Патент на изобретение №2177034

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ALCALIGENES DENITRIFICANS-ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛАЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано для получения акриловой и других карбоновых кислот. Штамм выделен методом ступенчатой адаптации из образцов почвы химического производства с использованием в качестве селектирующего агента акрилонитрила. Штамм не требует для роста богатых питательных сред и дополнительных индукторов, способен расти на простой полусинтетической среде, содержащей ацетат в качестве источника углерода и кукурузный экстракт в качестве источника дополнительных факторов роста. По совокупности морфологических, культуральных и биохимических свойств штамм отнесен к роду Alcaligenes виду denitrificans. Штамм Alcaligenes denitrificans С-32 VKV B-2243 D обладает более высокой удельной нитрилазной активностью по отношению к акрилонитрилу 555.6 ммоль/(гч) (30^oС). Максимальная нитрилазная активность клеток штамма 1606.0 ммоль/(гч) отмечается при 65^oС. Ферментативная активность штамма проявляется в широком интервале температур 0-70^oС и значений рН 4-12. 3 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий Alcaligenes denitrificans C-32 VKM B-2243 D – продуцента фермента нитрилазы, катализирующей прямой гидролиз нитрилов карбоновых кислот в соответствующие кислоты.

В литературе описан целый ряд микроорганизмов, обладающих ферментом нитрилаза. Среди них есть представители грибов Fusarium [1], актиномицетов Rhodococcus [2] , Nocardia [3] , грамположительных Corynebacterium [4], Arthrobacter [5] и грамотрицательных бактерий Alcaligenes [6], Klebsiella [7] . Однако большинство описанных нитрилаз способны гидролизовать только ароматические и гетероциклические нитрилы.

Способность к прямому гидролизу алифатических нитрилов с образованием соответствующих им карбоновых кислот описана для штаммов Rhodococcus rhodochrous J-1 [8] , Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 и NCIMB 40833 [9], Rhodococcus rhodocrhous K22 [10], Alcaligenes sp. AK866N [11], Alcaligenes sp. ВКПМ B-6706 [12].

Литературные данные и накопленный опыт показывают – основными характеристиками штаммов, рекомендуемых к использованию в качестве биокатализаторов, являются высокая ферментативная активность и способность давать большой урожай клеток на простых, дешевых средах.

Основные недостатки штаммов Rhodococcus rhodochrous J-1, Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757, Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40833, Rhodococcus rhodochrous K22 и Alcaligenes sp. B-6706 проявляются, прежде всего, в том, что в процессе их культивирования необходимо вводить в среду индукторы – токсичные, легко летучие нитрилы, дополнительные факторы роста – аминокислоты и витамины, либо дорогостоящий пептон. С другой стороны эти штаммы отличаются невысокой удельной нитрилазной активностью. Так штамм Rhodococcus rhodochrous J-1 требует для роста пептон, а для проявления нитрилазной активности – изовалеронитрил или капролактам. Максимальная удельная активность штамма по отношению к акрилонитрилу составляет 212.4 ммоль/гч при температуре реакции 20^oC. Максимальная удельная активность штаммов Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 и Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40833, даже при выращивании на среде, содержащей витамины и ацетонитрил в качестве индуктора, не превышает 82.98 ммоль/гч при температуре реакции 30^oC. Штамм Alcaligenes sp. B-6706 требует внесения в среду культивирования казаминовых кислот и его удельная нитрилазная активность не превышает 234 ммоль/гч при 30^oC.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является штамм Alcaligenes sp. AK866N, клетки которого при культивировании на среде, содержащей пептон, пропионитрил или ацетонитрил, проявляют высокую нитрилазную активность в температурном интервале (0-30^oC). Так, максимальная нитрилазная активность штамма в отношении акрилонитрила при температуре реакции 30^oC составляет 506,0 ммоль/гч. Недостатком данного штамма является, прежде всего, необходимость внесения в среду культивирования дорогостоящего пептона и дополнительных индукторов: пропионитрила и ацетонитрила. Кроме того, низкая термостабильность фермента не позволяет проводить реакцию гидролиза нитрилов при температуре выше 30^oC.

Целью данного изобретения является получение штамма, обладающего высокой нитрилазной активностью в широком интервале температур и не требующего использования индукторов и дорогостоящих компонентов среды в процессе культивирования.

Поставленная цель достигается путем выделения штамма Alcaligenes denitrificans C-32, который не требует использования в процессе культивирования дорогостоящих питательных компонентов, таких как пептон, казаминовые кислоты, дрожжевой экстракт и витамины, и специальных индукторов: высокотоксичных, летучих нитрилов. Штамм Alcaligenes denitrificans C-32 обладает высокой нитрилазной активностью (555.6 ммоль/гч при 30^oC) и термостабильностью фермента.

Заявляемый штамм Alcaligenes denitrificans C-32 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером В-2243 D и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.

Культурально-морфологические признаки. Клетки штамма Alcaligenes denitrificans C-32 в возрасте 20-22 часов имеют палочковидную и овоидную форму; расположены поодиночке, реже попарно, Размер клеток 0.7-0.8х0.9-2.0 мкм. Грамнегативные. Спор и капсул не образуют. Подвижные.

При росте на мясопептонном агаре: колонии округлой формы, 2-3 мм в диаметре, выпуклые, с возрастом растекаются по агару. Колонии блестящие, полупрозрачные в проходящем свете. Край неровный, консистенция пастообразная. На мясопептонном бульоне наблюдается равномерное помутнение всей среды с образованием пристенного кольца на поверхности.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб со строго респираторным типом метаболизма, способный к нитратному дыханию. Нитраты восстанавливает до нитритов. Оптимальная температура роста 30-32^oC. Не растет при 42^oC. Оптимальное значение pH для роста 7.50.5. Каталаза-, оксидаза-положительный. Хемоорганотроф, использует различные органические кислоты и аминокислоты в качестве источника углерода. Растет на синтетических средах, содержащих ацетонитрил, пропионитрил и акрилонитрил в качестве единственного источника углерода и/или азота. Способен гидролизовать нитрилы без образования амида в качестве промежуточного продукта реакции. При росте на средах с органическими солями, нитрилами и амидами дает щелочную реакцию. В O/F тестах на среде с сахарами и многоатомными спиртами кислоту не образует. Крахмал и целлюлозу не гидролизует. Желатиназой не обладает. Не образует пигментов на средах “Кинг А” и “Кинг В”. Дает слабый рост на среде, содержащей 6.5 % NaCI. Индол и сероводород не образует.

Штамм не токсичен и не патогенен для человека.

На основании перечисленных выше свойств в соответствии с определителем бактерий Берджи штамм C-32 отнесен к роду Alcaligenes виду denitrificans.

Для получения клеток с высокой активностью нитрилазы, штамм C-32 культивировали в течение 72 часов при температуре 32^oC на полусинтетических питательных средах.

Ферментативную активность клеток определяли с использованием в качестве субстрата нитрила акриловой кислоты. За единицу удельной нитрилазной активности принимали количество фермента, катализирующего образование 1 ммоль кислоты в единицу времени (1 час), содержащегося в 1 г сухого веса клеток.

Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами.

Пример 1. Выделение штамма Alcaligenes denitrificans C-32 VKM В-2243 D.

Заявляемый штамм был выделен методом ступенчатой адаптации из образцов почвы, взятых на территории производства нитрила акриловой кислоты.

Навеску почвы 1.0 г суспендировали в 10 мл стерильного физиологического раствора и выдерживали в течение 1 ч. После чего 5 мл супернатанта помещали в колбы Эрленмейера объемом 300 мл, заполненные на 1/6 часть средой следующего состава, г: глюкоза 0.5; пептон 1.0; K₂HPO₄ 0.1; MgSO₄ 0.1; акрилонитрил 0.01; дистиллированная вода 1000, pH среды 7.20.2.

Культивирование проводили при 28^oC и круговом перемешивании на качалке (160 об/мин). Ежедневно половину культуральной жидкости отбирали, а оставшуюся часть в колбе доводили до общего объема 50 мл средой аналогичного состава. Концентрация акрилонитрила увеличивали ступенчато от 0.01 до 3.0 г/л. В течение 30-суточной адаптации из среды постепенно удалили глюкозу и пептон. Полученные таким образом изоляты высевали на агаризованную среду вышеуказанного состава. Выросшие колонии дважды рассевали на питательной агаризованной среде для проверки на чистоту, после чего анализировали на способность трансформировать акрилонитрил в акриловую кислоту.

Для этого микроорганизмы подращивали на мясопептонном бульоне в течение суток, полученную суспензию клеток центрифугировали в течение 20 мин при 6000 об/мин. Клетки отмывали в 0.01 М фосфатном буфере, pH 7.50.2, ресуспендировали в 1 мл такого же буфера, содержащего акрилонитрил в концентрации 10.0 г/л, создавая оптическую плотность 1.0 (длина волны 540 нм, толщина слоя 5.07 мм). Трансформацию проводили при температуре 30^oC. Реакцию останавливали через 1 ч внесением в реакционный раствор 6 н. HCl в объеме 0.05 мл. Количественное определение образовавшейся акриловой кислоты осуществляли методом газовой хроматографии.

Пример 2. Выращивание штамма Alcaligenes denitrificans C-32 VKM B-2243 D в лабораторном ферментере.

Клетки штамма Alcaligenes denitrificans C-32 подращивали в колбах Эрленмейера объемом 300 мл, заполненных на 1/6 часть бульоном Хоттингера, в течение суток при круговом перемешивании на качалке (160 об/мин) при температуре 30^oC. Полученную культуральную жидкость использовали для засева лабораторного ферментера.

Ферментацию проводили в 3-литровом лабораторном ферментере, заполненном на 1/2 объема средой следующего состава (г/л):
Na₂HPO₄ 12H₂O – 6,0
KH₂PO₄ – 2,0
MgSO₄7H₂O – 0,7
CH₃COONH₄ – 10,0
NH₄Cl – 2,0
Кукурузный экстракт – 5,0
pH – 7,3
Вода дистиллированная
Культивирование проводили при температуре 32^oC, аэрации 1,5 мин^-1, постоянном перемешивании 560 об/мин.

В процессе ферментации, по мере истощения в среде ростового субстрата, по принципу обратной связи в ферментер вводили раствор уксусной кислоты.

Периодически из ферментера отбирали пробы культуральной жидкости для определения урожая клеток и их нитрилазной активности. Концентрацию клеток определяли фотоколориметрическим методом при длине волны 540 нм, толщине слоя 5.07 мм. Единица оптической плотности соответствовала 0.58 г/л (по сухому весу). Нитрилазную активность клеток оценивали следующим образом. Исследуемую суспензию клеток центрифугировали при 6000 об/мин в течение 5 мин. Осадок отмывали 0.01 М фосфатным буфером, pH 7.5. Клетки ресуспендировали в том же буфере до величины оптической плотности 1.0. По 1 мл клеточной суспензии переносили в герметичные пластиковые пробирки и помещали их в водяную баню с температурой 20^oC. В пробы вносили акрилонитрил до конечной концентрации 20.0 г/л. Трансформацию проводили при постоянном перемешивании в течение 30 мин. Реакцию останавливали внесением в реакционную смесь 6 н. HCl в объеме 0.05 мл. Бактериальные клетки отделяли центрифугированием. Концентрацию акриловой кислоты в надосадочной жидкости определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 255 нм.

Урожай клеток на 72 часа культивирования составил 9.3 г/л (по сухому весу), удельная нитрилазная активность клеток в отношении акрилонитрила достигла 342 ммоль/гч.

Пример 3. Влияние температуры реакции трансформации на нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32.

Зависимость нитрилазной активности клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32 от температуры изучали в процессе гидролиза акрилонитрила в акриловую кислоту. Штамм наращивали и подготавливали к процессу трансформации, как описано в примере 2. Условия трансформации были аналогичны описанным для штамма прототипа.

Образцы реакционной смеси, содержащие 0.3 мг/мл клеток (по сухому весу) в 0.01 М фосфатном буфере, pH 7.5, инкубировали в течение 5 мин при температуре от 0 до 70^oC. Затем в реакционную смесь добавляли нитрил акриловой кислоты до конечной концентрации 20.0 г/л. Реакцию трансформации проводили при перемешивании в течение 20 мин на водяной бане при температурах от 0 до 70^oC. Реакцию останавливали внесением 6 н. HCl в объеме 0.05 мл. Клетки осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 2 мин. В надосадочной жидкости определяли концентрацию образовавшейся акриловой кислоты. Зависимость удельной нитрилазной активности клеток от температуры представлена в табл. 1.

Анализ данных, представленных в табл. 1, показывает, что клетки штамма Alcaligenes denitrificans C-32 обладают более высокой нитрилазной активностью и термозащищенностью фермента (удельная нитрилазная активность при 30^oC – 555.6 ммоль/гч, температурный диапазон проявления ферментативной активности 0-70^oC), по сравнению с клетками штамма-прототипа Alcaligenes sp. AK. 866N (удельная нитрилазная активность при 30^oC – 506.0 ммоль/гч, температурный диапазон проявления ферментативной активности 0-30^oC). Максимальная нитрилазная активность клеток C-32 отмечается при температуре 65^oC (1606 ммоль/гч.

Пример 4. Влияние значений pH реакционной среды на нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32.

Штамм наращивали и подготавливали к процессу трансформации, как описано в примере 2. Образцы реакционных смесей, содержащие 0.58 мг/мл клеток (по сухому весу) в 0.01 М фосфатном буфере, pH 4,0 – 8.0, или в 0.01 М NaOH – глициновом буфере, pH 9.0 – 12.0, инкубировали в течение 5 мин при 20^oC. Затем в реакционные смеси (объемом 1 мл) добавляли акрилонитрил до конечной концентрации 20.0 г/л. Реакцию трансформации проводили при 20^oC в течение 20 мин на водяной бане при перемешивании. Реакцию останавливали внесением 6 н. HCl в объеме 0.05 мл. Клетки осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 2 мин. Концентрацию акриловой кислоты в надосадочной жидкости определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 255 нм. Зависимость удельной нитрилазной активности клеток от значений рН реакционной смеси представлена в табл. 2.

Как видно из данных, представленных в табл. 2, нитрилазная активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32 проявляется в более широком интервале значений pH, интервал pH 4-12, по сравнению с клетками штамма-прототипа, интервал pH 6-10.

Пример 5. Влияние концентрации акрилонитрила на нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32.

Нитрилазную активность клеток оценивали как в примере 3, с тем отличием, что концентрация клеток в реакционных образцах составляла 0.23 мг/мл, а начальная концентрация акрилонитрила соответствовала значениям, представленным в табл. 3. Температура реакции 30^oC.

Как видно из данных, представленных в табл.3, нитрилазная активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32 практически не зависит от начальной концентрации нитрила акриловой кислоты в реакционной смеси вплоть до предела растворимости субстрата.

Таким образом, заявляемый бактериальный штамм Alcaligenes denitrificans C-32 VKM В-2243 D обладает конститутивной нитрилазой, осуществляющей прямой гидролиз акрилонитрила в акриловую кислоту в широком интервале температур 0-70^oC и pH среды 4 – 12. Высокая нитрилазная активность клеток достигается при росте штамма на среде, не содержащей дорогостоящих компонентов и дополнительных индукторов. Удельная нитрилазная активность штамма в отношении акрилонитрила составляет при 30^oC 555.6 ммоль/гч. Максимальная нитрилазная активность клеток штамма 1606.0 ммоль/гч проявляется при 65^oC.

Штамм Alcaligenes denitrificans C-32 VKM B-2243 D может быть рекомендован как продуцент фермента нитрилазы и использован в биотехнологических процессах получения карбоновых кислот.

Источники информации

4. Fukuda Y. , Fukui M., Harada Т., Izumi Y. Formation of -aminoacid from

8. Nagasawa Т. , Nakamura Т., Yamada H.

9. Pat. 5998180 USA, Int. C1⁶ C 12 P 007/60, C 12 N 009/78, C 12 N 004/20. Nitrilase from Rhodococcus rhodochrous for converting acrylonitrile directly to acrylic acid / Armitage Y.Ch., Hughes J., Webster N.A. – 18 p.

11. Appl. 1-132392 JP, Int. C1⁴ C 12 P 7/40, C 12 R1:05.Microbiologocal production of monocarboxylic acid / Kawakami K., Tanabe Т., Inoue Sh.- 16 p.

12. Пат. 2081169 C 1 RU, МКИ⁶ C 12 N 9/78, C 12 P 7/40, 13/02, C 12 R1: 05. Штамм бактерий Alcaligenes species – продуцент нитрилазы / Забазная Е.В. , Козулин С.В., Куликова Л.К., Воронин С.П.-10 с.

Формула изобретения

Штамм бактерий Alcaligenes denitrificans VKM B-2243 D – продуцент нитрилазы.

РИСУНКИ

QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): ЗАО “БИОАМИД”

Вид лицензии*: НИЛ

Лицензиат(ы): ООО “Дегусса Евразия”

Договор № РД0004060 зарегистрирован 16.11.2005

Извещение опубликовано: 20.01.2006 БИ: 02/2006

* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия

QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Общество с ограниченной ответственностью “Ашленд Евразия”

Вид лицензии*: НИЛ

Лицензиат(ы): Закрытое акционерное общество “Москва-Штокхаузен-Пермь”

Договор № РД0014740 зарегистрирован 30.11.2006

Извещение опубликовано: 10.01.2007 БИ: 01/2007

* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия

QZ4A – Регистрация изменений (дополнений) лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Закрытое акционерное общество “БИОАМИД”

Вид лицензии*: НИЛ

Лицензиат(ы): Общество с ограниченной ответственностью “Ашленд Евразия”

Характер внесенных изменений (дополнений):

Наименование Лицензиата изменено на Общество с ограниченной ответственностью “Ашленд Евразия”.

Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения:

16.11.2005 № РД0004060

Извещение опубликовано: 27.05.2007 БИ: 15/2007

* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия

QZ4A – Регистрация изменений (дополнений) лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Закрытое акционерное общество “БИОАМИД”

Вид лицензии*: НИЛ

Лицензиат(ы): Общество с ограниченной ответственностью “Ашленд Евразия”

Характер внесенных изменений (дополнений):

Изменен адрес Лицензиара на: 410033, г. Саратов, ул. Международная, 27

Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения:

12.04.2007 № РД0020644

Извещение опубликовано: 10.03.2008 БИ: 07/2008

* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия

RH4A – Выдача дубликата патента Российской Федерации на изобретение

Дата выдачи дубликата: 10.06.2010

Наименование лица, которому выдан дубликат:

Закрытое акционерное общество “Биоамид” (RU)

Извещение опубликовано: 27.07.2010 БИ: 21/2010