Патент на изобретение №2177993

(54) ЭКСПРЕСС-СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КОНИДИЙ ГРИБОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к экспресс-способу определения жизнеспособности конидий грибов Ascomycota, используемых в качестве посевного материала. Сущность способа состоит в том, что перед посевом конидии смачивают эталоном, среду готовят на основе цитратно-фосфатного буфера с добавлением агара, в качестве источника углерода используют глюкозу, азота – пептон. Питательную среду наносят на предметное стекло, культивирование осуществляют во влажной камере, контроль за стадиями прорастания конидий проводят путем микроскопирования в световом микроскопе, при этом перед микроскопированием на поверхность среды помещают окулярную сетку. Способ позволяет выявить значительно больше жизнеспособных конидий, ускорить процесс прорастания конидий на 1,5-2 ч. 2 з. п. ф-лы.

Способ относится к области биотехнологии, в частности к установлению жизнеспособности (всхожести) конидий грибов, используемых в качестве посевного материала.

В последние годы все большее внимание уделяется развитию биотехнологических производств, которые дают возможность быстрее и дешевле экологически чистым способом получать лекарственные препараты, пищевые добавки, заменители пищевого белка и даже нетканые материалы.

Основными продуцентами большинства современных биотехнологических производств являются мицелиальные грибы, относящиеся к Neomycota и Eomycota. В таких производствах используют в качестве посевного спорового материала конидии и спорангиоспоры. Известно, что эти споры находятся в особом состоянии, получившем название экзогенного покоя, когда большая часть метаболических процессов находится в стадии торможения и не происходит роста и пролиферации клеток. В таком “спящем” состоянии грибные споры могут находиться достаточно долгое время без потери жизнеспособности. Однако при нарушении условий хранения часть спор может потерять всхожесть и поэтому перед внесением спорового материала в ферментер необходимо провести проверку на его способность к прорастанию.

Такая процедура является очень важным звеном в любом биотехнологическом производстве, например для получения лимонной кислоты с помощью аскомицета Aspergillus niger. В данном случае достаточно часто наблюдается почти 100% потеря всхожести конидий, которая иногда сопровождается появлением “кислого” запаха. Следует также особо отметить, что процесс прорастания конидий является достаточно мало изученным биологическим феноменом, а биотехнологические производства нуждаются не только в корректном и достоверном способе определения жизнеспособности спорового посевного материала, но и в экспресс-способе, методически простом, не требующем сложного специализированного оборудования и дорогостоящих реактивов.

Известно несколько способов установления жизнеспособности посевного материала, которые используются в микробиологических производствах одновременно как для определения жизнеспособности, так и для обнаружения инфекции [1-6] . Наиболее распространены способы определения жизнеспособности на жидких средах [1] , либо на твердой (агаризованной) среде путем рассева спор на чашках Петри [2,3] . Для обнаружения жизнеспособных микроорганизмов, в том числе патогенных, используют такой признак, как качественное и количественное изменение состава питательных сред, например потребление источников углерода и азота, образование токсинов, пигментов и др. [4] . Для целей обнаружения жизнеспособных микроорганизмов используют также автоматический анализ микробиологических объектов (анализатор микрообъектов АБ-3) или автоматический цитоспектрофлуориметр с применением люминесцентного метода окрашивания живых клеток [5] .

Определение жизнеспособности зооспорангиев патогенных грибов определяют биологическим способом, т. е. путем высаживания восприимчивых к раку сортов картофеля в почву, содержащую зооспорангии патогена, либо путем окрашивания зооспорангиев 0,5% раствором трифенилтетразолхлорида при 35^oС, или 0,5-0,7% раствором нитросинего тетразолия при 35-36^oС в присутствии гомогенатов гриба Aspergillus fumigatus или A. niger [6] . Используют также биохимический метод обнаружения жизнеспособных спор грибов по содержанию в них АТФ [7] .

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ определения жизнеспособности конидий мицелиального гриба Cunninghamella japonica [1] , согласно которому споры в количестве 2-510⁶ помещали в колбы вместимостью 250 мл, содержащие 10 мл среды и инкубировали на качалке (160 об/мин) при температуре 28^oС. Контроль за прорастанием спор проводили с интервалом 1 ч с использованием фазово-контрастного микроскопа. Для подбора оптимальной среды использовали бидистиллированную воду с добавлением следующих соединений (%): углеводов – 0,2; аминосахаров – 0,2; жирных кислот – 0,1; пептона – 0,1; белкозина – 0,5; цАМФ – 0,001; аминокислот – 0,01 М и твинов – 1: 100 (v/v). В качестве оптимальной среды использовали бидистиллированную воду с добавлением 0,01 М L-пролина, которая обеспечивала максимальное прорастание конидий С. japonica. В опытах проросшими считали конидии, у которых длина проростковых трубочек достигала половины диаметра конидии.

Недостатком данного способа является то, что конидии многих грибов, например порядка Eurotiales, при культивировании на жидкой среде слипаются, образуя пеллеты, что сильно затрудняет подсчет жизнеспособных конидий. Кроме того в жидких средах прорастание часто бывает несинхронным, т. е. конидии в одном опыте могут находиться на различных стадиях прорастания, а сам процесс прорастания может продолжаться длительное время и нарушать график, установленный для биотехнологического процесса.

Поэтому целью настоящего изобретения является разработка экспресс-способа определения жизнеспособности конидий грибов, относящихся к порядку Eurotiales, классу Ascomycota.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что готовят питательную среду, споровый посевной материал – конидии – смачивают этанолом и добавляют воду. Получают суспензию конидий определенной концентрации, которой равномерно засевают поверхность агаризованной среды, нанесенной тонким слоем на предметное стекло. Инокулированные стекла помещают в чашку Петри на поверхность фильтровальной бумаги, увлажненной водой, и помещают в термостат при температуре 26-32^oС. Затем осуществляют контроль за прорастанием конидий. Для этого через 1,5-2 ч на поверхность среды помещают окулярную сетку и, используя световой микроскоп с увеличением 250-400, подсчитывают количество проросших и непроросших конидий. Конидии проходят следующие стадии прорастания: I – набухание; II – появление проростковой трубочки; III – стадия истинного прорастания, когда длина проростковой трубочки достигает половины диаметра конидии; IV – стадия ветвления гиф. В случае необходимости осуществляют подсчет проросших конидий.

Примеры конкретного выполнения способа определения жизнеспособности спор грибов
Пример 1
Определяют жизнеспособность конидий Aspergillus niger ВКПМ F-790. С этой целью готовят суспензию конидий (СК): 20 мг конидий смачивают 0,05 мл этанола и добавляют 10 мл воды. На поверхность предметного стекла наносят тонким слоем 2 мл расплавленной агаризованной среды, содержащей 0,1% пептона и 0,15% глюкозы в фосфатно-цитратном буфере с рН – 4,0. После застывания агара на поверхность среды наносят 1 каплю (0,02-0,04 мл) СК, которую равномерно распределяют стеклянной палочкой по поверхности среды. После засева предметное стекло помещают в чашку Петри на фильтровальную бумагу, смоченную 0,5 мл воды. Чашку Петри помещают в термостат при 32^oС. Контроль за процессом прорастания осуществляют микроскопически, в случае необходимости подсчитывают количество проросших конидий, для этого на поверхность агаровой среды помещают окулярную сетку, считают конидии в 5-8 квадратах (в сумме 600 конидий) и вычисляют долю проросших конидий. При микроскопическом контроле в световом микроскопе уже через 2 ч обнаруживают на 30% больше набухших конидий (стадия I), чем по методу прототипа, а через 6 ч (стадия II) – на 15% больше проросших конидий.

Пример 2
То же, что и в примере 1, но в качестве питательной среды используют среду следующего состава (г/л): сахароза – 30,0; КН₂РO₄ – 10,0; MgSO₄7Н₂О – 10,0; КСl – 0,5; FeSO₄ – 0,01; ZnSO₄ – 0,05. В I стадии прорастания обнаружено на 12% больше жизнеспособных конидий, а через 6 ч (II стадия) – на 15% больше, чем по методу, описанному в прототипе.

Пример 3
То же, что и в примере 1, но в качестве питательной среды используют 0,3% пептона и 0,5% глюкозы в фосфатно-цитратном буфере с рН 5,1. При микроскопическом контроле в световом микроскопе уже через 2 часа обнаруживают на 11% больше набухших конидий (стадия I), чем по методу прототипа, а через 6 ч (стадия II) – на 13% больше проросших конидий.

Пример 4
То же, что в примере 1, но в качестве продуцента используют Penicillium lanosum BKM F-1956. При микроскопическом контроле в световом микроскопе уже через 2 ч обнаруживают на 25% больше набухших конидий (стадия I), чем по методу прототипа, а через 6 ч (стадия II) – на 14% больше проросших конидий.

Пример 5.

То же, что и в примере 3, но в качестве продуцента используют Aspergillus niger BKM F-33. При микроскопическом контроле в световом микроскопе уже через 2 ч обнаруживают на 21% больше набухших конидий (стадия I), чем по методу прототипа, а через 6 ч (стадия II) – на 13% больше проросших конидий.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет выявить значительно больше, практически на 30% (см. пример 1), жизнеспособных конидий, не требует применения фазово-контрастной микроскопии, методически более прост (не нуждается в стерильном отборе проб, применении качалок), более точен, так как на его результат не влияет процесс агрегации (слипания) конидий, процесс прорастания ускоряется на 1,5-2 ч.

ЛИТЕРАТУРА

4. Принципы быстрого обнаружения патогенных микроорганизмов и вирусов. 1969. Саратов. С. 39-72.

Формула изобретения

1. Способ определения жизнеспособности конидий грибов, включающий приготовление питательной среды, содержащей источники углерода и азота, последующий посев конидий на среду, культивирование их и контроль стадий прорастания конидий путем микроскопирования, отличающийся тем, что перед посевом конидии смачивают этанолом, среду готовят на основе фосфатно-цитратного буфера с рН 3,8-5,1, с добавлением агара, среду наносят на предметное стекло, после посева конидий на среду предметное стекло помещают во влажную камеру при 26-32^oС, культивируют конидии, микроскопирование осуществляют в световом микроскопе.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осуществляют подсчет проросших конидий.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника углерода при определении жизнеспособности грибов порядка Eurotiales, в частности Aspergillus и Penicillium, в качестве источника углерода используют глюкозу в количестве 0,15-0,5%, а в качестве источника азота-пептон в количестве 0,1-0,3% от объема среды.

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Прежний патентообладатель:

Открытое акционерное общество Белгородский завод лимонной кислоты “Цитробел”

(73) Патентообладатель:

Закрытое акционерное общество “Цитробел”

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 19.05.2006 № РД0008897

Извещение опубликовано: 10.07.2006 БИ: 19/2006

PC4A Государственная регистрация перехода исключительного права без заключения договора

(73) Патентообладатель(и):

Закрытое акционерное общество “Цитробел”

(73) Патентообладатель:

Общество с ограниченной ответственностью “Цитробел”

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 09.06.2010 № РП0000823

Извещение опубликовано: 20.07.2010 БИ: 20/2010