложен тест-набор для осуществления способа, названный заявителем “Микро-вирус”, который содержит
а) олигонуклеотидные зонды для обнаружения ВПЧ
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac – тип 6 зонд
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta – тип 11 зонд
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg – тип 18 зонд
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa – тип 16 зонд
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct – тип 6/11 зонд
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag – тип 16 зонд
объединенные в наборы
ВПЧ универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 – универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 – зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 – онко-зонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 – онко-зонды 3,4,6
раствор:
SSC 2х (рН 7,0)
формамид 50%
декстрансульфат 5%
б) раствор промывочный для гибридизации:
формамида 50%
SSC 0,5x, рН 7,0
в) буфер-детектор. Сигма, А 4955.

г) стрептавидин, раствор 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе ( 3).

д) биотинилированная щелочная фосфатаза, 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе ( 3).

е) NBT-BCIP – реагент, 200 мкл. Сигма, В1911.

ж) протеиназа К, 5 мг, лиофилизированная.

з) реакционный буфер:
Трис-НСl 50 mM, рН 9,5, NaCl 100 mМ, MgCl₂ 1 mM, NaN₃ 0,1%
левамизол 0,1 мМ.

и) смесь солей для промывочного раствора – на 1 л:
Трис-НСl 50 mM, рН 8,0, NaCl 150 mM.

Тест-набор “Микро-вирус” предназначен для обнаружения интегрированного вируса и определения типа этого вируса в инфицированных клетках.

Вирус папилломы человека (ВПЧ). Тест-наборы “Микро-вирус” ВПЧ-универсал для определения ВПЧ любого типа, “Микро-вирус” ВПЧ-6/11 для определения ВПЧ типов 6 и 11, “Микро-вирус” ВПЧ-16/18 для определения ВПЧ типов 16 и 18 предназначены для определения перечисленных типов ВПЧ.

При анализе и лечении папилломы человека необходимо знать, какой тип вируса вызвал данную папиллому. Во-первых, в зависимости от типа вируса используются разные протоколы лечения. Во-вторых, вирусы типов 6 и 11 являются высокоонкогенными для папилломы и при их обнаружении необходима антиопухолевая терапия. Эти вирусы выявляются набором ВПЧ-6/11, а если папиллома вызвана другим, менее опасным типом ВПЧ, он выявляется набором ВПЧ-универсал.

При кандиломе высокоонкогенными являются типы 16 и 18, а тип 6 – среднеонкогенным. Таким образом, необходимую информацию для прогноза и лечения также можно получить, используя набор “Микро-вирус”.

Помимо этого при начале опухолевого процесса, вызванного вирусом папилломы, в человеческих хромосомах остаются только два гена ВПЧ, т. н. вирусные онкогены Е6 и Е7. Набор ВПЧ-универсал позволяет зарегистрировать этот факт (в наборе есть соответствующий олигонуклеотидный зонд на ген Е6) и сделать вывод о переходе инфекционного процесса в опухолевый, что необходимо для правильного лечения такого заболевания.

При использовании тест-набора “Микро-вирус” инфицированная клетка непосредственно видна под микроскопом, что дает возможность прямо определить тип ткани, локализацию в пораженном органе, морфологические изменения инфицированной клетки и т. д. Эта информация, необходимая для определения диагноза, прогноза развития заболевания, оптимального пути лечения, не может быть получена ни методом ПЦР, ни каким-либо другим путем.

Единственный существующий в настоящее время метод определения ВПЧ, основанный на аналогичном принципе, используется в наборе PathoGene фирмы Enzo.

Однако набор “Микро-вирус” отличается от него:
– стрептавидин и щелочная фосфатаза включены в состав набора “Микро-вирус” раздельно, это дает возможность менять их соотношение для оптимизации определения вируса;
– использование коротких олигонуклеотидных зондов (длина 30 нуклеотидов) дает возможность использовать одну отмывку раствором для гибридизации вместо трех, что ускоряет определение;
– набор “Микро-вирус” позволяет не проводить дополнительное окрашивание клеток, что создает оптимальное соотношение сигнала и фона и предохраняет от маскировки специфического сигнала дополнительным клеточным красителем;
– используемый для набора “Микро-вирус” химические синтез и модификация специфических зондов выгодно отличаются от энзиматических, применяемых в PathoGene, поскольку позволяют достичь более высокой регулярности модификации зондов, т. е. более высокой специфичности и воспроизводимости результатов;
– модификация производится по стандартной методике с использованием препарата “Biotin-x-x-NHS” производства компании “Сигма”;
– наличие в наборе “Микро-вирус” специфического зонда для определения вирусного онкогена Е6 позволяет использовать его для диагностики вирус-зависимой злокачественной опухоли.

В отличие от набора PathoGene “Микро-вирус” предназначен для диагностических целей.

Кроме того, в состав набора “Микро-вирус” для ВПЧ входят новые олигонуклеотидные зонды, имеющие оригинальную нуклеотидную последовательность.

Специфические олигонуклеотидные зонды
В каждый из этих тест-наборов включены специфические олигонуклеотидные зонды, соответствующие определяемому типу вируса:
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac – тип 6 зонд (37-46 по L1)
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta – тип 11 зонд (48-77 по L1)
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg – тип 18 зонд (95-124 по L1)
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa – тип 16 зонд (30-59 по L1)
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct – тип 6/11 зонд (138-167 по Е6)
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag – тип 16 зонд (45-74 по Е7)
примечание: в скобках приведены названия генов и цифрами указаны порядковые номера нуклеотидов в этих генах, которые соответствуют нуклеотидным последовательностям зондов. Зонды для набора “Микро-вирус” ВПЧ (всего 7 вариантов набора):
ВПЧ-универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 – универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 – зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 – онко-зонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 – онко-зонды 3,4,6
Конкретный пример осуществления способа 1.

Готовят парафиновые срезы гистологического материала толщиной 4-6 мкм. При этом используют высокоадгезивные стекла, предварительно обработанные раствором полилизина или силана.

Срезы высушивают в вертикальном положении 18 часов при температуре 60-80^oС. При необходимости готовые срезы хранят при 4^oС.

Далее срезы выдерживают при температуре 60-80^oС 5-15 мин и проводят депарафинирование обработкой:
Ксилол – 10 мин
Ксилол – 2 мин
100% спирт – 1 мин
100% спирт – 1 мин
96% спирт – 1 мин
70% спирт – 1 мин
5-% спирт – 1 мин и
дистиллированной водой – 1 мин.

Стекла высушивают 5-10 мин при температуре 37^oС и на каждый срез наносят по 100 мкл раствора протеиназы К в рабочем разведении и инкубируют при 37^oС 15 мин во влажной камере.

Для приготовления раствора протеиназы К в рабочем разведении растворяют 5 мг лиофилизированной протеиназы К в 2 мл промывочного раствора. Полученный раствор является концентратом 10х, его разделяют на аликвоты 100-300 мкл и хранят замороженным при -20^oС. Срок хранения замороженного раствора – 1 год, повторное замораживание не допускается.

Для приготовления раствора протеиназы К в рабочем разведении размораживают концентрат 10х и разводят в 10 раз промывочным раствором. При комнатной температуре рабочий раствор стабилен 1 час, хранение рабочего раствора не допускается.

При комнатной температуре сливают со срезов раствор протеиназы К, промывают дистиллированной водой и дегидратируют по следующей схеме:
Н₂О дистиллированная – 1 мин
50% спирт – 1 мин
70% спирт – 1 мин
96% спирт – 1 мин.

Срезы высушивают при температуре 37^oС 5-10 мин. При необходимости подготовленные срезы можно хранить при 4^oС до 1 недели.

Затем наносят на срез 50 мкл ВПЧ ДНК зонда. Аккуратно без пузырей накрывают покровным стеклом и стекла инкубируют при температуре 95^oС 3-10 мин, далее срезы, не снимая покровных стекол, помещают во влажную камеру для инкубации при 37^oС на 90-120 мин, осторожно удаляют со срезов покровные стекла и наносят на срезы 100 мкл промывочного раствора для гибридизации и инкубируют 2 мин.

Осторожно сливают со стекол раствор и еще раз наносят на срез промывочный раствор для гибридизации и инкубируют во влажной камере при 37^oС 10 мин. Срезы промывают 3 раза промывочным раствором по 1 мин при комнатной температуре. На срезы наносят реагент-детектор по 100 мкл и инкубируют во влажной камере при 37^oС 30 мин.

Приготовление реагента-детектора:
В буфер-детектор добавляют раствор стрептавидина 1: 5 по объему и раствор биотинированной щелочной фосфатазы 1: 10 по объему, осторожно перемешивают и выдерживают при 37^oС 30 мин. После этого готовый реагент-детектор можно наносить на срезы.

Срезы промывают 3 раза промывочным раствором по 1 мин. На срезы наносят раствор NBT/BCIP реагента по 100 мкл на срез и инкубируют во влажной камере в темноте! при 37^oС 30 мин.

Приготовление NBT/BCIP реагента:
Готовят 2% NBT/BCIP реагент в реакционном буфере, приготовленный раствор берегут от прямых солнечных лучей. Срезы промывают 3 раза промывочным раствором по 1 мин, затем дистиллированной водой 1 мин, дегидратируют:
96% спирт – 1 мин
100% спирт – мин
100% спирт – 1 мин
Ксилол – 1 мин
и заключают в канадский бальзам (или другую среду) под покровное стекло. Препарат исследуют под световым микроскопом.

Конкретный пример 2.

СОСТАВ НАБОРА.

а) Пробы олигонуклеотидные для обнаружения ВПЧ, универсальная и тип-специфические, растворы по 1 мл, 10 о. е. /мл;
Раствор:
SSC 2х (рН 7,0)
формамид 50%
декстрансульфат 5%
б) Раствор промывочный для гибридизации, 10 мл.

Формамида 50%
SSC 0,5x, рН 7,0
в) Буфер-детектор, 10 мл. Сигма, А 4955.

г) Стрептавидин, раствор 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе, 2 мл.

д) Биотинилированная щелочная фосфатаза, 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе, 1 мл.

е) NBT/BCIP – реагент, 200 мкл. Сигма, В 1911.

ж) Протеиназа К, 5 мг, лиофилизированная.

з) Реакционный буфер, 10 мл:
Трис-НСl 50 mM, рН 9,5; NaCl 100 mМ, MgCl₂ 1 mM, NaN₃ 0,1%
Левамизол 0,1 мМ.

и) Смесь солей для промывочного раствора – на 1 л:
Трис-НСl 50 mM, рН 8,0; NaCl 150 mM.

к) Контрольные препараты (3 шт. )

Формула изобретения

1. Способ определения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток, характеризующийся тем, что гистологические срезы обрабатывают раствором протеиназы К и инкубируют во влажной камере при 37^oС 15 мин, далее раствор протеиназы сливают, а срезы промывают дистиллированной водой и дегидратируют спиртом, повышая концентрацию спирта при каждой последующей обработке, затем срезы высушивают и наносят олигонуклеотидный зонд, выбранный из группы:
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac – тип 6 зонд;
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta – тип 11 зонд;
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg – тип 18 зонд;
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa – тип 16 зонд;
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct – тип 6/11 зонд;
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag – тип 16 зонд;
объединенные в наборы
ВПЧ – универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 – универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 – зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 – онкозонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 – онкозонды 3,4,6;
и инкубируют во влажной камере при 37^oС 90-120 мин, далее срезы промывают раствором, содержащим формамид 80% SSС 0,5х, рН 7,0, и раствором, содержащим трис-НСL рН 8,0 и NaCl, наносят буфер-детектор, содержащий стрептавидин и щелочную фосфатазу в соотношении 10: 2: 1, инкубируют при 37^o в течение 30 мин, неоднократно промывают раствором солей Трис-НСl и NaCl, наносят раствор реагента, включающего Трис-НСl рН 9,5, NaCl, MgCl, NAN₃ и левамизол, инкубируют во влажной камере в темноте при 37^oС 30 мин, неоднократно промывают раствором, содержащим Трис-HCl и NaCl, затем дистиллированной водой, дегидратируют спиртом и ксилолом, срезы заключают в канадский бальзам и исследуют под световым микроскопом.

2. Набор для индикации инфекционных и онкогенных вирусов интегрированных в хромосомы инфицированных клеток, характеризующийся тем, что он содержит а) олигонуклеотидные зонды для обнаружения ВПЧ:
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac – тип 6 зонд;
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta – тип 11 зонд;
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg – тип 18 зонд;
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa – тип 16 зонд;
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct – тип 6/11 зонд;
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag – тип 16 зонд;
объединенные в наборы
ВПЧ – универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 – универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 – зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 – зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 – онкозонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 – онкозонды 3,4,6;
Раствор: SSC2x (рН 7,0), формамид 50%, декстрансульфат 5%,
б) Раствор промывочный для гибридизации, 10 мл, формамида 50%, SSC 0,5х, рН 7,0.

в) Буфер-детектор. Сигма, А4955.

г) Стрептавидин, раствор 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе.

д) Биотинилированная щелочная фосфатаза, 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе.

е) NBT|BCIP-реагент, 200 мкл. Сигма, В 1911.

ж) Протеиназа К, 5 мг, лиофилизированная.

з) Реакционный буфер: трис-НСl 50 mM, pH 9,5; NaCl 100 mM, MgCl₂ 1 mM, NaN₃ 0,1%, левамизол 0,1 мМ
и) Смесь солей для промывочного раствора – на 1 л: трис-HCl 50 mM, pH 8,0; NaCl 150 mM.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 31.03.2006

Извещение опубликовано: 20.02.2007 БИ: 05/2007

NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 20.08.2007

Извещение опубликовано: 20.08.2007 БИ: 23/2007

PC4A Государственная регистрация перехода исключительного права без заключения договора

(73) Патентообладатель(и):

Иткес Александр Веньяминович

(73) Патентообладатель:

Иткес Александр Александрович

(73) Патентообладатель:

Туницкая Вера Леонидовна

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 22.04.2010 № РП0000731

Извещение опубликовано: 10.06.2010 БИ: 16/2010