Патент на изобретение №2176795

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ИММУННОЙ СИСТЕМЫ У ПАЦИЕНТОВ С ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМОЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии, и может применяться для исследования иммунной системы. Способ позволяет повысить достоверность определения функционального состояния иммунокомпетентных клеток как в периферической крови, так и в организме в целом. У пациентов с термической травмой осуществляют забор крови из периферической вены. Из крови получают сыворотку, определяют в ней содержание растворимой формы Fas-рецептора и при повышении уровня Fas-рецептора в 1,5 раза и более по сравнению с нормой судят об активации клеточного звена иммунной системы.

Изобретение относится к медицине, в частности к способам исследования иммунной системы, и может быть использовано для определения функционального состояния клеточного звена иммунной системы у пациентов с термической травмой.

Известен способ определения функционального состояния клеточного звена иммунной системы у пациентов с термической травмой, заключающийся в исследовании периферической крови и определении низкомолекулярной фрагментации ДНК иммунокомпетентных клеток (см. Teodorczyk-Injeyan JA, Cembrzynska-Nowak М, Lalani S at al. Immune deficiency following thermal trauma is associated with apoptotic cell death. – J Clin Immunol 1995. – 15.- 6.- P. 318-28).

Однако при этом способе в процессе выделения ДНК требуются дорогие реактивы, обладающие токсическими свойствами. Кроме того, требуется персонал, обладающий навыками проведения иммунологических и иммунохимических анализов.

В качестве прототипа нами выбран способ определения функционального состояния клеточного звена иммунной системы, заключающийся в заборе крови из периферической вены, выделении иммунокомпетентных клеток и определении на их поверхности Fas-рецептора, опосредующего апоптоз (см. Барышников А.Ю., Тоневицкин А. Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике – М., 1997, стр. 158-160).

Однако при этом способе в процессе выделения клеток теряется часть Fas-рецепторов с поверхности клеток, что приводит к снижению достоверности результатов. Кроме того, функциональное состояние клеток периферической крови не всегда сопоставимо с функциональным состоянием иммунной системы в целом.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение достоверности определения функционального состояния иммунокомпетентных клеток как в периферической крови, так и в организме в целом.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе, включающем забор крови из периферической вены, из крови получают сыворотку, определяют в ней содержание растворимой формы Fas-рецептора и при повышении его уровня в 1,5 раза и более в сравнении с нормой судят об активации клеточного звена иммунной системы.

Способ определения функционального состояния клеточного звена иммунной системы у пациентов с термической травмой осуществляют следующим образом: забирают кровь из периферической вены (5-6 мл) в сухие пробирки. Для образования сгустка образцы крови последовательно выдерживают по 30^oС в термостате при температуре +37^oC и в холодильнике при температуре +4^oC. После этого свернувшуюся кровь центрифугируют при 200 g 15 мин. Сыворотку отбирают в сухие, чистые пробирки. Полученную сыворотку хранят в холодильнике при температуре -60^oС до 5 месяцев. Очищенные с помощью сульфата аммония и ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе козьи поликлональные антитела против поверхностных антигенов мононуклеарных клеток сорбируют в лунки планшетов для иммуноферментного анализа в течение 16-18 ч при 4 – 8^oC. После отмывания не связавшихся антител в лунки наносят образцы исследуемых сывороток с последующей инкубацией планшетов в течение 1 ч при комнатной температуре и отмывкой не связавшихся белков. Затем лунки планшетов в тех же условиях последовательно обрабатывают рабочим раствором очищенных моноклональных антител ИКО-160 (против Fas-рецептора) и козьими антителами против иммуноглобулинов мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена. Для каждой тестируемой сыворотки ставят отрицательный контроль, где вместо моноклональных антител лунки планшетов обрабатывают раствором поликлональных мышиных иммуноглобулинов в той же концентрации, что и моноклональные антитела. В качестве положительного контроля используют сыворотку крови больных системной красной волчанкой. Для определения нормального уровня содержания растворимой формы Fas-рецептора в сыворотке крови исследуют образцы сывороток здоровых доноров. При повышении уровня растворимой формы Fas-рецептора по сравнению с нормой в 1,5 раза и более судят об активации клеточного звена иммунной системы.

Примеры применения:
При исследовании уровня растворимой формы Fas-рецептора в сыворотке крови 25 здоровых доноров показано, что ее содержание в норме было 53431,8 условных единиц (у. е. ). При обследовании пациента Б. с диагнозом: ожог пламенем 30% п.т., ожог верхних дыхательных путей, крайне тяжелый ожоговый шок (возраст 33 года, N ист. болезни 185720, травма от 14.03.99 года), уровень растворимой формы Fas-рецептора в сыворотке крови составил:
18.03.99 – 243 у.е. При одновременном исследовании содержание клеток с активационным фенотипом – CD25⁺клетки – 6% (N – 16%), CD71⁺клетки – 6% (N – 11%), CD26⁺клетки-12% (N – 15%). Число CD95⁺клеток – 2% (N – 15%).

6.04.99 – 750 у.е. При одновременном исследовании содержание клеток с активационным фенотипом CD25⁺клетки – 24%, CD71⁺клетки – 25%, CD26⁺клетки – 12%. Число CD95⁺клеток – 2%.

Из приведенного примера видно, что при первом исследовании состояния клеточного звена иммунной системы выявлено состояние иммуносупрессии, которое сопровождается низким содержанием растворимой формы Fas-рецептора в сыворотке крови. Повышение уровня растворимой формы Fas-рецептора в сыворотке крови, которое обнаружено при повторном исследовании, идет вместе с признаками активации клеточного иммунитета. Количество клеток, которые несут на своей поверхности Fas-рецептор, и в том и в другом случае остается неизменным.

Способ изучения функционального состояния клеточного звена иммунной системы у пациентов с термической травмой позволяет с высокой достоверностью судить о процессе активации иммунокомпетентных клеток. Растворимая форма Fas-рецептора попадает в сыворотку крови вне зависимости от места ее образования, поэтому можно судить об этом как на уровне периферической крови, так и на уровне организма в целом. Способ информативен и выполним в условиях научного медицинского учреждения и может использоваться в исследовательской и лечебной практике.

Формула изобретения

Способ определения функционального состояния клеточного звена иммунной системы у пациентов с термической травмой путем забора крови из периферической вены, отличающийся тем, что из крови получают сыворотку, определяют в ней содержание растворимой формы Fas-рецептора и при повышении уровня Fas-рецептора в 1,5 раза и более по сравнению с нормой судят об активации клеточного звена иммунной системы.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 10.10.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 16-2004

Извещение опубликовано: 10.06.2004