Патент на изобретение №2177617
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЛЕПТОСПИРОЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ЛАТЕКС-АГГЛЮТИНАЦИИ
(57) Реферат: Изобретение относится к медицине, в частности к ветеринарии, а именно к иммунологии, и может использоваться для диагностики лептоспироза человека и животных. Способ обеспечивает раннее и быстрое обнаружение антигенов лептоспир и одновременное установление их серогрупповой принадлежности. Проводят адсорбцию одного из компонентов иммунного теста на поверхности микрокапсул латекса, используемых в качестве носителя, и предусматривают в процессе приготовления воздействие ультразвуковыми колебаниями на продукты адсорбции с последующими отмывкой центрифугированием, инкубацией в холодильнике, добавлением консерванта и разливкой по флаконам. В качестве микросфер латекса используют карбоксилированные частицы, активированные карбодиимидом, при этом IgG-антитела к лептоспирам серогрупп Canicola и Icterohaemorrhagiae адсорбируют на упомянутых частицах латекса путем обработки на ультразвуковой бане в течение 3  0,5 мин с последующим встряхиванием при температуре 41oС и дальнейшей инкубации смеси при этой же температуре. Затем продукты адсорбции отмывают дистиллированной водой центрифугированием и к полученному осадку добавляют физиологический раствор до первоначального объема. 5 з.п.ф-лы, 1 табл.
Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к иммунологии, и может использоваться для диагностики лептоспироза человека и животных. Диагностика лептоспироза трудна как в связи с его клиническим полиморфизмом, так и с особенностями возбудителей, представленных лептоспирами 202 сероваров, объединенных в 23 серологических группы. Это заболевание имеет сходную клиническую картину с гепатитами, геморрагической лихорадкой с почечным синдромом, гриппом, брюшным и сыпным тифом и др. Поэтому при лептоспирозе нередки диагностические ошибки и только указания на характер профессиональной деятельности человека, соответствующие эпидемическая и эпизоотическая обстановка в определенной степени ориентируют клинициста. У животных лептоспирозная инфекция вообще может протекать бессимптомно и лишь появление выкидышей и мертворожденного потомства служат указанием на лептоспироз. Основой диагностики лептоспироза у людей и животных являются микробиологические исследования. В соответствии с [1] большое значение уделяется бактериологическим и иммунологическим методам. Однако первый из них требует длительного времени (до трех месяцев) в связи с медленным размножением лептоспир (время генерации до 14 ч), определенных навыков работы, т.к. индикация возбудителей до серогруппы проводится в реакции микроагглютинации (РМА), результаты которой учитываются в темном поле зрения микроскопа. Обнаружение антител в сыворотке крови инфицированных в РМА является поздним методом диагностики и требует поддержания набора из 15-23 живых эталонных патогенных культур лептоспир, что не всегда возможно. Кроме того, могут наблюдаться перекрестные реакции, в результате чего возникает необходимость в проведении трудоемкого иммуноабсорбционного теста. В качестве экспресс-метода для обнаружения противолептоспирозных антител разработаны разные варианты тест-систем, однако все они относятся к поздним методам диагностики [2,3]. В качестве диагностикума в других тест-системах используют латексные частицы, нагруженные антигеном лептоспир одного из сероваров [4] . Реакция латекс-агглютинации (РЛА) выполняется в планшетах в микроварианте с разведением исследуемой сыворотки, что позволяет выявить титр противолептоспирозных антител и динамику их накопления. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ приготовления лептоспирозного диагностикума для постановки реакции латекс- агглютинации, включающий адсорбцию одного из компонентов иммунного теста на поверхности микросфер латекса, используемых в качестве носителя, и предусматривающий в процессе приготовления воздействие ультразвуковыми колебаниями на продукты адсорбции (для приготовления лептоспирозного антигена) с последующими отмывкой центрифугированием, инкубацией в холодильнике, добавлением консерванта и разливкой по флаконам [5]. Однако как в указанной выше тест-истеме [4], так и в ближайшем аналоге [5] на поверхность микросфер латекса адсорбированы антигены лептоспир, обладающие родоспецифической активностью при обнаружении противолептоспирозных антител, что не позволяет диагностировать заболевание в первые дни болезни и установить серогрупповую принадлежность этиологического агента. Техническим результатом настоящего изобретения является разработка диагностикума для тест-системы с целью раннего и быстрого обнаружения антигенов лептоспир и одновременного установления их серогрупповой принадлежности. Поставленная цель достигается тем, что способ приготовления лептоспирозного диагностикума для постановки реакции латекс- агглютинации включает адсорбцию одного из компонентов иммунного теста на поверхности микросфер латекса, используемых в качестве носителя, и предусматривает в процессе приготовления воздействие ультразвуковыми колебаниями на продукты адсорбции с последующими отмывкой центрифугированием, инкубацией в холодильнике, добавлением консерванта и разливкой по флаконам. В качестве микросфер латекса используют карбоксилированные частицы, активированные карбодиимидом, а в качестве компонента иммунного теста – IgG-антитела к лептоспирам серогрупп Canicola и Icterohaemorrhagiae, которые адсорбируют на упомянутых частицах латекса путем обработки на ультразвуковой бане в течение 3 0,5 мин с последующим встряхиванием при температуре 41oC и дальнейшей инкубацией смеси при той же температуре. Затем продукты адсорбции отмывают дистиллированной водой центрифугированием и к полученному осадку добавляют физиологический раствор до первоначального объема.
Способ может характеризоваться тем, что упомянутые противолептоспирозные IgG-антитела выделены из гипериммунных сывороток кроликов путем их обработки полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000.
Способ может характеризоваться также тем, что встряхивание проводят в течение 1,5 – 2,0 ч, а также тем, что инкубацию смеси при температуре 41oC проводят в течение 4 сут.
Способ может характеризоваться тем, что центрифугирование проводят при скорости 4000 об/мин в течение 10 – 15 мин трижды, а также тем, что в качестве консерванта используют раствор азида натрия в конечной концентрации 0,05%.
Существо изобретения состоит в том, что впервые для диагностики лептоспироза предложено адсорбировать на поверхность частиц латекса не антигены лептоспир, а противолептоспирозные антитела класса G (антительный латексный диагностикум – АЛД). Это позволяет не только обнаружить лептоспирозные антигены в моче и крови животных в первые дни инфекции и у бактерионосителей, но одновременно в течение нескольких минут установить серогрупповую принадлежность возбудителя, не прибегая к использованию таких трудоемких методов, как РМА и иммуноабсорбционный тест. Упомянутое дает возможность рекомендовать использование патентуемого диагностикума в тест- системе как экспресс-метода при лептоспирозной инфекции.
Пример реализацииВ качестве микросфер латекса используют карбоксилированные частицы, активированные карбодиимидом. Способ их приготовления известен из патента Польши (PL 165456 В1, C 08 F 112/08, оп. 30.12.1994). IgG-антитела к лептоспирам серогрупп Canicola и Icterohaemorrhagiae выделены из гипериммунных сывороток кроликов путем их обработки полиэтиленгликолем (ПЭГ 6000). Их адсорбируют на микросферах латекса путем обработки на ультразвуковой бане в течение 3 мин с последующим встряхиванием в течение 2 ч при температуре 4oС. Дальнейшая инкубация полученной смеси проводится в течение 4 сут при той же температуре. Затем продукты адсорбции отмывают дистиллированной водой центрифугированием при скорости 4000 об/мин в течение 15 мин трижды. К полученному осадку добавляют физиологический раствор до первоначального объема. В качестве консерванта используют раствор азида натрия в конечной концентрации 0,05%. Определение активности и специфичности тест-системы. Для определения активности полученных АЛД анти-Canicola и анти-Icterohaemorrhagiae по 0,02 мл каждого АЛД смешивали на стекле с равным объемом культуры лептоспир Каширский (серогруппа Canicola) и М-20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae). Контролем служила 10%-ная водно-сывороточная среда для культивирования лептоспир. В положительном случае визуально регистрировалась агглютинация частиц латекса. Отмечали время появления агглютината. Установлено, что агглютинация наступала через 2-3 мин при концентрации лептоспир (3 – 4,5)  106 кл/мл только в гомологичных системах. АЛД анти-Canicola не агглютинировал культуру М-20 (lcterohaemorrhagiae) и наоборот.
Для определения специфичности данной тест-системы ставили РЛА с эталонными штаммами патогенных лептоспир 15 серогрупп, которые наиболее часто встречаются на территории нашей страны.
Установлено, что агглютинация АЛД анти-Canicola происходила только в присутствии лептоспир HondUtrecht IV (серогруппа Canicola), а АЛД анти-Icterohaemorrhagiae только при взаимодействии с культурой М-20 (Icterohaemorrhagiae). С лептоспирами других серогрупп реакция была отрицательной. Эти результаты свидетельствуют о том, что приготовленные АЛД обладают серогрупповой специфичностью.
Пример конкретного использования.
Пять белых мышей внутрибрюшинно инфицировали культурой лептоспир Каширский и пять – культурой лептоспир М-20 (Icterohaemorrhagiae). Кровь из сердца инфицированных мышей, взятую при вскрытии животных через 30, 90, 120, 150 мин, засевали в 10%-ную водно-сывороточную среду и исследовали в РЛА, которую ставили следующим образом.
На предметное стекло наносили две капли цитратной крови инфицированной мыши, к каждой из которых добавляли по капле дистиллированной воды. После того, как наступал гемолиз эритроцитов, в одну каплю вносили АЛД анти-Canicola, а в другую – АЛД анти-lcterohaemorrhagiae. Контролем служила капля цитратной крови неинфицированной мыши. Учитывали время появления агглютинации латексных частиц в положительных случаях.
Результаты представлены в таблице.
Полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности и специфичности предложенной тест-системы на основе АЛД анти-Canicola и анти-lcterohaemorrhagiae. Степень чувствительности ее сопоставима с такими методами исследования как микроскопический, встречный иммуноэлектрофорез [6], РСК [7] , РТНГА [8], что свидетельствует о перспективности патентуемого изобретения.
Источники информации1. Эпидемиология, диагностика, клиника и профилактика лептоспироза. Методические рекомендации МЗ РФ. М., 1987. Формула изобретения
0,5 мин с последующим встряхиванием при температуре 41oС и дальнейшей инкубацией смеси при этой же температуре, затем продукты адсорбции отмывают дистиллированной водой центрифугированием и к полученному осадку добавляют физиологический раствор до первоначального объема.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутые противолептоспирозные IgG-антитела выделены из гипериммунных сывороток кроликов путем их обработки полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000.
3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что встряхивание проводят в течение 1,5-2,0 ч.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что инкубацию смеси при температуре 41oС проводят в течение 4 суток.
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что центрифугирование проводят при скорости 4000 об/мин в течение 10-15 мин трижды.
6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что в качестве консерванта используют раствор азида натрия в конечной концентрации 0,05%.
РИСУНКИ
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 30.05.2004
Извещение опубликовано: 10.03.2005 БИ: 07/2005
NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение
Извещение опубликовано: 10.07.2005 БИ: 19/2007
QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения
Лицензиар(ы): Волина Елена Григорьевна, Слугин Игорь Владимирович
Вид лицензии*: НИЛ
Лицензиат(ы): Закрытое акционерное общество фирма “Научно-производственный ветеринарный и звероводческий центр “Ветзвероцентр”
Договор № РД0050467 зарегистрирован 25.05.2009
Извещение опубликовано: 10.07.2009 БИ: 19/2009
* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия
|
||||||||||||||||||||||||||
