Патент на изобретение №2177997

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ В

(57) Реферат:

Изобретение относится к биохимии, в частности к способу выделения карбоксипептидазы В из свиной поджелудочной железы, и может быть использовано при получении генно-инженерных продуктов в биотехнологии. Сущность изобретения заключается в том, что экстракцию, осаждение сульфатом аммония и очистку проводят в буферных растворах, содержащих 1-10 мМ L-аргинина. При этом очистку проводят хроматографическим методом сначала с использованием в качестве сорбента оксиапатита, затем – ДЕАЕ-сефарозы. Способ обеспечивает повышение выхода карбоксипептидазы В.

Изобретение относится к биохимии, в частности к способу выделения карбоксипептидазы В из свиной поджелудочной железы, и может быть использовано в биотехнологии при получении генно-инженерных продуктов.

Известен способ выделения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиньи, включающий экстракцию животного сырья ацетоном, обработку экстракта сульфатом аммония, выделение и очистку целевого продукта методом ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе.

(Авторское свидетельство СССР 1551742, МКИ С 12 N 9/48, 1987).

К недостаткам способа относится необходимость использования органического растворителя – ацетона и невысокая удельная активность целевого продукта – 107,4-151,5 ед/мг белка.

Известен способ выделения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы млекопитающих животных, включающий гомогенизацию поджелудочной железы, автолиз, дробное осаждение сульфатом аммония и последующую очистку целевого продукта диализом.

(Патент СССР 1487817, МКИ С 12 N 9/64, опублик. 1989).

К недостаткам известного способа относится недостаточно высокий выход целевого продукта: по активности выход не превышает 98230 ед/кг поджелудочной железы.

Изобретение решает задачу повышения выхода карбоксипептидазы В.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения карбоксипептидазы В из свиной поджелудочной железы, включающем гомогенизацию и автолиз животного сырья, проводят экстракцию, осаждение сульфатом аммония и очистку целевого продукта в буферных растворах, содержащих 1-10 мМ L-аргинина, при этом очистку проводят хроматографическим методом сначала с использованием в качестве сорбента оксиапатита, затем – DEAE-сефарозы.

Изобретение осуществляют следующим образом:
Замороженные при -45^oС свиные поджелудочные железы размораживают, убирают жир и соединительные ткани, измельчают в гомогенизаторе и инкубируют в течение ночи (7-19 час) при 25^oС.

160 г автолизата поджелудочной железы переносят в емкость, содержащую 160 мл 10 мМ калий(натрий) фосфатного буфера с 1-10 мМ L-аргинином, рН 6,5, и экстрагируют в течение 20 мин.

Суспензию охлаждают и центрифугируют. Супернатант собирают, а к осадку добавляют 80 мл буферного раствора и экстрагируют повторно в тех же условиях. Полученный после центрифугирования осадок отбрасывают, супернатанты объединяют, к раствору прибавляют на холоду (+4^oС) сульфат аммония из расчета 210 г/л, суспензию перемешивают в течение 2-х часов, затем центрифугируют, осадок отбрасывают, а к супернатанту вновь прибавляют сульфат аммония из расчета 165 г/л, суспензию перемешивают на холоду в течение 2-х часов, а полученный после центрифугирования осадок растворяют в 5 мМ Na-фосфатном буфере с 1-10 мМ L-аргинином, рН 6,8, и нагревают на водяной бане в течение 10 мин.

Полученную суспензию охлаждают и центрифугируют в течение 30 мин. Супернатант наносят на колонку с оксиапатитом, предварительно уравновешенным 5 мМ Na-фосфатным буфером с 1 -10 мМ L-аргинином, рН 6,8 и затем элюируют белок тем же буфером в градиенте хлористого натрия.

Фракции со специфической активностью объединяют, белок осаждают на холоду сульфатом аммония (из расчета 375 г/л), перемешивают 2 часа и центрифугируют. Полученный осадок растворяют в 5 мМ трис-НСl буфере с 1-10 мМ L-аргинином (рН 7,5).

Раствор диализуют против того же буфера, центрифугируют, осадок отбрасывают, а полученный раствор белка наносят на помещенную в колонку DEAE-сефарозу, предварительно уравновешенную 5 мМ трис-НСl буфером с 1-10 мМ L-аргинином, рН 7,5, элюируют белок тем же буфером в градиенте хлористого натрия от 0 до 0,5 М. Фракции, содержащие активный фермент, объединяют, фасуют и замораживают.

Выход карбоксипептидазы В (по активности) в зависимости от содержания L-аргинина составляет 77950-123750 ед/кг сырья, а удельная активность фермента – 180-220 ед/мг белка.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Замороженные при -45^oС свиные поджелудочные железы размораживают и обрабатывают, убирая жир и соединительные ткани. 160 г обработанных желез измельчают на гомогенизаторе РТ-1 (размельчитель тканей) на скорости 8000 об/мин в течение 20 мин, гомогенат выгружают в эмалированный поддон, накрывают его плотной бумагой и инкубируют в шейкере в течение ночи при 25^oС.

Автолизат поджелудочной железы переносят в круглодонную колбу, содержащую 160 мл 10 мМ калий-фосфатного буфера с 5 мМ L-аргинином, рН 6,5, подогретого до 60^oС, и инкубируют, перемешивая в водяной бане при 60^oС в течение 20 мин. Суспензию охлаждают под струей холодной воды и центрифугируют в течение 30 мин при 25000 g. Получают 180 мл супернатанта. Осадок экстрагируют повторно в тех же условиях, добавив 80 мл буфера при соотношении исходной массы осадка к объему буферного раствора, равном 2: 1. Получают 140 мл супернатанта.

К объединенному супернатанту объемом – 320 мл прибавляют на холоду (+4^oС) 67,2 г сульфата аммония и перемешивают на магнитной мешалке 2 часа, центрифугируют при 25000g в течение 30 мин, осадок отбрасывают, к супернатанту прибавляют 52,8 г твердого сульфата аммония, суспензию перемешивают 2 часа, после чего преципитат осаждают центрифугированием в течение 30 минут при 25000 g, супернатант отбрасывают, а осадок растворяют в 80 мл 5 мМ натрий-фосфатного буфера с 5 мМ L-аргинином рН 6,8.

Раствор фермента переносят в нагретую круглодонную колбу, перемешивают, инкубируют на водяной бане при 60^oС в течение 20 минут. Полученную суспензию охлаждают под струей холодной воды и центрифугируют в течение 30 мин при 25000g. Получают 93 мл супернатанта.

В хроматографическую колонку, наполненную оксиапатитом в объеме 140 мл, уравновешенным 5 мМ натрий-фосфатным буфером с 5 мМ L-аргинином, рН 6,8, наносят 93 мл супернатанта, сорбент промывают исходным буфером и элюируют белок тем же буфером в градиенте хлористого натрия от 0 до 1,2 М. Фракции со специфической активностью объединяют, белок высаживают на холоду (+4^oС) из раствора объемом 400 мл сульфатом аммония в количестве 150 г, перемешивают на магнитной мешалке 2 часа при +4^oС и центрифугируют при 25000 g в течение 30 минут. Осадок растворяют в 50 мл 5 мМ трис-НСl буфера с 5 мМ L-аргинином, рН 7,5, полученный раствор диализуют трижды против того же буфера, центрифугируют 20 минут при 25000 g.

Супернатант передают на следующую стадию очистки.

Раствор белка (67 мл) наносят на помещенную в колонку ДЕАЕ-сефарозу (объем 60 мл), предварительно уравновешенную 5 мМ трис-НСl буфером с 5 мМ аргинином, рН 7,5, промывают исходным буфером и элюируют белок тем же буфером в градиенте хлористого натрия от 0 до 0,5 М.

Фракции, содержащие активный фермент, объединяют, фасуют и замораживают. Суммарный объем раствора фермента 45 мл, содержание белка 90 мг.

Активность карбоксипептидазы В по гиппурил-L-аргинину суммарная – 19800 ед, удельная – 220 ед/мг белка.

Выход карбоксипептидазы В по активности 42%. Выход активности в пересчете на кг поджелудочной железы 123750 ед/кг.

Замороженный раствор фермента хранится при температуре -45^oС не менее года.

Пример 2.

Выделение карбоксипептидазы В проводят по примеру 1 с тем отличием, что стадии экстракции, осаждения и очистки проводят в буферных растворах, содержащих 10 мМ L-аргинина.

Удельная активность полученной карбоксипептидазы В составляет 210 ед/мг белка, выход (по активности) составляет 117500 ед/кг сырья.

Пример 3.

Выделение карбоксипептидазы В проводят по примеру 1 с тем отличием, что стадии экстракции, осаждения и очистки проводят в буферных растворах, содержащих 1 мМ L-аргинина.

Удельная активность полученной карбоксипептидазы В составляет 180 ед/мг белка, выход (по активности) составляет 77950 ед/кг сырья.

Пример 4.

Выделение карбоксипептидазы В проводят по примеру 1 с тем отличием, что стадии экстракции, осаждения и очистки проводят в буферных растворах, содержащих 2 мМ L-аргинина.

Удельная активность полученной карбоксипептидазы В составляет 195 ед/мг белка, выход (по активности) составляет 89100 ед/кг сырья.

Пример 5 (контрольный)
Выделение карбоксипептидазы В проводят по примеру 1 с тем отличием, что стадии экстракции, осаждения и очистки проводят в буферных растворах, не содержащих L-аргинина.

Удельная активность полученной карбоксипептидазы В составляет 170 ед/мг белка, выход (по активности) составляет 37500 ед/кг сырья.

Пример 6 (контрольный)
Выделение карбоксипептидазы В проводят по примеру 1 с тем отличием, что стадии экстракции, осаждения и очистки проводят в буферных растворах, содержащих 5 мМ глицина.

Удельная активность полученной карбоксипептидазы В составляет 175 ед/мг белка, выход (по активности) составляет 38400 ед/кг сырья.

Пример 7 (контрольный)
Выделение карбоксипептидазы В проводят по примеру 1 с тем отличием, что стадии экстракции, осаждения и очистки проводят в буферных растворах, содержащих 5 мМ L-глутаминовой кислоты.

Удельная активность полученной карбоксипептидазы В составляет 165 ед/мг белка, выход (по активности) составляет 38900 ед/кг сырья.

Пример 8 (контрольный)
Выделение карбоксипептидазы В проводят по примеру 1 с тем отличием, что стадии экстракции, осаждения и очистки проводят в буферных растворах, содержащих 5 мМ 6-аминокапроновой кислоты.

Удельная активность полученной карбоксипептидазы В составляет 180 ед/мг белка, выход (по активности) составляет 66800 ед/кг сырья.

Как видно из представленных примеров, в предлагаемом способе увеличение выхода карбоксипептидазы В достигается только при проведении процесса в присутствии L-аргинина. Проведение процесса в присутствии других аминокислот не оказывает значительного влияния на выход целевого продукта.

Формула изобретения

Способ выделения карбоксипептидазы В из свиной поджелудочной железы, включающий гомогенизацию животного сырья, автолиз и экстракцию в присутствии буферного раствора, дробное осаждение сульфатом аммония и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что экстракцию, дробное осаждение и очистку проводят в буферных растворах, содержащих 1-10 мМ L-аргинина, при этом очистку проводят хроматографическим методом сначала с использованием в качестве сорбента оксиапатита, затем – ДЕАЕ-сефарозы.

QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук

Вид лицензии*: НИЛ

Лицензиат(ы): Открытое акционерное общество “БИОРАН”

Договор № РД0024218 зарегистрирован 18.07.2007

Извещение опубликовано: 27.08.2007 БИ: 24/2007

* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия