Патент на изобретение №2177996

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ КЛЕТКИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности клеточной иммунологии. Сущность изобретения состоит в том, что в клеточной популяции (в культуре) повышают число СD 34⁺ клеток за счет взаимодействия клеточной популяции (например, гемопоэтических клеток) с антителом, например СР3/43, при этом антитело может быть использовано в сочетании с алкилирующим агентом, например циклофосфамидом. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для лечения заболеваний иммунной системы. 19 з. п. ф-лы, 20 табл. , 6 ил.

Настоящее изобретение относится к способу получения недифференцированной клетки.

В частности, настоящее изобретение относится к способу получения недифференцированной клетки из более коммитированной клетки.

Кроме того, настоящее изобретение к использованию недифференцированной клетки настоящего изобретения для получения новой более коммитированной клетки – т. е. рекоммитированной клетки.

Настоящее изобретение также относится к использованию недифференцированной клетки настоящего изобретения или рекоммитированной клетки настоящего изобретения, которая бы оказывала влияние (прямо или косвенно посредством использования полученных из нее продуктов) на иммунную систему, такое как облегчение симптомов, связанных с, или на частичное или полное излечение от иммунологического состояния или заболевания.

В качестве введения, дифференциация представляет процесс, в результате которого структуры и функции клеток прогрессивно коммитируются для обеспечения развития в более специализированные клетки, такой как образование Т-клеток или В-клеток. Поэтому, по мере того как клетки становятся более коммитированными, они становятся более специализированными.

Напротив, ретродифференциация представляет процесс, в результате которого структуры и функции клеток прогрессивно меняются для обеспечения развития в менее специализированные клетки.

Недифференцированное клетки способны дифференцироваться по многим линиям, т. е. они способны дифференцироваться в два или более типов специализированных клеток. Типичным примером недифференцированной клетки является стволовая клетка.

Напротив, дифференцированные клетки неспособны дифференцироваться по многим линиям. Типичным примером дифференцированной клетки является Т-клетка.

Существует много недифференцированных клеток и дифференцированных клеток, обнаруженных in vivo, и общая наука богата общими представлениями о них.

В качестве примера, можно сделать ссылку, наряду с другими, на Levitt and Mertelsman, 1995 (Haematopoietic Stem Cells, published Marcel Dekker Inc. – в частности, страницы 45-59) и Roitt et al. (Immunology, 4 th Edition, Eds. Roitt, Brostoff and Male, 1996, Publ. Mosby – в частности, глава 10).

Вкратце, однако, примеры недифференцированных клеток включают лимфогематопоэтические клетки – предшественники (LPC). LPC включают плюрипотентные стволовые клетки (PSC), лимфоидные стволовые клетки (LSC) и миелоидные стволовые клетки (MSC). LSC и MSC – каждые образованы дифференциацией PSC. Следовательно, LSC и MSC являются более коммитированными, чем PSC.

Примеры дифференцированных клеток включают Т-клетки, В-клетки, эозинофилы, базофилы, нейтрофилы, мегакариоциты, моноциты, эритроциты, гранулоциты, тучные клетки и лимфоциты.

Т-клетки и В-клетки образованы посредством дифференциации LSC. Следовательно, Т-клетки и В-клетки являются более коммитированными, чем LSC.

Эозинофилы, базофилы, нейтрофилы, мегакариоциты, моноциты, эритроциты, гранулоциты, тучные клетки, естественные клетки – киллеры (NK) и лимфоциты образуются посредством дифференциации MSC. Следовательно, каждые из этих клеток являются более коммитированными, чем MSC.

Антигены связаны с недифференцированными и дифференцированными клетками. Термин “связаны” здесь обозначает клетки, экспрессирующие или способные экспрессировать или представляющие или способные быть индуцированными представлять или включающие соответствующий антиген(ы).

Большинство недифференцированных клеток и дифференцированных клеток включают антигены класса I и/или антигены класса II главного комплекса гистосовместимости (МНС). Если эти антигены связаны с теми клетками, то они называются клетками Класса I⁺ и/или клетками Класса II⁺.

Каждый специфический антиген, связанный с недифференцированной клеткой или с дифференцированной клеткой, может действовать в качестве маркера. Следовательно, различные типы клеток можно отличить друг от друга на основании связанного с ними данного антигена (антигенов) или на основании данной комбинации связанных антигенов.

Примеры этих маркерных антигенов включают антигены CD34, CD19 и CD3. Если эти антигены присутствуют, то эти конкретные клетки называются соответственно CD34⁺, CD19⁺ и CD3⁺. Если эти антигены не присутствуют, то эти конкретные клетки называются CD34^–, CD19^– и CD3^–.

Более подробно, PCS представляют клетки CD34⁺. LSC представляют клетки DR⁺, CD34⁺ и TdT⁺. MSC представляют клетки CD34⁺, DR⁺, CD13⁺, CD33⁺, CD7⁺ и TdT⁺. В-клетки представляют клетки CD19⁺, CD21⁺, CD22⁺ и DR⁺. Т-клетки представляют клетки CD2⁺, CD3⁺, и/или CD4⁺, или CD8⁺. Незрелые лимфоциты представляют клетки CD4⁺ и CD8⁺. Активированные Т-клетки представляют клетки DR⁺. Естественные клетки-киллеры (NK) представляют клетки CD56⁺ и CD16⁺. Т-лимфоциты представляют клетки CD7⁺. Лейкоциты представляют клетки CD45⁺. Гранулоциты представляют клетки CD33⁺. Моноциты макрофаги представляют клетки CD16⁺ и DR⁺.

Следовательно, с помощью поиска присутствия перечисленных выше антигенных маркеров, можно идентифицировать определенные типы клеток (например, является или нет клетка недифференцированной клеткой или дифференцированной клеткой) и специализацию этого типа клеток (например, является ли эта клетка Т-клеткой или В-клеткой).

Общая концепция ретродифференциации не нова. Действительно, в 1976 г. Jose Uriel (Cancer Research 36, 4269-4275. November, 1976) представил обзор на эту тему, в котором он писал: “ретродифференциация представляется обычным адаптационным процессом для поддержания клеточной целостности в противодействие агентам различной этиологии (физическим, химическим и вирусным). Сохраняя всю информацию, закодированную в их геноме, клетки, подвергающиеся ретродифференциации, теряют морфологическое и функциональное разнообразие в результате процесса самоделеции цитоплазматических структур и перехода к более юному типу экспрессии гена. Это приводит к прогрессирующему развитию однотипности первоначально различных клеточных фенотипов и к снижению реактивности на регуляторные сигналы, функционирующие во взрослых клетках. Ретродифференциация в норме сбалансируется противоположно направленным процессом реонтогенеза, который имеет тенденцию восстанавливать конечные фенотипы, когда начинается реверсия. Это объясняет, почему ретродифференциация остается неизменно связанной с клеточной регенерацией и восстановлением тканей. “
Uriel (там же) затем продолжил обсуждение случаев выявленной ретродифференциации – таких как работа Gurdon, относящаяся к ядрам из клеток кишечного эпителия головастиков Xenopus (Advances in Morphogenesis [1966] vol 4, рр. 1-43. New York Academic Press, Eds Abercombie and Bracher) и работа Bresnick, относящаяся к регенерации печени (Methods in Cancer Research [1971] vol 6, рр. 347-391).

Uriel (там же) также сообщил о работе, относящейся к изолированным паренхиматозным клеткам печени для культур in vitro. По Uriel: “В отличие от результатов, полученных с гепатоцитами плода или новорожденных, при использовании гепатоцитов из регенерирующей печени или из установленных гепатом, было трудно получить линии постоянного класса из взрослых гепатоцитов в покое. “
Uriel также сообщил о видимой ретродифференциации при раке, причем он заявил: “биохимические фенотипы многих опухолей проявляют аналогичные изменения реверсии по направлению к незрелости. . . во время предраковой стадии канцерогенеза печени, происходит также ретродифференциация клеток. “
Более свежие данные о ретродифференциации включают работу Minoru Fukunda (Cancer Research [1981] vol 41, рр. 4621-4628). Fukunda вызывал специфические изменения профиля гликопротеида клеточной поверхности клеток лейкоза человека К562 с помощью использования способствующего развитию опухолей форболового эфира 12-О-тетрадеканоил-форбол-13-ацетата (ТРА). По Fukunda, TPA, как представляется, вызывает стадию ретродифференциации клеток лейкоза человека К562.

Наряду с этим, Hass et al. (Cell Growth & Differentiation [1991] vol 2, pp. 541-548) сообщили о долгосрочной культуре дифференцированных ТРА клеток лейкоза U-937 в отсутствии форболового эфира в течение 32-36 дней, что в результате привело к процессу ретродифференциации, и что ретродифференцированные клетки отделялись от субстрата и повторно начинали пролиферацию.

Еще один случай ретродифференциации содержится в работе Curtin and Snell (Вr. J. Cancer [1983] vol 48, pp. 495-505). Эти исследователи сравнили ферментные изменения, происходящие во время вызванного диэтилнитрозамином гепатоканцерогенеза, и регенерации печени после частичной гепатэктомии, с нормальной печеночной дифференциацией. Эти исследователи обнаружили изменения активности ферментов во время канцерогенеза, которые были аналогичны ступенчатому устранению дифференциации. По данным исследователей, полученные ими результаты свидетельствуют о том, что лежащий в основе процесс ретродифференциации является общим как для процесса гепатоканцерогенеза, так и для печеночной регенерации.

Более недавно Chastre et al. (FEBS Letters [1985] vol 188, number 2, pp. 2810-2811) сообщили о ретродифференциации канкрозного субклона толстой кишки человека НТ29-18.

Еще более недавно, Kobayashi et al. (Leukaemia Research [1994] vol 18, no. 12, pp. 929-933) сообщили об установлении ретродифференцированной клеточной линии (RD-1) из одиночной клетки крысиного миело – моноцитарного лейкоза, которая дифференцировалась в макрофагоподобную клетку под влиянием обработки липополисахаридом (LPS).

В соответствии с современным представлением, подтвержденным положениями, найденными на странице 911 книги Molecular Biology of the Cell (pub. Garland Publishers Inc. 1983) и более недавно no Levitt and Mertelsman (там же), стволовая клетка, такая как PSC, имеет следующие четыре характеристики:
i. она является недифференцированной клеткой – т. е. она не является окончательно дифференцированной;
ii. она способна делиться без ограничений;
iii. она способна дать развитие дифференцированному потомству, такому как дифференцированные клетки, упомянутые ранее; и
iv. когда она делится, каждая дочерняя клетка имеет выбор: она может или оставаться в виде PSC как ее партнер, или она может встать на путь, необратимо ведущий к окончательной дифференциации.

Следует подчеркнуть последнюю характеристику, а именно, что в соответствии с общими положениями в этой области знаний, как только недифференцированная клетка дифференцировалась в более коммитированную клетку, она затем не может ретродифференцироваться. Это представление было даже поддержано положениями Uriel (там же), Fukunda (там же), Hass et al. (там же), Curtin and Snell (там же), Chastre et al. (там же) и Kobayashi et al. (там же), так как эти исследователи ретродифференцировали определенные типы дифференцированных клеток, но при этом эти клетки оставались коммитированными к одной и той же линии, и они не ретродифференцировали в недифференцированные клетки.

Поэтому, в соответствии с научными представлениями перед настоящим изобретением, считалось, что было невозможно образовать недифференцированные клетки, такие как стволовые клетки, из более коммитированных клеток. Однако настоящее изобретение показывает, что это представление неточное, и что возможно образовать недифференцированные клетки из более коммитированных клеток.

Таким образом, в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, предоставляется способ получения недифференцированной клетки, причем способ включает контактирование более коммитированной клетки с агентом, который вызывает ретродифференциацию более коммитированной клетки в недифференцированную клетку.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения, предоставляется способ, включающий контактирование более коммитированной клетки с агентом, который вызывает ретродифференциацию более коммитированной клетки в недифференцированную клетку; и затем коммитирование недифференцированной клетки в рекоммитированную клетку.

Термин “рекоммитированная клетка” обозначает клетку, полученную из недифференцированной клетки – т. е. , новую, более коммитированную клетку.

В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения, предоставляется недифференцированная клетка, полученная в соответствии со способом настоящего изобретения.

В соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения, предоставляется недифференцированная клетка, полученная в соответствии со способом настоящего изобретения в качестве или при получении лекарственного препарата.

В соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения, предоставляется использование недифференцированной клетки, полученной в соответствии со способом настоящего изобретения, в производстве лекарственного препарата для лечения иммунологического расстройства или заболевания.

В соответствии с шестым аспектом настоящего изобретения, предоставляется рекоммитированная клетка, полученная в соответствии со способом настоящего изобретения.

В соответствии с седьмым аспектом настоящего изобретения, предоставляется рекоммитированная клетка, полученная в соответствии со способом настоящего изобретения в качестве или при получении лекарственного препарата.

В соответствии с восьмым аспектом настоящего изобретения, предоставляется использование рекоммитированной клетки, полученной в соответствии со способом настоящего изобретения, в производстве лекарственного препарата для лечения иммунологического расстройства или заболевания.

В соответствии с девятым аспектом настоящего изобретения, предоставляется более коммитированная клетка, имеющая прикрепленный к ней агент, который может вызвать ретродифференциацию более коммитированной клетки в недифференцированную клетку.

В соответствии с десятым аспектом настоящего изобретения, предоставляется клетка CD19⁺ и CD3⁺.

Таким образом, в своем самом широком смысле, настоящее изобретение основано на крайне удивительной находке, что возможно образовать недифференцированную клетку из более коммитированной клетки.

Настоящее изобретение имеет большое преимущество, поскольку в настоящее время возможно получить недифференцированные клетки из более коммитированных клеток и затем использовать эти недифференцированные клетки в качестве или для получения лекарственных препаратов или in vitro или in vivo или их комбинаций для лечения расстройств.

Настоящее изобретение имеет также преимущество, так как возможно коммитировать недифференцированную клетку, полученную с помощью ретродифференциации в рекоммитированную клетку, такую как новая дифференцированная клетка, имея в виду коррекцию или удаление первоначальной более коммитированной клетки или для коррекции или удаления ее продукта.

Предпочтительно, более коммитированная клетка способна ретродифференцироваться в недифференцированную клетку I⁺ Класса и/или II⁺ Класса МНС.

Предпочтительно, более коммитированная клетка способна ретродифференцироваться в недифференцированную клетку, включающую антиген стволовой клетки.

Предпочтительно, более коммитированная клетка способна ретродифференцироваться в недифференцированную клетку CD34⁺.

Предпочтительно, более коммитированная клетка способна ретродифференцироваться в лимфогематопоэтическую клетку – предшественника.

Предпочтительно, более коммитированная клетка способна ретродифференцироваться в плюрипотентную стволовую клетку.

Недифференцированная клетка может включать любые компоненты, которые имеют отношение к представлению антигена, его захвату или распознаванию. Предпочтительно, недифференцированная клетка представляет клетку I⁺ Класса и/или II⁺ Класса МНС.

Предпочтительно, недифференцированная клетка включает антиген стволовой клетки.

Предпочтительно, недифференцированная клетка представляет недифференцированную клетку CD34⁺.

Предпочтительно, недифференцированная клетка представляет лимфогематопоэтическую клетку – предшественника.

Предпочтительно, недифференцированная клетка представляет плюрипотентную стволовую клетку.

Более коммитированная клетка может включать любые компоненты, которые имеют отношение к представлению антигена, его захвату или распознаванию. Предпочтительно, недифференцированная клетка представляет клетку I⁺ Класса и/или II⁺ Класса МНС.

Предпочтительно, агент действует внеклеточно по отношению к более коммитированной клетке.

Предпочтительно, более коммитированная клетка включает рецептор, который может функционально вовлекаться агентом, и в котором агент функционально вовлекает рецептор.

Предпочтительно, рецептор представляет рецептор клеточной поверхности.

Предпочтительно, рецептор включает -компонент и/или -компонент.

Предпочтительно, рецептор включает -цепь, имеющую гомологичные регионы.

Предпочтительно, рецептор включает по крайней мере гомологичные регионы -цепи HLA-DR.

Предпочтительно, рецептор включает -цепь, имеющую гомологичные регионы.

Предпочтительно, рецептор включает по крайней мере гомологичные регионы -цепи HLA-DR.

Предпочтительно, агент представляет антитело к рецептору.

Предпочтительно, агент представляет моноклональное антитело к рецептору.

Предпочтительно, агент представляет антитело, предпочтительно, моноклональное антитело к гомологичным регионам -цепи HLA-DR.

Предпочтительно, агент представляет антитело, предпочтительно, моноклональное антитело к гомологичным регионам -цепи HLA-DR.

Предпочтительно, агент используется в комбинации с модификатором биологической реакции.

Предпочтительно, модификатор биологической реакции представляет алкилирующий агент.

Предпочтительно, алкилирующий агент представляет или включает циклофосфамид.

В одном предпочтительном варианте реализации, более коммитированная клетка представляет дифференцированную клетку.

Предпочтительно, более коммитированная клетка представляет любую из В-клетки или Т-клетки.

В альтернативном варианте реализации, более коммитированная клетка представляет более зрелую недифференцированную клетку.

В одном предпочтительном варианте реализации, когда недифференцированная клетка коммитирует в рекоммитированную клетку, рекоммитированная клетка относится к той же линии, как и более коммитированная клетка перед ретродифференциацией.

В другом предпочтительном варианте реализации, когда недифференцированная клетка коммитирует в рекоммитированную клетку, рекоммитированная клетка относится к другой же линии, чем более коммитированная клетка перед ретродифференциацией.

Предпочтительно, рекоммитированная клетка представляет любую из В-клетки, Т-клетки или гранулоцита.

Предпочтительно, способ представляет способ in vitro.

Предпочтительно, агент модулирует экспрессию гена МНС, предпочтительно, в котором агент модулирует экспрессию МНС ⁺ Класса и/или МНС II⁺ Класса.

Агент функционально вовлекает более коммитированную клетку для ретродифференциации этой клетки в недифференцированную клетку. В этом отношении, агент для ретродифференциации более коммитированной клетки в недифференцированную клетку, может действовать в прямом контакте или непрямом контакте с более коммитированной клеткой.

Примером прямого контакта является то, когда более коммитированная клетка имеет по крайней мере один рецептор клеточной поверхности на ее клеточной поверхности, такой как -цепь, имеющую гомологичные регионы (регионы, которые обычно имеют такую же или подобную последовательность), такие как те, которые могут быть обнаружены на В-клетках, и в которых агент вступает в прямой контакт с рецептором клеточной поверхности. Другим примером является то, когда более коммитированная клетка имеет рецептор клеточной поверхности на ее клеточной поверхности такой как -цепь, имеющую гомологичные регионы, такие как те, которые могут быть обнаружены на Т-клетках, и в которых агент вступает в прямой контакт с рецептором клеточной поверхности.

Примером непрямого контакта является то, когда более коммитированная клетка имеет по крайней мере два рецептора клеточной поверхности на ее клеточной поверхности, и контакт агента с одним из рецепторов воздействует на другой рецептор, который вызывает ретродифференциацию более коммитированной клетки.

Агент для ретродифференциации более коммитированной клетки в недифференцированную клетку может быть химическим соединением или композицией. Предпочтительно, однако, агент способен вступать в контакт с рецептором клеточной поверхности на поверхности более коммитированной клетки. Например, предпочтительные агенты включают любой один или более из циклического аденозин монофосфата (сАМР), молекулы CD4, молекулы CD8, части или всего рецептора Т-клетки, лиганда (фиксированного или свободного), пептида, рецептора Т-клетки (TCR), антитела, перекрестно реактивного антитела, моноклонального антитела или поликлонального антитела.

Если агент представляет антитело, перекрестно реактивное антитело, моноклональное антитело или поликлональное антитело, то предпочтительно агент представляет любое из одного или более антитела, перекрестно реактивного антитела, моноклонального антитела или поликлонального антитела к любому одному или более из: -цепи антигена II класса МНС, -цепи антигена HLA-DR MHC, -цепи антигена I класса или II класса МНС, -цепи антигена HLA-DR МНС, – и -цепи антигена II класса МНС, или антигена I класса МНС. Примером подходящего антитела является CR3/43 (поставляемого Dako).

Более коммитированная клетка представляет любую клетку, происходящую или которая может происходить из недифференцированной клетки.

Таким образом, в одном предпочтительном варианте реализации, более коммитированная клетка представляет также недифференцированную клетку. Поэтому в качестве примера недифференцированная клетка может быть лимфоидной стволовой клеткой или миелоидной стволовой клеткой, а недифференцированная клетка представляет плюрипотентную стволовую клетку.

В другом варианте реализации, более коммитированная клетка представляет дифференцированную клетку, такую как клетка CFC – Т, клетка CFC – В, клетка CFC – Eisin, клетка CFC – Bas, клетка CFC – GM, клетка CFC – Е, Т-клетка, В-клетка, эозинофил, базофил, нейтрофил, моноцит, мегакариоцит или эритроцит; а недифференцированная клетка представляет миелоидную стволовую клетку, лимфоидную стволовую клетку или плюрипотентную стволовую клетку.

Если более коммитированная клетка представляет дифференцированную клетку, то предпочтительно дифференцированная клетка представляет В-лимфоцит (активированный или не активированный), Т-лимфоцит (активированный или не активированный), клетку из линии макрофагов моноцитов, содержащую ядро клетку, способную экспрессировать антигены класса I или антигены класса II, клетку, которая может быть индуцирована экспрессировать антигены класса I или класса II, или энуклеированную клетку (т. е. клетку, которая не содержит ядро – такую как эритроцит).

В альтернативных предпочтительных вариантах реализации, дифференцированная клетка выбрана из любой группы клеток, включающей крупные гранулярные лимфоциты, нуль-лимфоциты и естественные клетки-киллеры, каждая экспрессирующая рецепторы клеточной поверхности CD56 и/или CD16.

Дифференцированная клетка может даже быть образована с помощью нуклеации энуклеированной клетки.

Агент может действовать внутриклеточно внутри более коммитированной клетки. Однако предпочтительно, агент действует внеклеточно по отношению к более коммитированной клетке.

В предпочтительном варианте реализации, агент функционально задействует рецептор, присутствующий на поверхности более коммитированной клетки, причем рецептор может быть экспрессирован более коммитированной клеткой, такой как рецептор, который способен быть экспрессирован более коммитированной клеткой.

Предпочтительно, рецептор представляет антиген Класса I или Класса II главного комплекса гистосовместимости (МНС). В предпочтительных вариантах реализации, рецептор клеточной поверхности представляет собой любой из: рецептора HLA-DR, рецептора DM, рецептора DP, рецептора DQ, рецептора HLA-А, рецептора HLA-В, рецептора HLA-С, рецептора HLA-Е, рецептора HLA-F или рецептора HLA-G.

В наиболее предпочтительных вариантах реализации, рецептор клеточной поверхности представляет рецептор HLA-DR.

Предпочтительно, этап контактирования включает вступление агента во взаимодействие с любым одним или более из следующих: гомологичных регионов -цепи антигенов I класса, гомологичных регионов -цепи антигенов II класса, рецептора CD4 клеточной поверхности, рецептора CD8 клеточной поверхности, гомологичных регионов -цепи антигенов II класса в присутствии лимфоцитов, гомологичных регионов -цепи антигенов I класса в присутствии лимфоцитов, или гомологичных регионов -цепи антигенов II класса в присутствии лимфоцитов.

Предпочтительно, этап контактирования происходит в присутствии модификатора биологической реакции.

Предпочтительно, модификатор биологической реакции представляет один или более модуляторов, таких как иммуномодулятор, фактор роста, цитокин, рецептор клеточной поверхности, гормон, нуклеиновая кислота, нуклеотидная последовательность, антиген или пептид.

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, недифференцированная клетка затем коммитируется в рекоммитированную клетку, такую как дифференцированная клетка.

Рекоммитированная клетка может относиться к той же линии, что и коммитированная клетка, из которой была получена недифференцированная клетка.

Альтернативно, рекоммитированная клетка может относиться к другой линии, чем коммитированная клетка, из которой получена недифференцированная клетка.

Кроме того, настоящее изобретение также включает способ настоящего изобретения получения недифференцированной клетки, в котором способ включает коммитирование недифференцированной клетки в рекоммитированную клетку и затем слияние рекоммитированной клетки с миеломой. Это обеспечивает экспрессию in vitro больших количеств желаемого продукта, такого как антитело или антиген или гормон и т. д.

Другой аспект настоящего изобретения включает:
Использование любого из агентов настоящего изобретения для получения недифференцированной клетки из более коммитированной клетки.

Использование продукта недифференцированной клетки в соответствии со способом настоящего изобретения получения любого моноклонального или поликлонального или специфического антитела из В-лимфоцита или Т-лимфоцита; клетки из линии макрофагов моноцитов, содержащей ядро, способной экспрессировать антигены класса I или класса II; клетки, способной индуцироваться для экспрессии антигенов класса I или класса II; энуклеированной клетки; или апоптической клетки.

Использование недифференцированной клетки, полученной в соответствии со способом настоящего изобретения получения эффекторных Т-лимфоцитов из В-лимфоцитов и/или наоборот.

Использование недифференцированной клетки, полученной в соответствии со способом настоящего изобретения получения любого одного или более: лекарственного препарата, такого как лекарственный препарат, включающий или полученный из В-лимфоцита, Т-лимфоцита, клетки из линии макрофагов моноцитов; содержащей ядро, способной экспрессировать антигены класса I или класса II; способной индуцироваться для экспрессии антигенов класса I или класса II; или энуклеированной клетки.

Настоящее изобретение также включает процессы с использованием указанных выше способов использования и продуктов или композиций, полученных в результате таких процессов.

Настоящее изобретение также включает лекарственный препарат, включающий недифференцированную клетку в соответствии с настоящим изобретением или продукт, полученный из нее, смешанный с подходящим растворителем, носителем или наполнителем.

В одном предпочтительном варианте реализации, лекарственный препарат включает антитело или антиген, полученный из недифференцированной клетки в соответствии с настоящим изобретением, смешанный с подходящим растворителем, носителем или наполнителем.

Предпочтительно, лекарственный препарат предназначен для лечения любого из следующих состояний: рак, аутоиммунные заболевания, заболевания крови, клеточная или тканевая регенерация, регенерация органов, лечение трансплантатов органов или тканей или врожденных нарушений метаболизма.

В предпочтительном варианте реализации, настоящее изобретение относится к способу введения гена в геном недифференцированной клетки, причем способ включает введение гена в более коммитированную клетку, и затем получение недифференцированной клетки с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, посредством чего ген присутствует в недифференцированной клетке.

В более предпочтительном варианте реализации, настоящее изобретение относится к способу введения гена в геном недифференцированной клетки, в котором способ включает вставку гена в геном более коммитированной клетки, и затем получение недифференцированной клетки с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, посредством чего ген присутствует в недифференцированной клетке.

В еще более предпочтительном варианте реализации, настоящее изобретение относится к способу введения генома гена в недифференцированную клетку, в котором способ включает вставку гена в геном более коммитированной клетки и затем получение недифференцированной клетки с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, посредством чего ген присутствует в геноме недифференцированной клетки.

Настоящее изобретение охватывает недифференцированную клетку, полученную с помощью любого из этих способов настоящего изобретения.

Как уже упоминалось, настоящее изобретение также охватывает лекарственный препарат, включающий недифференцированную клетку, полученную с помощью любого из этих способов, смешанную с подходящим растворителем, носителем или наполнителем. С таким лекарственным препаратом недифференцированная клетка может использоваться для получения преимущественно более коммитированной клетки, такой как клетка, имеющая правильную геномную структуру, для облегчения любых симптомов или состояний, вызванных или связанных с более коммитированной клеткой, имеющей неправильную геномную структуру.

Таким образом, настоящее изобретение также представляет способ устранения приобретенной мутации из более коммитированной клетки, в котором способ включает образование недифференцированной клетки с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, превращающего недифференцированную клетку в рекоммитированную клетку, посредством которого расположение или перестройка генома и/или ядра клетки вызывает устранение мутации.

Предпочтительно, ген вставляется в иммуноглобулиновый регион или регион TCR-генома.

Альтернативно, недифференцированная клетка может использоваться для получения более коммитированной клетки, которая продуцирует агент, который излечивает симптомы или состояния, вызванные или связанные с более коммитированной клеткой, имеющей неправильную геномную структуру.

Например, настоящее изобретение может быть использовано для получения антител или рецепторов Т-клеток для антигена, который экспрессируется более коммитированной клеткой, которая ретродифференцировалась в недифференцированную клетку. В этом отношении, антиген может быть фетоспецифическим антигеном или перекрестно реактивным фетоспецифическим антигеном.

Настоящее изобретение также включает способ контролирования уровней недифференцированных клеток и более коммитированных клеток. Например, настоящее изобретение включает способ, включающий образование недифференцированной клетки с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, и затем активацию гена апоптоза для воздействия на недифференцированную клетку, так, чтобы вызвать ее смерть.

В одном предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, более коммитированная клетка не представляет раковую клетку. В другом предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, агент не является ни канцерогенным, ни способен стимулировать рост рака.

Настоящее изобретение также охватывает способ лечения пациента, страдающего заболеванием или расстройством в результате дефективной клетки или нежелательной клетки, причем способ включает получение недифференцированной клетки с помощью контактирования более коммитированной клетки с агентом, который вызывает ретродифференциацию более коммитированной клетки в недифференцированную клетку, а затем необязательно превращение недифференцированной клетки в рекоммитированную клетку; в котором недифференцированная клетка, или рекоммитированная клетка, воздействует на дефективную клетку или нежелательную клетку для облегчения симптомов заболевания или расстройства или для излечения пациента с заболеванием или состоянием.

Подводя итог, настоящее изобретение относится к получению недифферецированной клетки из более коммитированной клетки.

Теперь настоящее изобретение будет описано в виде примера, в котором будет делаться ссылка на следующие фигуры:
фиг. 1, которая представляет вид клеток перед использованием способа настоящего изобретения;
фиг. 2, которая представляет вид клеток, полученных с помощью способа настоящего изобретения;
фиг. 3, которая представляет вид под микроскопом клеток, полученных с помощью способа настоящего изобретения, но при более низком увеличении;
фиг. 4, которая представляет вид под микроскопом клеток перед использованием способа настоящего изобретения;
фиг. 5, которая представляет вид под микроскопом клеток, полученных с помощью способа настоящего изобретения; и
фиг. 6, которая представляет вид под микроскопом клеток, полученных с помощью способа настоящего изобретения.

А. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
ПАЦИЕНТЫ
Пробы крови были получены в трубках с лавандовыми верхушками, содержащими ЭДТА у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом, пациентов с дефицитом антител (включая дефицит IgА и сцепленные с Х-хромосомой гипогаммаглобулинемии у детей), пациентов с ВИЧ-инфекциями и синдромом СПИД, пациента с инфекцией цитомегаловирусом (ЦМВ), пациента с Ходжкиновскими лимфомами, пациента с острым Т-клеточным лейкозом, 6-дневного младенца с Ходжкиновскими лимфомами, пациента с острым Т-клеточным лейкозом, 6-дневного младенца с бластоцитозом, различных пациентов с различными инфекциями и клиническими состояниями, пуповинная кровь, костный мозг и обогащенные препараты В-лимфоцитов здоровых доноров крови.

КЛИНИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СОСТОЯНИЯ
Клинические и экспериментальные условия лечения пациентов, включая различные типы обработки образцов их крови, описаны в таблице 1. Лейкоцитарную формулу (WBC) получали с использованием счетчика Кольтера, и она включена в ту же таблицу.

ОБРАБОТКА КРОВИ
После взятия образцы крови обрабатывали чистым моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена HLA-DR (DAKO) и оставляли для смешивания на многоголовочном роллере при комнатной температуре в течение максимум 24 часов. Некоторые пробы сначала смешивали на многоголовочном роллере в течение 15 минут, после чего их оставляли для инкубации в инкубаторе при 22^oС. Концентрация моноклонального антитела, добавляемого в образцы крови, колебалась от 10 до 50 мкл/мл крови.

Кроме того, применяли другие способы обработки при тех же концентрациях, и они включали добавление моноклонального антитела к гомологичному региону -цепи антигена HLA-DR, моноклонального антитела к гомологичному региону антигенов класса I, моноклонального антитела к CD8 и иммобилизованного на ПЭ моноклонального антитела к гомологичному региону -цепи антигена HLA-DR.

Другие способы обработки включали одновременное добавление в образцы крови моноклональных антител к гомологичным регионам – и -цепей антигена HLA-DR.

Кроме того, в образцы крови добавляли алкилирующие агенты, такие как циклофосфамид в комбинации с чистым моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена HLA-DR.

После этих способов обработки образцы крови окрашивали набором меченых моноклональных антител в соответствии с инструкциями производителя, и затем проводили анализ с использованием проточной цитометрии.

Периоды инкубации с моноклональными антителами колебались в интервалах от 2 часов, 4 часов, 6 часов, 12 часов до 24 часов.

МЕЧЕНЫЕ АНТИТЕЛА
Следующие моноклональные антитела были использованы для выявления следующих маркеров на клетках с помощью проточной цитометрии: CD19 и CD3, CD4 и CD8, DR и CD3, CD56 & 16 и CD3, CD45 и CD14, CD8 и CD3, CD8 и CD28, контроль с помощью одновременной пробы (lgG1 FITC + lgG2a РЕ), CD34 и CD2, CD7 и CD13 & 33, CD10 и CD25, CD5 и CD10, CD5 и CD21, CD7 и CD5, CD13 и CD20, CD23 и CD57 и CD25 и CD45 RA (Becton & Dickenson и DAKO).

Анализ образцов крови каждого пациента, как обработанных, так и не обработанных, проводили с использованием большинства компонентов из указанного выше набора для определения характера иммунофенотипических изменений, которые сопровождали различные типы обработки, и они проводились раздельно на различных аликвотных количествах одного и того же образца крови. Окрашивание и анализ необработанных образцов и образцов после других контрольных способов обработки проводили одновременно.

ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ
Окрашивание и лизирование цельных образцов крови проводили в соответствии с инструкциями производителя. Проточный цитометрический анализ проводили на FACScan@ с помощью или одновременного теста или компьютерной программы PAINT A GATE (BDIS), которая включала отрицательные контроли при обратном прослеживании. В файлах списочного типа накапливали и хранили от 10000 до 20000 сеансов обработки.

МОРФОЛОГИЯ
Морфологию анализировали с использованием микроскопии и окрашивания по Wright.

В. РЕЗУЛЬТАТЫ
НАБОР CD19 и CD3
Обработка образцов крови моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи HLA-DR всегда уменьшала относительное количество клеток CD19⁺. Этот маркер представляет общий В-клеточный антиген (см. таблицу). Этот антиген присутствует на всех В-лимфоцитах человека на всех стадиях созревания, но он утрачивается на окончательно дифференцированных плазматических клетках. Следовательно, это является показателем, что В-клетки ретродифференцировались в недифференцированные клетки.

Такая же обработка вызвала резкое увеличение относительного количества клеток CD3⁺, особенно в крови пациентов с В-клеточным лимфолейкозом (В-CLL), которое всегда сопровождалось увеличением относительного количества клеток CD3^– CD19^–. CD3 присутствует на всех зрелых Т-лимфоцитах и на 65% – 85% тимоцитов. Этот маркер всегда обнаруживается в связи с -/– или гамма/дельта рецепторами Т-клеток (TCR), и вместе эти комплексы важны в передаче сигналов внутрь клетки. Следовательно, это является показателем, что В-клетки ретродифференцировались в недифференцированные клетки и затем превращаются в новые дифференцированные клетки, а именно Т-клетки.

В обработанной крови пациентов с В-CLL появился новый клон клеток, совместно экспрессирующий маркеры CD19 и CD3, т. е. CD19⁺ и CD3⁺ (см. карту 1, пациент 2, 3 и 4 через 2 ч, 6 ч и 24 ч после начала обработки). У других пациентов с различными состояниями выявлено увеличение относительного количества этих клонов клеток. Эти клетки были исключительно крупными и обильно гранулированными, и на их клеточной мембране были экспрессированы крайне высокие уровни CD19. Представляется, что маркер CD3 экспрессирован на этих клетках на уровнях, аналогичных уровням, экспрессированным на нормальных зрелых лимфоцитах.

В таблице 2 пациенты номер 2, 3 и 4 в действительности являются номерами, представляющими одного и того же пациента, и их обозначение было просто предназначено для иллюстрации влияния обработки на кровь с течением времени (экспериментальное и клиническое состояние этого пациента показано в таблице 1).

Представляется, что клоны CD19⁺ и CD3⁺ в обработанных образцах уменьшаются с течением времени, достигая первоначальных уровней, которые были определены в необработанном образце на интервалах 2 ч, 6 ч и 24 ч.

Другой тип клетки того же размера и зернистости был обнаружен в обработанных образцах, и эти клетки имели высокие уровни CD19, экспрессированных на их поверхности, но были отрицательны по маркеру CD3 и богаты рецепторами FC. Однако оказалось, что относительное количество этих клеток уменьшалось со временем. Интересно, что через 24 ч после обработки образца крови (2, 3 и 4) было уменьшение относительного количества клеток CD19^– CD3^– (в группе клеток, увеличение количества которых первоначально наблюдалось через 2 и 6 ч после обработки образцов крови. Однако наблюдалось уменьшение количества популяций лейкоцитов при подсчете Кольтеровской формулы при обработке крови моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена HLA-DR. Эти данные свидетельствуют о том, что этот тип обработки вызывает развитие атипичных клеток, которые нельзя выявить с помощью счетчика Колтера (таблица 1), но может обнаруживаться при измерении с помощью проточной цитометрии, которая подсчитывает клетки на основании поверхностных маркеров, размера и зернистости. Кроме того, эти атипичные клетки выявлялись с помощью анализа морфологии с использованием красителя Wright под микроскопом. Графики проточной цитометрии этих феноменов представлены на графиках (1, 2, 3 и 4) и представляется, что иммунофенотипические изменения, полученные после обработки образцов крови, свидетельствуют о том, что лимфоциты CD19⁺ и CD3⁺ представляют связанную друг с другом группу клеток, но остаются отличными на основании относительной экспрессии CD19 и CD3 в сравнении со стволовыми клетками.

В таблице 2 пациент под номерами 5 и 6 представляет одного и того же пациента, но анализ обработанного и необработанного образцов крови контролировались в динамике и в одно и то же время (см. таблицу 1).

Кровь пациентов со злокачественными В-клеточными заболеваниями проявила аналогичные тенденции иммунофенотипических изменений при сравнении с кровью пациентов с В-CLL, но изменения не были выражены в той же степени. Однако относительное и абсолютное количество В-лимфоцитов и положительных по классу II МНС клеток в крови этих пациентов крайне низкое, по сравнению с тем, которое обнаружено в крови пациентов с В-CLL.

У двух братьев со сцепленной с Х-хромосомой детской гипогаммаглобулинемией, у которых был дефицит В-клеток, были выявлены различные иммунофенотипические изменения в относительном количестве клеток CD3⁺ после обработки их крови. У младшего брата, которому было 2 месяца и который не был болен, после обработки
его крови, было выявлено незначительное увеличение относительного количества клеток CD3⁺, которое сопровождалось уменьшением относительного количества клеток CD3^– и CD19^–. С другой стороны, у другого брата, которому было 2 года и который был крайне болен и у которого было относительно высокое количество активированных Т-клеток, экспрессирующих антигены DR, было выявлено уменьшение количества клеток CD3⁺ после обработки его крови. Никакие другие маркеры не использовались для измерения других иммунофенотипических изменений, которые могли произойти, потому что образцы крови, полученные у этих двух пациентов, были крайне малы (таблица 2, ID 43/BD и 04/BD).

У пациента 91 в таблице 2 выявляется уменьшение относительного количества клеток CD3⁺ после обработки крови, которое сопровождалось увеличением относительного количества клеток CD3^– и CD19^–. Однако при анализе других поверхностных маркеров, таких как CD4 и CD8 (см. таблицу 3), было отмечено, что у пациента имеется высокое относительное число клеток CD4⁺ CD8⁺ в его крови, и это было отмечено перед обработкой образцов крови моноклональным антигеном к -цепи антигена DR, и количество этих дважды положительных клеток заметно снижалось после обработки крови. Кроме того, когда был проведен анализ других маркеров, было отмечено, что относительное число клеток CD3⁺ возросло (см. таблицу 4).

В обогащенном препарате В-лимфоцитов, полученном от здоровых доноров крови, после обработки образцов крови моноклональным антигеном к -цепи антигенов DR, выявлено резкое увеличение относительного числа клеток CD3⁺, которое всегда сопровождалось уменьшением относительного количества клеток CD19⁺ и увеличением относительного количества клеток CD3⁺ и CD19⁺. Дальнейший анализ с использованием маркеров, таких как CD4 и CD8, выявил сопутствующее увеличение относительного количества этих маркеров. Однако в обогащенном препарате Т-лимфоцитов тех же доноров крови после обработки тем же моноклональным антителом не было таких же изменений.

НАБОР CD4 и CD8
Антиген CD4 представляет рецептор вируса иммунодефицита человека. Молекула CD4 связывает антиген класса II МНС в домене В2, регионе, который аналогичен участкам связывания CD8 на антигенах класса I. Связывание CD4 с антигеном класса II усиливает реактивность Т-клеток к антигенам, как и связывание CD8 с антигенами класса I. Антигены CD8 присутствуют на субпопуляции суппрессорных/цитотоксических Т-лимфоцитов человека, а также на субпопуляции лимфоцитов естественных киллерах (NK) и на большинстве нормальных лимфоцитов. Антигены CD4 и CD8 совместно экспрессированы на тимоцитах, и эти клетки теряют все маркеры по мере созревания в Т-лимфоциты.

После анализа маркеров CD4 и CD8 (см. ниже) и по большинству образцов крови, представленных в таблице 2, возникает тип окрашивания, который подтверждает присутствие процесса ретродифференциации В-лимфоцитов в недифференцированные клетки и последующей дифференциации в Т-лимфоциты.

Клетки CD4^– CD4^–, которые представляют дважды положительные клетки, всегда появлялись после обработки образцов крови моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи, и количество этих типов клеток заметно возрастало в крови обработанных образцов пациентов с В-CLL, но они всегда отсутствовали в необработанных образцах (см. таблицу 3 и карты 1, 2, 3 и 4). В тех же образцах также отмечалось одновременное увеличение относительного количества одиночных положительных клеток, таких как клетки CD8⁺ и CD4⁺. Кроме того, отмечалось резкое снижение относительного количества клеток CD4^– CD8^–, которое, по крайней мере в случае В-CLL, соответствует В-клеткам, в обработанных образцах, при сравнении с необработанными образцами, которые оставались на том же уровне при измерении в динамике. Однако определение относительного количества клеток CD4⁺ CD8⁺ в динамике в обработанных образцах показало, что было сопутствующее возрастание количества одиночных положительных клеток со снижением относительного количества дважды положительных клеток. Этот тип фенотипического изменения характерен для тимического развития клеток – предшественников линии Т-лимфоцитов в тимусе (пациент номер 2, 3 и 4). Антиген CD4 присутствует на субпопуляциях Т-лимфоцитов хелперов/индукторов (CD4⁺ CD3⁺) и большинстве нормальных тимоцитов. Однако этот антиген присутствует при низкой плотности на клеточной поверхности моноцитов и в цитоплазме моноцитов и макрофагов (CD3^– CD4⁺).

После обработки в различных образцах крови отмечено различное влияние на клетки с относительно низким количеством CD4⁺ . Представляется, что обработка не влияет на относительное количество этого типа клеток в образцах крови пациентов с В-CLL, по сравнению с необработанными образцами. Такие низкие уровни экспрессии CD4 обнаружены на моноцитах и на тимоцитах на очень ранних стадиях развития.

У пациента HIV⁺ 25 после обработки выявлено существенное увеличение количества дважды положительных клеток, экспрессирующих одновременно CD4 и CD8. С другой стороны, у пациента 91 после обработки выявлено уменьшение количества этого подтипа клеток, и наблюдение такого феномена зависит от времени. Наблюдалось увеличение относительного количества клеток CD8⁺ в необработанных образцах крови пациентов с В-CLL при измерении в динамике, тогда как в те же самые периоды наблюдалось уменьшение относительного количества клеток с низким содержанием CD4⁺ и CD4⁺ (таблица 3, пациент 2, 3 и 4).

НАБОР DR И CD3
Маркеры DR присутствуют на моноцитах, дендритных клетках, В-клетках и активированных Т-лимфоцитах.

В обработанных и необработанных пробах, проанализированных с использованием этого набора, выявлены иммунофенотипические изменения, подобные изменениям, полученным, когда пробы крови анализировали с использованием маркеров CD19 и CD3 (см. таблицу 2), и эти антигены, как указано ранее, представляют соответственно пан-В- и Т-клеточные маркеры.

Представляется, что обработка крови моноклональными антителами влияет на относительное количество В-лимфоцитов DR⁺ так, что уровень клеток DR⁺ уменьшается. Напротив, относительное количество клеток CD3⁺ (Т-клеток) значительно увеличивается (см. таблицу 4 и карту). Кроме того, относительное количество активированных Т-клеток увеличивалось в большинстве обработанных проб крови пациентов с В-CLL, и на эти типы клеток оказывались различные воздействия в обработанных образцах пациентов с другими состояниями. Кроме того, относительное количество DR высоко положительных клеток DR появлялось в значительных количествах обработанных образцов пациентов с В-CLL и у 6-дневного младенца с увеличенным содержанием бластов DR⁺ CD34⁺ в крови. Однако следует отметить, что бласты, которые присутствовали в крови этого пациента, были отрицательны по Т- и В-клеточным маркерам до и после обработки, но становились более положительными по антигенам миелоидной линии после обработки. Относительное количество клеток DR^– CD34^– увеличивалось в большинстве обработанных образцов крови и было пропорционально увеличению относительного количества клеток CD3⁺ (Т-клеток) и было обратно пропорционально уменьшению относительного количества клеток DR⁺ (В-клеток).

НАБОР CD56 & 16 И CD3
Маркеры CD56 & CD16 обнаруживаются на гетерогенной группе клеток, субпопуляции лимфоцитов, известной в целом как крупные гранулярные лимфоциты и лимфоциты – естественные киллеры (NK). Антиген CD16 экспрессирован практически на всех покоящихся лимфоцитах NK, и слабо экспрессирован на некоторых Т-лимфоцитах CD3⁺ от определенных лиц. Этот антиген обнаруживается на гранулоцитах в меньшем количестве и связан с лимфоцитами, содержащими крупные азурофильные гранулы. Антиген CD16 представляет рецептор III lgG FC.

Различное количество лимфоцитов CD16⁺ экспрессирует или антиген CD57 или антиген CD8 низкой плотности, или оба. У большинства лиц фактически нет перекрытия с другими антигенами Т-лимфоцитами, такими как антигены CD5, CD4 или CD3. Антиген CD56 присутствует по существу на всех покоящихся и активированных лимфоцитах CD16⁺ NK, и эти субпопуляции клеток осуществляют цитотоксичность, не ограниченную главным комплексом гистосовместимости.

Иммунотипирование обработанных и необработанных образцов крови пациентов с В-CLL и некоторых других пациентов с другими состояниями показало увеличение относительного количества клеток, совместно экспрессирующих антигены CD56 & CD16, которые были сильно гранулированы и имели средний размер (см. таблицу 5 и карты 1, 2, 3 и 4). Эти наблюдения также сопровождались выраженным увеличением относительного количества клеток, экспрессирующих только антиген CD3 (без экспрессии маркеров CD56 и CD16) и клеток, совместно экспрессирующих маркеры CD56 & CD16 и CD56 & CD3.

В таблице 5 номера пациента 2, 3 и 4 представляют ту же пробу крови, но проанализированную соответственно через 2 часа, 6 часов и 24 часа (до и после обработки). Эта проба показывает, что обработка крови моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена DR, как представляется, вызывает спонтанную выработку клеток CD56⁺ и CD16⁺, клеток CD3⁺ и CD56⁺ и клеток CD16⁺ CD3⁼, и эти наблюдения всегда сопровождались исчезновением маркеров В-клеток (CD19, DR, CD56, CD16^– CD3^–).

Продолжающийся в динамике анализ этой пробы крови до и после обработки показал, что со временем уровни клеток CD56⁺ и CD16⁺ снижались, а уровень клеток CD3⁺ со временем возрастал.

В образцах крови пациента 7 с В-CLL не были выявлены какие-либо изменения количества клеток, экспрессирующих антигены CD56, CD16 и CD3 при сравнении с иммунофенотипическими изменениями, наблюдавшимися в обработанных и необработанных пробах, и это происходит потому, что количество добавленного моноклонального антитела было крайне низким относительно количества В-лимфоцитов. Однако обработка пробы крови этого пациента в отдельном случае соответствующим количеством моноклонального антитела показала значительное увеличение относительного количества клеток CD3⁺, CD56⁺ и CD16⁺ и CD56⁺ и CD16⁺ CD3⁺.

Образцы крови других пациентов с другими состояниями показали различные изменения уровня этих клеток, и, как представляется, это зависит от количества В-лимфоцитов, присутствующих в крови перед обработкой, длительности обработки и, вероятно, клинического состояния пациентов.

НАБОР CD45 и CD14
Антиген CD45 присутствует на всех лейкоцитах человека, включая лимфоциты, моноциты, полиморфоядерные клетки и эозинофилы в периферической крови, тимусе, селезенке и небные миндалины и предшественники лейкоцитов в костном мозге.

CD14 присутствует на от 70 до 90% нормальных моноцитах периферической крови, на от 77 до 90% фагоцитов плевральной или брюшинной жидкости. Этот антиген слабо экспрессирован на гранулоцитах и не существует на не стимулированных лимфоцитах, активированных митогеном Т-лимфоцитах, эритроцитах или тромбоцитах.

Антиген CD45 представляет семейство белковых тирозин фосфатаз, и эта молекула взаимодействует с внешними стимулами (антигенами) и влияет на передачу сигнала через членов семейства Scr, ведущую к регуляции роста и дифференциации клеток.

Участие -цепи антигенов DR в обработанных пробах крови, особенно, образцах, полученных у пациентов с В-CLL, свидетельствует о том, что такая обработка воздействует на уровень антигенов CD45 на В-лимфоцитах. Представляется, что иммунофенотипические изменения в целом, которые имеют место при стимуляции -цепи антигена DR обусловливают появление различных типов клеток, которые могут быть отделены на основании уровня экспрессии CD45 и CD14, а также морфологии по данным определения прямого рассеяния и бокового рассеяния (соответственно размер и зернистость), и эти результаты представлены в таблице 6 и картах (1, 2, 3, 4 и 5).

При обработке относительное количество клеток с низким уровнем CD45 (при сравнении с необработанными пробами) значительно увеличивалось, так же как относительное количество клеток, совместно экспрессирующих антигены CD45 и CD14. Этот тип иммунофенотипических изменений совпадал с уменьшением относительного количества клеток с высоким уровнем CD45 (по сравнению с необработанными пробами). Однако эта последняя популяция клеток может далее разделяться на основании морфологии и степени экспрессии CD45. Один тип был крайне большим и имел крайне высокие уровни антигена CD45 при сравнении с остальными клетками, представленными в картах (см. карты 1, 2, 3 и 4). При анализе этого набора после обработки в динамике (см. таблицу, пациент 2, 3 и 4 и карты), относительное количество клеток CD45⁺ первоначально резко падало со временем, вызывая появление клеток с низким уровнем CD45. Однако анализ крови через 24 часа показал противоположную ситуацию.

Пробы 5 и 7 выявляют иммунофенотипические изменения, противоположные тем, которые были получены с другими пробами, взятыми у других пациентов с В-CLL, и это связано с тем, что анализ проб проводился гораздо на более ранних периодах инкубации с моноклональным антителом. Фактически представляется, что последовательный анализ образцов крови после обработки свидетельствует о том, что иммунофенотипические изменения, предпринятые В-лимфоцитами, являются зависимыми от времени, потому что это представляет стадию развития, и иммунофенотипические изменения, определенные во время X, не будут такими же как во время Х плюс (будучи вызванными, они не являются фиксированными). Однако эти типы изменений должны происходить более строго определенным образом в организме, иначе бы возникла иммунопатология. Влияние обработки проб крови от других пациентов со злокачественными заболеваниями, не связанными с В-клетками, показывает различные изменения иммунофенотипов клеток, и это связано с тем, что В-лимфоциты присутствуют в меньшем количестве. Однако обработка обогащенных фракций В-лимфоцитов, полученных у здоровых доноров крови, показывает иммунофенотипические изменения, аналогичные изменениям, полученным при В-CLL с большим количеством В-лимфоцитов.

НАБОР CD8 И CD3
Антигенная детерминанта CD8 взаимодействует с молекулами класса I MHC, что приводит к возросшей адгезии между Т-лимфоцитами CD8⁺ и клетками-мишенями. Этот тип взаимодействия усиливает активацию покоящихся лимфоцитов. Антиген CD8 соединен с белковой протеин киназой (p56ick), и в свою очередь комплекс CD8/p56ick может играть роль в активации Т-лимфоцитов.

Обработка проб крови, полученных у пациентов с В-CLL моноклональным антителом к В-цепи, вызывает значительное увеличение относительного количества клеток, положительных по CD3 CD8 и CD3 (весьма вероятно положительных по CD4 CD3), что более ясно указывает на то, что двойные положительные клетки, генерированные первоначально, подвергаются развитию в зрелые Т-лимфоциты. Это процесс, который может быть прямо измерен с помощью антигенов CD19 и DR и косвенно с помощью антигенов CD8^– CD3^–. Представляется, что динамическая серийная оценка образцов обработанной крови одного и того же пациента согласуется с процессом, который идентичен развитию тимоцитов (таблица 7, пациент 2, 3 и 4 и карта 1).

Относительное количество клеток CD8⁺ со временем возрастает в обработанных и необработанных образцах, но в большей степени – в необработанных образцах. С другой стороны, относительное количество клеток CD8⁺ CD3⁺ уменьшается со временем в необработанных образцах. Однако относительное количество клеток CD3⁺ увеличивается в обработанных образцах крови при измерении в динамике, и эти типы клеток высоко соответствуют одиночным положительным клеткам CD4⁺ CD3⁺, более зрелой форме тимоцитов. Кроме того, поскольку эти образцы были также иммунофенотипированы другими наборами (упомянутыми выше в таблицах 3, 4, 5 и 6), общие изменения активно вовлекают В-клетки в генерацию предшественников и потомков Т-лимфоцитов.

Пробы крови от пациента с В-CLL (номер 2, 3 и 4 таблицы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7) в отдельных аликвотных количествах не обрабатывали ничем, обрабатывали связанным с ПЭ моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена DR и несвязанной формой того же моноклонального антитела. При сравнении, обработка антигеном, связанным с ПЭ, не указывает на изменения относительного количества клеток, положительных по CD3 и связанных маркеров, таких как CD4, которые наблюдались в значительных количествах, когда тот же образец крови был обработан несвязанной формой антитела. Однако при измерении в динамике отмечалось увеличение количества клеток, положительных по CD45 без экспрессии антигена DR на их поверхности (см. таблицу 8). Данные, которые были аналогичны данным, полученным в необработанных пробах при иммунофенотипировании в динамике (таблица 6). Кроме того, относительное количество клеток, экспрессирующих низкий уровень CD45, со временем уменьшалось, феномен, который также отмечался в необработанных пробах (при измерении в динамике ) одного и того же пациента (см. карту 1А).

С. СРАВНЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ДРУГИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С РАЗЛИЧНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ НА Т-ЛИМФОПОЭЗ
НАБОР CD19 И CD3
Обработка образцов крови моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена DR и гомологичному региону антигенов Класса I MHC уменьшала количество клеток CD3⁺ и увеличивала количество клеток CD19⁺. Обработка той же крови моноклональным антигеном к гомологичному региону -цепи антигена DR уменьшала количество клеток CD19⁺ и увеличивала количество клеток CD3⁺. Обработка последним моноклональным антителом с циклофосфамидом выявила такой же эффект (таблица 14, пациент 5/6 с В-CLL через 2 ч после обработки).

Продолжающийся анализ клеток CD19⁺ и CD3⁺ в тех же образцах выявил дальнейшее увеличение относительного количества клеток CD3⁺ только в крови, обработанной моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена DR (таблица 14, пациент 5/6 с В-CLL, через 24 ч после обработки). Однако продолжающийся анализ (через 24 часа, пациент 5/6, таблица 14) проб крови, обработанных циклофосфамидом плюс моноклональное антитело к -цепи антигена DR выявило устранение изменений относительного количества клеток CD19⁺ и CD3⁺ в сравнении с количеством, наблюдавшимся после периода инкубации 2 часа точно в таких же условиях.

В целом, обработка образцов крови одного и того же пациента моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена DR или моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена класса I показывает увеличение относительного количества клеток CD19⁺ (пан В маркер) при сравнении с необработанным образцом. Относительное количество клеток CD19^– CD3^– незначительно уменьшалось в пробах крови, обработанных моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена DR или моноклональным антителом к антигенам класса I (см. таблицу 14 и карты 2, 3 и 4). Обработка образцов крови пациента 09 моноклональным антителом к антигенам класса I увеличивала относительное количество клеток CD3⁺ и слегка уменьшала относительное количество клеток CD19⁺ и CD19^– CD3^–. Однако обработка обогащенного препарата В-лимфоцитов, полученных у здоровых доноров крови, моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи или -цепи антигена DR показала иммунофенотипические изменения, аналогичные изменениям, полученным у пациента с В-CLL.

Лечение пациента с HIV⁺ и дефицитом IgA моноклональным антителом к -цепи антигена DR увеличивала относительное количество клеток CD3⁺ и слегка уменьшала относительное количество клеток CD19⁺. Однако обработка того же образца крови моноклональным антителом к гомологичному региону антигена класса I не давала такого же эффекта. Обработка образцов крови, полученных у пациентов (34/BD и 04/BD) с дефицитом В-клеток показала различные иммунофенотипические изменения при обработке моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена DR, антигенам класса I и антигену CD4.

НАБОР CD4 И CD8
Образцы крови, анализ которых проводили с использованием набора CD19 и CD3 (таблица 14), также иммунотипировали набором CD4 и CD8 (таблица 15). Представляется, что оба набора согласуются и подтверждают друг друга. Инкубация в течение 2 часов образцов крови пациентов с В-CLL (таблица 15, пациенты 5/6 и 10, карты 2, 3 и 4) моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена DR или этим моноклональным антителом плюс циклофосфамид увеличивала относительное количество клеток CD8⁺ и CD4⁺ и клеток, экспрессирующих оба маркера. С другой стороны, обработка тех же образцов моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена DR или к гомологичному региону -цепи антигена класса I не давала таких же эффектов.

Сравнение иммунофенотипических тенденций, полученных после периодов инкубации 2 часа и 24 часа с моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена DR плюс циклофосфамид, выявила обратные изменения относительного количества клеток, положительных по CD4 и CD8 (таблица 15, пациент 5/6 с В-CLL через 2 часа и 24 часа), и такие изменения были в соответствии с изменениями, полученными, когда проводился анализ такого же образца крови с набором CD19 и CD3 (таблица 14, тот же пациент). Более поздние данные показывают, что последующая дифференциация обратима, поскольку недифференцированные клетки могут дифференцироваться в Т-лимфоциты или В-лимфоциты.

НАБОР DR И CD3
Иммунофенотипические изменения, полученные с набором DR и CD3 (таблица 16) подтверждают данные, полученные с набором CD19 и CD3 (таблицы 14 и 15 и карты 2, 3 и 4), которые следовали за обработкой тех же образцов крови моноклональными антителами к гомологичному региону бета- или альфа-стороны антигена DR или моноклональным антителом к антигенам класса или моноклональным антителом к -цепи антигена DR плюс циклофосфамид при анализе через 2 часа.

На основании этих результатов, представляется, что моноклональное антитело к гомологичному региону -цепи антигена DR обладает высокой способностью запускать выработку клеток, положительных по CD3, из клеток DR⁺.

Кроме того, обработки, такие как обработки, включающие вовлечение -цепи антигенов DR или вовлечение -стороны молекулы в комбинации с циклофосфамидом (длительное время инкубации) способствовало увеличению относительного количества клеток CD19⁺ или клеток DR⁺.

НАБОР CD56 & 16 И CD3
Обработка проб крови, особенно проб больных с В-CLL с высоким уровнем В-лимфоцитов, моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена DR увеличивала относительное количество клеток, положительных по CD56 & 16.

У этих пациентов относительное количество клеток CD3⁺ и CD56⁺ и CD16⁺ CD3^– также возрастало после обработки образцов крови моноклональным антителом к -цепи, подтверждая ранее имевшиеся наблюдения, отмеченные при такой же обработке, когда такие же образцы крови анализировали наборами CD3 и CD19 и DR и CD3.

НАБОР CD45 И CD14
Образцы крови, обработанные моноклональными антителами к – или -цепям антигена DR или к -цепи плюс циклофосфамид или к антигенам класса I, анализировали также набором CD45 и CD14 (таблица 18). Определение низкого по CD45, высокого по CD45 и среднего по CD45 является произвольным. Обработка образца крови 5/6 (через 2 часа) моноклональными антителами к -цепи антигена DR или этим моноклональным антителом плюс циклофосфамид, генерировала клетки, низкие по CD45⁺ и увеличивала относительное количество клеток, со средним уровнем CD45⁺. Однако первая из указанных обработок увеличивала относительное количество клеток с высоким уровнем CD45⁺, а последняя из указанных обработок уменьшала относительное количество клеток, со средним уровнем CD45⁺, и эти изменения, как представлялось, зависели от времени.

В образцах крови от пациента 5/6 и 10 (В-CLL) после обработки моноклональным антителом к антигенам класса I выявлено уменьшение относительного количества клеток, со средним уровнем CD45⁺ и аналогичные данные были отмечены в образцах крови 09 и HIV⁺ после такой же обработки при сравнении с необработанными пробами. Обработка образцов крови пациентов с HIV⁺ и IgA/D моноклональным антителом к антигену класса I увеличила относительное количество клеток с низким уровнем CD45⁺ при сравнении с необработанными образцами или образцами, моноклональным антителом к -цепи антигена DR. Однако в образцах крови этих пациентов выявлено уменьшение относительного количества клеток со средним уровнем CD45⁺ после обработки моноклональным антителом к гомологичным регионам -цепи антигена DR. Количество клеток со средним уровнем CD45⁺ в пробах крови пациента IgA/D после обработки моноклональным антителом к антигену класса I. Клетки, которые были крайне большими, насыщенными гранулами и экспрессировали интенсивные уровни антигена CD45, отмечались в образцах крови, обработанных моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена DR антигенов класса II МНС (см. карты 1, 2, 3, 4 и 5).

НАБОР CD8 И CD28
Антиген CD8 присутствует приблизительно на от 60 до 80% Т (CD3⁺)-лимфоцитах периферической крови, 50% Т-лимфоцитах CD8⁺ и 5% незрелых тимоцитах CD3^–. Во время созревания тимоцитов экспрессия антигена CD28 возрастает от низкой плотности на большинстве тимоцитов CD4⁺ CD8⁺ до более высокой плотности на фактически всех зрелых тимоцитах CD3⁺, CD4⁺ или CD8⁺. Клеточная активация далее усиливает плотность антигена CD28. Экспрессия CD28 также делит лимфоциты CD8⁺ на две функциональные группы. Лимфоциты CD8⁺ CD28⁺ опосредуют аллоантиген – специфическую цитотоксичность, которая ограничена классом I главного комплекса гистосовместимости (МНС). Подавление клеточной пролиферации опосредуется субпопуляцией CD8⁺ CD28⁺. Антиген CD28 представляет молекулу клеточной адгезии и функционирует в качестве лиганда для антигена В7/ВВ-1, который присутствует на активированных В-лимфоцитах.

Обработка образцов крови пациентов (таблица 19, пациенты 5/6 и 8) с В-CLL моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена DR увеличивало относительное количество клеток CD8⁺, CD28⁺ и CD8⁺ CD28⁺, а все другие типы не увеличивали.

НАБОР CD34 И CD2
Антиген CD34 присутствует на незрелых гематопоэтических клетках-предшественниках и всех гематопоэтических колониеобразующих клетках в костном мозге, включая унипотентные (CFU-GM, BFU-Е) и плюрипотентные предшественники (CFU-GEMM, CFU-Mix CFU-бласт). CD34 также экспрессируется на стромальных клетках-предшественниках. В- и Т-лимфоидные предшественники с терминальной дезоксинуклеотидил трансферазой (TdT)⁺ в нормальной кости являются CD34^–. Антиген CD34 присутствует на ранних миелоидных клетках, которые экспрессируют антиген CD33, но не имеют антигенов CD14 и CD15 и на ранних эритроидных клетках, которые экспрессируют антиген CD71 и слабо экспрессируют антиген CD45. Антиген CD34 также обнаруживается на капиллярных эндотелиальных клетках и приблизительно на 1% тимоцитов человека. Нормальные лимфоциты, моноциты, гранулоциты и тромбоциты периферической крови не экспрессируют антиген CD34. Плотность антигена CD34 является самой высокой на ранних гематопоэтических клетках-предшественниках и снижается по мере созревания клеток. Антиген отсутствует на полностью дифференцированных гематопоэтических клетках.

Некоммитированными клетками-предшественниками CD34⁺ являются CD34^–, DR^– и не имеют специфичных для линии антигенов, таких как CD71, CD33, CD10 и CD5, тогда как клетки CD34⁺, которые коммитированы с линией, в большой плотности экспрессируют антиген CD38.

Большинство клеток CD34⁺ реципрокно экспрессируют или антиген CD45RO, или антиген CD45RA. Приблизительно 60% клеток острого В-лимфоидного лейкоза и острого миелоидного лейкоза экспрессируют антиген CD34. Антиген не экспрессируется на клетках хронического лимфолейкоза (В- или Т-линии) или лимфом. Антиген CD2 присутствует на Т-лимфоцитах и субпопуляции лимфоцитов – естественных киллеров (NK).

Результаты показаны на картах 2, 3 и 5.

Анализ образцов крови пациента с В-CLL (таблица 20, пациент 5/6 через 2 часа) после обработки моноклональными антителами к -цепи антигена DR или -цепи того же антигена выявил выраженное увеличение относительного количества клеток CD34⁺ и CD34^– CD2^– после обработки первым из указанных антител. Поскольку те же образцы крови иммунотипировались упомянутыми выше наборами (см. таблицы от 14 до 19) по другим маркерам, наблюдаемое здесь увеличение относительного количества клеток CD34⁺ и CD34^– CD2^–, как представляется, совпадает с увеличением относительного количества одиночно положительных (SP) клеток CD4⁺ CD8⁺, CD8⁺ CD3⁺ и CD4⁺ CD3⁺. Кроме того, эти данные, которые, как представляется, исключительны для вовлечения -цепи антигена HLA-DR, прямо подтверждают, что процесс запускает Т-лимфопоэз через регрессию В-лимфоцитов.

При анализе такой же обработки через 24 часа уровни клеток CD34⁺, как представлялось, снижались для обеспечения дальнейшего увеличения относительного количества Т-лимфоцитов. Процесс ретродифференциации, который первоначально обеспечивал Т-лимфопоэз, может быть отменен для обеспечения В-лимфопоэза. Первый из указанных феноменов наблюдался через 2 часа периода инкубации с моноклональным антителом к -цепи антигена HLA-DR с циклофосфамидом, тогда как последний из указанных процессов был отмечен через 24 часа времени инкубации при той же обработке в той же пробе (карта 2).

Обработка проб крови пациента HIV⁺ (таблица 20, пациент HIV⁺) моноклональным антителом к -цепи антигена HLA-DR значительно увеличивала относительное количество клеток CD34⁺ и CD2⁺ CD34⁺, и это же давала обработка того же образца крови моноклональным антителом к -цепи антигена HLA-DR и моноклональным антителом к -цепи того же антигена при совместном добавлении. Однако обработка этого образца крови моноклональным антителом к -цепи антигена HLA-DR не влияла на уровень клеток CD34⁺. Обработка проб крови от 6-дневного младенца (ВВ/ST, таблица 20), который обследовался в то время для выявления лейкоза и у которого было очень большое количество атипичных клеток (бластов) в его крови моноклональным антителом к -цепи антигена HLA-DR или моноклональным антителом к -цепи того же антигена или обоими моноклональными антителами, добавляемыми вместе, приводила к следующим иммунофенотипическим изменениям.

При анализе необработанных проб крови относительное количество клеток CD34⁺ и DR⁺ заметно увеличивалось и далее увеличивалось при обработке моноклональным антителом к -цепи относительное количество клеток CD34⁺, но было отмечено уменьшение после обработки моноклональным антителом к -цепи антигена HLA-DR или обработки моноклональными антителами к – и -цепям молекулы при совместном добавлении. Однако последняя обработка увеличивала относительное количество клеток CD34⁺ CD2⁺ и противоположное происходило, когда тот же образец крови был обработан только моноклональным антителом к -цепи антигена HLA-DR. При анализе обработанных и необработанных аликвотных количеств крови одного и того же пациента через 24 часа относительное количество клеток CD34⁺ уменьшилось при всех указанных выше способах обработки, за исключением того, что оно поддерживалось на гораздо более высоком уровне при обработке моноклональным антителом к -цепи антигена HLA-DR. Последняя обработка продолжала уменьшать относительное количество клеток CD34⁺ CD2⁺ через 24 часа.

Эти результаты показывают, что вовлечение антигена HLA-DR через -цепь способствует продукции большего количества клеток CD34⁺ из пула CD2⁺ CD34^– или из более зрелых типов клеток, таких как В-лимфоциты пациентов с В-CLL, и эти результаты показывают, что этот тип обработки способствует ретродифференциации. Однако иммунофенотипирование проб крови через 24 часа свидетельствует о том, что эти типы клеток, как представляется, существуют в целом в другой линии, и в этом случае клетки, как представляется, существуют или скорее переходят в миелоидную линию, что наблюдалось при анализе пробы крови, обработанной набором CD7 и CD13 & 33.

Морфология изменяет иммунофенотипические характеристики В-лимфоцитов В-CLL и обогащенных фракций здоровых лиц (с использованием бусин CD19) после обработки моноклинальными антителами к гомологичным регионам -цепи антигенов класса II МНС. Они сопровождались изменением морфологии В-лимфоцитов. Наблюдалось, что В-лимфоциты, колонизирующие стеклянные покровные стекла, в необработанных мазках крови замещались гранулоцитами, моноцитами, большими количествами примитивно выглядящих клеток и имеющих ядра эритроцитов. В обработанных и необработанных мазках крови не наблюдались митотические фигуры или значительная гибель клеток.

Результаты, представленные в таблице 20, также демонстрирует еще одну важную находку, состоящую в том, что в соответствии со способами настоящего изобретения, можно получить недифференцированную клетку с помощью ретродифференциации более зрелой недифференцированной клетки.

D. МИКРОФОТОГРАФИИ
В дополнение к испытанию антигена, как указано выше, способ настоящего изобретения контролировался визуально с помощью микроскопа.

В этом отношении, фиг. 1 представляет микрофотографию дифференцированных В-клеток перед использованием способа настоящего изобретения. Фиг. 2 представляет микрофотографию недифференцированных клеток, образованных с помощью ретродифференциации В-клеток в соответствии с настоящим изобретением, в котором агентом было моноклональным антителом к гомологичным регионам -цепи антигена HLA-DR. Недифференцированные клетки представляют темно-окрашенные группы клеток. Фиг. 3 представляет микрофотографию тех же недифференцированных клеток, но при меньшем увеличении.

Таким образом, фиг. от 1 до 3 иллюстрируют ретродифференциацию В-клеток в недифференцированные стволовые клетки с помощью способа настоящего изобретения.

Фиг. 4 представляет микрофотографию дифференцированных В–клеток перед использованием способа настоящего изобретения.

Фиг. 5 представляет микрофотографию недифференцированных клеток, образованных с помощью ретродифференциации В-клеток в соответствии с настоящим изобретением, в котором использованным агентом было моноклональное антитело к гомологичным регионам -цепи антигена HLA-DR. И в этом случае недифференцированные клетки представляют темно-окрашенные группы клеток.

Фиг. 6 представляет микрофотографию образования дифференцированных гранулоцитарных клеток из тех же недифференцированных клеток, что и на фиг. 5.

Таким образом, фиг. от 4 до 6 иллюстрируют ретродифференциацию В-клеток в недифференцированные стволовые клетки с помощью способа настоящего изобретения с последующим превращением недифференцированных клеток в новые дифференцированные клетки, относящиеся к линии, отличной от исходных дифференцированных клеток.

Ретродифференциация Т-клеток в недифференцированные стволовые клетки с помощью способа настоящего изобретения с последующим превращением недифференцированных клеток в новые дифференцированные клетки, относящиеся к линии, отличной от исходных дифференцированных клеток, также прослеживалась с помощью микроскопии.

Е. РЕЗЮМЕ
Вкратце, примеры описывают эксперименты in vitro, которые выявляют крайне интересные находки относительно онтогенеза и развития Т- и В-лимфоцитов, которые могут быть использованы при образовании стволовых клеток для воздействия на лимфогематопэз в пробах периферической крови в течение нескольких часов.

Обработка образцов периферической крови, полученных у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом (В-CLL) с высоким уровнем В-лимфоцитов моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигенов класса II вызвали выраженное увеличение относительного количества одиночных положительных (SP) Т-лимфоцитов и их предшественников, которые были дважды положительными по маркерам тимоцитов антигенам CD4 и CD8, и они совместно экспрессировались одновременно. Однако эти феномены всегда сопровождались значительным уменьшением относительного количества В-лимфоцитов. Эти наблюдения не отмечались, когда те же пробы крови обрабатывали моноклональными антителами к гомологичному региону -цепи антигенов класса II или к гомологичному региону антигенов класса I.

Как оказалось, обработка цельной крови, полученной у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом (CLL) моноклональным антителом к гомологичному региону В-цепи антигена HLA-DR вызвала развитие Т-лимфопоэза. Этот процесс был отмечен появлением дважды положительных клеток, совместно экспрессирующих маркеры CD4 и CD8, появлением клеток, экспрессирующих CD34, и одновременным увеличением количества одиночных положительных лимфоцитов CD4⁺ CD3⁺ и CD8⁺ CD3⁺. Кроме того, иммунофенотипические изменения, которые имели место при генерации таких клеток, были идентичны изменениям, отмеченным при развитии тимоцитов, особенно, при определении в динамике.

Процентное содержание дважды положительных клеток (DP), генерированных через 2 ч периода инкубации цельной крови с моноклональным антителом к гомологичным регионам -цепи антигена DR, уменьшалось со временем, и эти процессы сопровождались увеличением процентного содержания одиночных положительных клеток CD4⁺ CD3⁺ и CD8⁺ CD3⁺ одновременно и на более поздних сроках также. и -цепи TCR были также экспрессированы на этих типах клеток.

Наблюдалось, что В-лимфоциты постоянно теряли маркеры, такие как CD19, CD21, CD23, IgM и DR, и это совпадало с появлением клеток CD34⁺ и CD34⁺ CD2⁺, увеличением количества клеток CD7⁺, увеличением количества клеток CD8⁺ CD28⁺ и CD28⁺, увеличением количества клеток CD25⁺, появлением клеток CD10⁺ и CD34⁺ и CD34⁺ и клеток CD19⁺, увеличением количества клеток CD5⁺ и клеток, экспрессирующих низкие уровни антигена CD45. Эти изменения были вследствие обработки крови моноклональным антителом к гомологичному региону -цепи антигена HLA-DR.

Иммунофенотипические изменения, связанные с такой обработкой, согласуются с ретродифференциацией и последующим коммитированием (т. е. рекоммитированием) В-лимфоцитов, потому что большинство лейкоцитов в крови пациентов с В-CLL перед обработкой, были В-лимфоцитами. Кроме того, В-лимфоциты пациентов с В-CLL, превращение которых в Т-лимфоциты было индуцировано после обработки циклофосфамидом и моноклональным антителом к -цепи антигена HLA-DR, были способны вернуться к В-лимфоцитам после длительной инкубации при этой обработке.

При анализе образцов, обработанных антителом к гомологичному региону -цепи антигена HLA-DR с использованием наборов CD16 & 56 и CD3 и CD8 и CD3, относительное количество клеток, экспрессирующих эти маркеры, постоянно увеличивается с приростами, согласующимися с приростами, определенными с использованием наборов, таких как CD19 и CD3 и DR и CD3. Исследование надосадочной жидкости обработанных и необработанных образцов пациентов с инфекцией HIV с использованием нефелометрии и иммуноэлектрофореза, выявляет увеличенные уровни IgG, указывающие на то, что В-клетки должно быть прошли через стадию плазматических клеток. Увеличение относительного количества всех указанных выше клеток также сопровождалось появлением клеток среднего размера, насыщенных гранулами, экспрессирующих антигены CD56 & 16 в крайне больших количествах. Наблюдалось транзиторное появление других клеток, которые были очень крупными и насыщенные гранулами, и они были положительными по CD34 и дважды положительными по маркерам CD4 CD8. Наблюдались также другие транзиторные клетки, и они были крупными и зернистыми и положительными по рецепторам CD3 и CD19. CD25, который присутствовал на большинстве В-лимфоцитов, был утрачен и стал экспрессироваться вновь образованными Т-лимфоцитами, количество которых наблюдалось всегда.

Клетки CD28⁺ CD8⁺ и CD28⁺ появлялись после обработки цельной крови пациентов с В-CLL моноклональным антителом к гомологичному региону В-цепи антигена DR. Эти данные получены вследствие обработки крови антителом к гомологичному региону -цепи антигена HLA-DR.

Т-лимфопоэз, генерированный таким образом, также наблюдался в периферической крови здоровых доноров крови, пуповинной крови, костном мозге, пациентов с различными инфекциями, включая лиц с HIV⁺ и пациентов со СПИДом, обогащенных фракциях В-лимфоцитов, полученных из проб крови здоровых доноров крови, пациентов с дефицитом lgА и других пациентов с различными другими состояниями. Кроме того, анализ миелоидных маркеров в обработанных образцах двух пациентов с В-CLL антителом к гомологичному региону -цепи антигена HLA-DR, показал значительное увеличение относительного количества клеток, экспрессирующих миелоидные маркеры, такие как CD13 и CD33. Эти маркеры совместно экспрессировались с антигенами CD56 & 16 или CD7. Однако на отдельной популяции клеток наблюдалось относительное количество клеток CD7⁺ с маркерами Т-лимфоцитов и без миелоидных антигенов. Именно эти изменения не отмечались в необработанных образцах или в образцах, обработанных моноклональными антителами к антигенам класса I или к гомологичному региону -цепи антигена HLA-DR (см. карты 2 и 3). Эти окончательные результаты свидетельствуют о том, что В-лимфоциты, однажды запущенные посредством -цепи антигена HLA-DR способны не только к обратному развитию в клетки-предшественники Т-лимфоцитов, но также способны существовать в миелоидной и эритроидной линии.

Следует отметить, что стволовые клетки, которые произведены с помощью способа настоящего изобретения, могут быть стволовыми клетками любой ткани и не обязательно ограничены лимфогематопоэтическими клетками-предшественниками.

Другие модификации настоящего изобретения будут очевидны для специалистов в этой области.

Формула изобретения

1. Способ повышения относительного числа клеток CD34⁺ в клеточной популяции, включающей в себя коммитированные клетки, который включает в себя I) контактирование клеточной популяции с агентом, который оперативно взаимодействует с указанными коммитированными клетками, и II) инкубацию коммитированных клеток, которые взаимодействуют с указанным агентом, так что относительное число клеток CD34⁺ в результате этого взаимодействия возрастает.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что коммитированные клетки являются гемопоэтическими клетками.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный агент взаимодействует с рецептором, которым опосредованы захват, узнавание или представление антигена на поверхности коммитированных клеток.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанный рецептор является антигеном класса I МНС или антигеном класса II МНС.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанным антигеном класса I МНС является ассоциированный с лейкоцитами человека (HLA)-A-рецептор, HLA-B-рецептор, HLA-C-рецептор, HLA-E-рецептор, HLA-F-рецептор или HLA-G-рецептор, а указанным антигеном класса II является HLA-DM-рецептор, HLA-DP-рецептор, HLA-DQ-рецептор или HLA-DR-рецептор.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что рецептором является HLA-DR-рецептор.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что рецептор включает в себя -цепь.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что -цепь имеет гомологичные участки.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что рецептор включает в себя по меньшей мере гомологичный участок -цепи HLA-DR.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что агентом является антитело к рецептору.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что агентом является моноклональное антитело к рецептору.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что антитело выбрано из группы, состоящей из моноклонального антитела CR3/43.

13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная инкубация длится от 2 до 24 ч.

14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что коммитированные клетки являются нераковыми клетками.

15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что коммитированные клетки являются дифференцированными клетками.

16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что коммитированные клетки выбираются из колониеобразующих Т-клеток (CFC-T-клетки), колониеобразующих В-клеток (CFC-B-клетки), эозинофильных колониеобразующих клеток (CFC-эозинофильные клетки), базофильных колониеобразующих клеток (CFC-базофильные клетки), колониеобразующих гранулоцитарных/моноцитарных клеток (CFC-GM-клетки), колониеобразующих мегакариоцитов (CFC-MEG-клетки), бурст-образующих эритроцитов (BFC-E-клетки), колониеобразующих эритроцитов (CFC-E-клетки), Т-клеток и В-клеток.

17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетки CD34⁺ являются клетками, содержащими антигены класса I MHC (МНС-класс I⁺-клетки) и/или антигены класса II MHC (МНС-класс II⁺-клетки).

18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что агент используется в сочетании с модификатором биологического ответа.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что модификатор биологического ответа представляет собой алкилирующий агент.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что алкилирующий агент представляет собой или включает в себя циклофосфамид.

РИСУНКИ