Патент на изобретение №2177035

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК ИЗ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии. Для выделения препаратов ДНК, пригодных для ПЦР, исследуемый образец (клетки дрожжей, грибов и грамположительных микробов) суспендируют в буферном растворе, содержащем соль хаотроп (гуанидинтиоцианат или гуанидинхлорид), восстановитель дисульфидных связей (2-меркаптоэтанол), хелатирующий агент (ЭДТА) и детергент (саркозил) в соответствующих концентрациях, при соотношении буферного раствора к объему клеток микроорганизмов, превышающем 5:1. Суспензию нагревают при температуре кипения воды в течение 3-7 мин, затем клетки осаждают центрифугированием. Супернатант отбрасывают, а осадок, содержащий геномную ДНК, прочно ассоциированную с клеточными оболочками микроорганизмов, дважды промывают водой и суспендируют в дистиллированной воде или в ТЕ. Полученную суспензию используют непосредственно для ПЦР. Изобретение решает задачу упрощения, удешевления процесса и сокращения времени обработки. 2 з. п. ф-лы.

Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к методам выделения ДНК, и может быть использовано в лабораторной и исследовательской практике для получения образцов ДНК из клеток дрожжей, грибов, грамположительных микробов и других микроорганизмов с прочной клеточной стенкой, для последующей ПЦР-амплификации специфических фрагментов микробных ДНК.

Подготовка биологического материала для ПЦР-амплификации предполагает 1) разрушение клеток и освобождение внутриклеточной ДНК, а также 2) по крайней мере, частичную очистку ДНК от белковых, липидных, полисахаридных и прочих примесей, способных ингибировать ДНК-полимеразную реакцию.

Известен способ выделения ДНК, основанный на использовании лизоцима, додецилсульфата натрия, ЭДТА в качестве индукторов лизиса клеточной стенки, с последующей депротеинизацией лизата хлороформом или фенолом и осаждением ДНК изопропанолом [1].

Для разрушения клеточных стенок дрожжей с целью получения образцов высокомолекулярных ДНК наиболее часто используют литические ферменты (зимолиазу, литиказу и др.) [2-3]. Иногда применяют комбинированные подходы (например, клетки дрожжей обрабатывают литическими ферментами в сочетании с замораживанием и оттаиванием [3] или осуществляют механическую деструкцию грибного мицелия и дрожжей с помощью высокоскоростных дезинтеграторов в присутствии хаотропных агентов [4] ). При выделении ДНК клетки дрожжей разрушают также с помощью мелких стеклянных шариков [5]. Описаны также методы разрушения клеток грамположительных микроорганизмов и дрожжей (и выделения из этих клеток ДНК) с помощью обработки последних 3% SDS [6,7].

Вышеперечисленные методы выделения ДНК, однако, достаточно трудоемки, дороги и занимают много времени.

Известен наиболее близкий к заявленному способ выделения ДНК [8], основанный на использовании буферных растворов, содержащих высокие концентрации солей-хаотропов типа гуанидинтиоцианата, способных лизировать оболочки многих грамотрицательных микробов.

Способ осуществляют следующим образом.

Исследуемую пробу (биологический материал, содержащий клетки грамотрицательных микробов, культуру клеток животных и человека, образцы крови, сыворотку крови и т.д.) вносят в буфер, содержащий гуанидинтиоцианат, ЭДТА, тритон Х100 и сорбент нуклеиновых кислот – SiO₂. Суспензию инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют. Супернатант выбрасывают, а осадок сорбента с НК промывают дважды отмывающим буфером, содержащим гуанидинтиоцианат, два раза 70% этанолом и 1 раз ацетоном. После удаления ацетона НК элюируют с сорбента путем инкубации с ТЕ буфером при 56^oC в течение 10 мин. После этого элюат (супернатант) с ДНК пригоден для постановки ПЦР.

Недостатками прототипа являются:
1. Невозможность использования клеток грамположительных микроорганизмов, дрожжей и грибов, обладающих клеточной стенкой, устойчивой к действию солей- хаотропов.

2. Длительность и значительная трудоемкость выполнения способа.

3. Многокомпонентность используемых растворов и высокая стоимость применяемых реактивов.

Изобретение решает задачу упрощения, удешевления процесса и сокращения времени обработки.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе выделения геномной ДНК из клеток микроорганизмов, включающем обработку клеток буферным раствором, содержащим соль-хаотроп, для выделения ДНК используют микроорганизмы с прочной клеточной стенкой, а обработку проводят при нагревании клеточной суспензии (реакционной смеси) на кипящей водяной бане в течение 3-7 мин.

Установлено, что с помощью буферных растворов, содержащих высокие концентрации солей-хаотропов, из клеток дрожжей и других микроорганизмов с прочной клеточной стенкой можно экстрагировать практически все белки, липиды, полисахариды, значительную часть РНК и все низкомолекулярные соединения. Причем экстракция вышеперечисленных компонентов может быть осуществлена в широком диапазоне температур, включая температурный диапазон, при котором не происходит плавление (денатурация) ДНК. Скорость процесса при этом сильно зависит от температуры. Так, при 100^oC процесс завершается в течение нескольких минут (при этой температуре ДНК денатурирует и частично фрагментирует); при 37-45^oC процесс завершается в течение нескольких часов, причем ДНК остается интактной двухцепочечной [9].

В присутствии высокой концентрации солей-хаотропов происходит пермеабилизация клеточной оболочки, солюбилизация мембранных структур, полная денатурация всех клеточных белков (в том числе РНКаз и ДНКаз) и полная депротеинизация хромосомных ДНК. В то время как белки, липиды и другие компоненты дифундируют из клетки, хромосомная ДНК из-за своей большой длины (длина хромосомных ДНК во много раз превышает линейные размеры клетки) остается внутри клеточной оболочки.

Другими словами, денатурированная геномная ДНК, получаемая в процессе экстракции солями-хаотропами при температурах выше температуры плавления ДНК, прочно ассоциирована с клеточными оболочками.

Как оказалось, клеточные оболочки с денатурированной ДНК можно непосредственно использовать в ПЦР без предварительной обработки литическими ферментами.

Способ осуществляют следующим образом.

Клетки микроорганизмов выращивают в жидких или на агаризованных питательных средах различного состава. Преимущественно используют богатые питательные среды. Биомассу клеток (конец логарифмической фазы роста) собирают центрифугированием и отмывают от питательной среды холодным буфером с pH, близким к нейтральному и содержащим ЭДТА (от 10 до 50 mM). Клетки суспендируют в буфере для экстракции со значением pH, близким к 8.0, содержащим соль-хаотроп (6-8 М гуанидинхлорид или 4М гуанидинтиоцианат), детергент (0,5% саркозил) и восстановитель дисульфидных связей (10-100 mM меркаптоэтанол). При этом соотношение объема экстракционного буфера к объему клеточного осадка должно превышать 5:1. Оптимальным для дрожжей является соотношение 5:1; для грамположительных микроорганизмов – 20:1.

Для получения образцов денатурированной ДНК для ПЦР-амплификации полученные клеточные суспензии инкубируют на водяной бане (100^oC) в течение 3-7 мин (преимущественно 5 мин). Клетки осаждают центрифугированием и дважды промывают дистиллированной (или деионизованной) водой при комнатной температуре. Полученные клеточные оболочки с ДНК суспендируют в стерильной дистиллированной воде (конечная концентрация клеточных оболочек составляет 1х10⁸ – 1х10⁹ в 1 мкл) и используют в ПЦР. В опыт берут 1-2 мкл клеточной суспензии на 50 мкл смеси для ПЦР.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. Получение образцов ДНК для ПЦР-амплификации из дрожжей Shizosaccharomyces pombe.

Клетки дрожжей выращивают в жидкой среде YPD (1,0% дрожжевого экстракта, 2,0% бактопептона, 2,0% глюкозы, pH 5,3) или на чашках с агаризованной средой YPD при 30^oC.

Биомассу дрожжей объемом 25-30 мкл суспендируют в 200 мкл экстракционного буфера I (4М гуанидинтиоцианат, 50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 5 мМ ЭДТА, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозина), либо в таком же количестве буфера II (4М гуанидинтиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозила) в 1,5 мл центрифужных пробирках Eppendorf.

Клеточную суспензию кипятят на водяной бане в течение 5 мин.

Клетки осаждают центрифугированием при 12 тысяч об/мин в течение 30-60 сек на центрифуге Eppendorf. Супернатант удаляют.

Клеточный осадок суспендируют в 1000 мкл деионизованной (дистиллированной) воды и затем центрифугируют в тех же условиях. Супернатант удаляют.

Проводят повторную промывку клеточного осадка 1000 мкл деионизованной воды.

Клеточный осадок после второй промывки суспендируют в 200 мкл стерильной деионизованной воды.

1-2 мкл клеточной суспензии (т.е. клеточных оболочек с денатурированной ДНК) добавляют к 25-50 мкл смеси для ПЦР, содержащей соответствующий буфер, смеси 4-х dNTPs, праймерные олигонуклеотиды и термостабильную ДНК-полимеразу (например, Taq-полимеразу).

Проводят ПЦР. Режим ПЦР – с учетом размера амплифицируемого фрагмента и структуры праймеров.

Пример 2. Получение образцов ДНК для ПЦР-амплификации из дрожжей Pichia pastoris. (аналитический вариант)
Клетки дрожжей P. pastoris выращивают в жидкой среде YPD вышеприведенного состава или на чашках с агаризованной средой YPD при 30^oC.

Биомассу дрожжей (10⁶-10⁸ клеток) суспендируют в 50 мкл экстракционного буфера Iа (4М гуанидинтиоцианат, 50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 5 мМ ЭДТА, 0,5% лауроилсаркозина) в 1,5 мл центрифужных пробирках Eppendorf. Минимальное количество биомассы для анализа – образующий видимый для глаза осадок при центрифугировании.

Клеточную суспензию кипятят на водяной бане в течение 3 мин.

Клетки осаждают центрифугированием при 12 тысяч об/мин в течение 30-60 сек на центрифуге Eppendorf. Супернатант удаляют.

Клеточный осадок суспендируют в 200 мкл деионизованной (дистиллированной) воды и затем центрифугируют в тех же условиях. Супернатант удаляют.

Проводят повторную промывку клеточного осадка 200 мкл деионизованной воды.

Клеточный осадок после второй промывки суспендируют в 5-10 мкл стерильной деионизованной воды.

1-2 мкл клеточной суспензии (т.е. клеточных оболочек с денатурированной ДНК) добавляют к 25-50 мкл смеси для ПЦР, содержащей соответствующий буфер, смеси 4-х dNTPs, праймерные олигонуклеотиды и термостабильную ДНК-полимеразу (например, Taq-полимеразу).

Проводят ПЦР. Режим ПЦР – с учетом размера амплифицируемого фрагмента и структуры праймеров.

Пример 3. Получение образцов ДНК для ПЦР-амплификации из дрожжей Pichia pastoris (препаративный вариант).

Клетки дрожжей P. pastoris выращивают в жидкой среде YPD вышеприведенного состава или на чашках с агаризованной средой YPD при 30^oC.

Биомассу дрожжей (25-30 мкл) суспендируют в 50 мкл экстракционного буфера III (6М гуанидинхлорид, 30 мМ трис-HCl, pH 8.0, 5 мМ ЭДТА, 0,5% лауроилсаркозина) в 1,5 мл центрифужных пробирках Eppendorf.

Клеточную суспензию кипятят на водяной бане в течение 7 мин.

Клетки осаждают центрифугированием при 12 тысяч об/мин в течение 30-60 сек на центрифуге Eppendorf. Супернатант удаляют.

Клеточный осадок суспендируют в 1000 мкл деионизованной (дистиллированной) воды и затем центрифугируют в тех же условиях. Супернатант удаляют.

Проводят повторную промывку клеточного осадка 1000 мкл деионизованной воды.

Клеточный осадок после второй промывки суспендируют в 100-200 мкл стерильной деионизованной воды.

1-2 мкл клеточной суспензии (т.е. клеточных оболочек с денатурированной ДНК) добавляют к 25-50 мкл смеси для ПЦР, содержащей соответствующий буфер, смеси 4-х dNTPs, праймерные олигонуклеотиды и Taq-полимеразу.

Проводят ПЦР. Режим ПЦР – с учетом размера амплифицируемого фрагмента и структуры праймеров.

Вся процедура подготовки образцов для ПЦР занимает около 15 мин. Причем одновременно можно анализировать несколько десятков образцов (клонов).

Как следует из данных проведенного анализа, в ходе ПЦР-амплификации образуются специфические фрагменты ДНК, которые по своему размеру и структуре полностью соответствуют генам P. pastoris и S. pombe, ограниченных использованными нами праймерами.

При амплификации гена AOXI использовали стандартные праймеры: 5′ AOXl sequencing primer – 5′ GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3′ и 3′ AOXl sequencing primer – 5′ GCAAATGGCATTCTGACATCC 3′. [10].

При амплификации гена rpc 19⁺ Sz. pombe использовали праймеры: прямой (oGVS324) – 5′ CGGGATCCACTTTAGACATGGCGGC 3′ и обращенный (oGVS325) – 5′ GGGAATTCATAACCAAATTTATCCATC 3′ [11].

Пример 4. Получение образцов ДНК для ПЦР-амплификации из клеток Staphilococcus aureus.

Клетки грамположительных бактерий Staphilococcus aureus выращивают в полноценной жидкой (например, L-бульон, мясопептонный бульон) или на агаризованной среде (L-агар, мясопептонный агар) при 37^oC в течение ночи.

Биомассу клеток объемом 10-20 мкл, полученную центрифугированием жидкой суспензии или снятую с чашки стерильной микробиологической петлей, суспендируют в 200 мкл экстракционного буфера 1 (4М гуанидинтиоцианат, 50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 5 мМ ЭДТА, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозина) либо в таком же количестве буфера II (4М гуанидинтиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозила) в 1,5 мл центрифузных пробирках Eppendorf.

Клеточную суспензию кипятят на водяной бане в течение 5 мин.

Клетки осаждают центрифугированием при 12 тысяч об/мин в течение 30-60 сек на центрифуге Eppendorf. Супернатант удаляют.

Клеточный осадок суспендируют в 500-1000 мкл деионизованной (дистиллированной) воды и затем центрифугируют в тех же условиях. Супернатант удаляют.

Проводят повторную промывку клеточного осадка 1000 мкл деионизованной воды.

Клеточный осадок после второй промывки суспендируют в 200 мкл стерильной деионизованной воды. Суспензию клеточных оболочек хранят в замороженном (-20^oC) состоянии.

1-2 мкл клеточной суспензии (т.е. клеточных оболочек с денатурированной ДНК) добавляют к 25-50 мкл смеси для ПЦР, содержащей соответствующий буфер, смеси 4-х dNTPs, праймерные олигонуклеотиды и термостабильную ДНК-полимеразу (например, Taq-полимеразу).

Проводят ПЦР. Режим ПЦР – с учетом размера амплифицируемого фрагмента и структуры праймеров.

Пример 5. Получение образцов ДНК для ПЦР-амплификации из мицеллия грибов- шампиньонов.

Для экспериментов культивируемые грибы-шампиньоны Agaricus bisporus приобретали на рынке. Образующие плодовые тела грибы-шампиньоны являются совершенными грибами и относятся к базидиомицетам. Биомассу (мицелий) берут независимо от ножки (Stipe), шляпки (Pilius) и пластинки (Lamellae).

Биомассу (30-40 мкг мицелия) переносят в 1,5 мл центрифужные пробирки Eppendorf и приливают к ней 200 мкл экстракционного буфера I (4М гуанидинтиоцианат, 50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 5 мМ ЭДТА, 0.1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозина) либо такое же количество буфера II (4М гуанидинтиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозина). С помощью специального пластикового пестика Eppendorf мицелий тщательно растирают в течение 1-2 мин и получают гомогенную суспензию. Полученную суспензию кипятят на водяной бане в течение 5 мин.

Мицелий осаждают центрифугированием при 12 тысяч об/мин в течение 30-60 сек на центрифуге Eppendorf. Супернатант удаляют.

Мицелиальный осадок суспендируют в 1000 мкл деионизованной (дистиллированной) воды и затем центрифугируют в тех же условиях. Супернатант удаляют.

Проводят повторную промывку мицелиального осадка 1000 мкм деионизованной воды.

Мицелиальный осадок после второй промывки суспендируют в 200 мкл стерильной деионизованной воды. Суспензию хранят при -20^oC.

1-2 клеточной суспензии (т.е. мицелиальных оболочек с денатурированной ДНК) добавляют к 25-50 мкл смеси для ПЦР, содержащей соответствующий буфер, смеси 4-х dNTPs, праймерные олигонуклеотиды и термостабильную ДНК-полимеразу (например, Taq-полимеразу).

Проводят ПЦР. Режим ПЦР – с учетом размера амплифицируемого фрагмента и структуры праймеров.

Пример 6. Получение образцов ДНК для ПЦР-амплификации из мицелия несовершенных грибов Acremonium strictum W.Gams.

Мицелий A. stricturn выращивают на чашках с агаризованной средой YPD при 29^oС в течение семи суток. На богатой среде (YPD) спорообразование отсутствует.

Биомассу (мицелий) вместе со слоем агара снимают стерильным скальпелем с площади ~1 см² и переносят в 200 мкл экстракционного буфера I (4М гуанидинтиоцианат, 50мМ трис-HCl, pH 8.0, 5мМ ЭДТА, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозина) либо в такое же количестве буфера II (4М гуанидинтиоцината, 25 мМ цитрат натрия, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозила) в 1,5 мл центрифужных пробирках Eppendorf. Мицелий вместе с остатками агаризованной среды тщательно растирают с помощью пластикового пестика Eppendorf. Супернатант с растворенным агаром выбрасывают, а осадок суспендируют в 200 мкл свежего буфера I или II.

Полученную суспензию кипятят на водяной бане в течение 5 мин.

Клетки осаждают центрифугированием при 12 тысяч об/мин в течение 30-60 сек на центрифуге Eppendorf. Супернатант удаляют.

Осадок мицелия суспендируют в 1000 мкл деионизованной (дистиллированной) воды и затем центрифугируют в тех же условиях. Супернатант удаляют.

Проводят повторную промывку мицелиального осадка 1000 мкмл деионизованной воды.

Мицелиальный садок после второй промывки суспендируют в 200 мкл стерильной деионизованной воды. Суспензию хранят при -20^oC.

1-2 мкл полученной суспензии (т.е. мицелиальных оболочек с денатурированной ДНК) добавляют к 25-50 мкл смеси для ПЦР, содержащей соответствующий буфер, смеси 4-х dNTPs, праймерные олигонуклеотиды и термостабильную ДНК-полимеразу (например, Taq- полимеразу).

Проводят ПЦР. Режим ПЦР – с учетом размера амплифицируемого фрагмента и структуры праймеров.

Таким образом, использование солей-хаотропов позволяет осуществить депротеинизацию и очистку ДНК внутри инертной клеточной оболочки и обойтись без литических ферментов и органических растворителей, без механических дезинтеграторов, стеклянных шариков, жидкого азота и т.д., и в течение 15 мин получить образцы ДНК для ПЦР-амплификации.

Источники информации
1. Marmur. J.A. J. Mol. Biol. 1961. 3: 208-218.

2. Mann W., J.Jeffery. Anal. Biochem. 1989. 178(1): 82-87.

3. Philippsen P., A. Stolz., C.Scherf. Methods in Enzymology. 1991. 194: 169-182.

4. Muller P.M., K.E.Werner, M.Kasai, A.Francesconi, S.J. Chanock, T.J. Walsh. J. Clim. Microbiol. 1998. 36(6): 1625-1629.

5. Hoffman C.S., F.Winston. Gene. 1987. 57(2-3):267-272.

6. Bollet C., M.J.Gevaudan, X. de Lamballerie, C.Zandotti, P. de Micco. Nucl. Acid. Res. 1991.19:1955.

7. Polaina J., A.C.Adam. Nucleic Acid Res. 1991.19(19): 5443.

8. US 5234809, (BOOM; WILLEM, R. (AMSTERDAM; NL); ADRIAANSE; HENRIETTE M. A. (ARNHEM, NL); KIEVITS; TIM (THE HAGUE, NL); LENS; PETER F. (AMSTERDAM, NL)), 10.08.1993, C 12 G 01/68.

10. In: Pichia Expression Kit. A manual of methods for expression of recombinant proteins in Pichia pastoris. Invitrogen Co. 1997. P.29.

11. Шпаковский Г.В., Е.К.Шематорова. Биоорган. Химия. 1998. 24(12): 933- 937.

Формула изобретения

1. Способ выделения геномной ДНК из клеток микроорганизмов, включающий обработку клеток буферным раствором и нагревание реакционной смеси при температуре кипения воды, отличающийся тем, что обработку осуществляют буферным раствором, содержащим соль хаотроп, в качестве которой используют производные гуанидиния в концентрации 4-8М, проводят нагревание реакционной смеси в течение 3-7 мин, затем из реакционной смеси выделяют геномную ДНК, прочно ассоциированную с клеточными оболочками микроорганизмов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что соотношение буферного раствора к объему клеток микроорганизмов превышает 5:1.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выделения геномной ДНК используют грамположительные микроорганизмы, или дрожжи, или грибы.