Патент на изобретение №2176445
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ АКТИВАЦИИ СИМБИОЗА РАСТЕНИЙ С ЭНДОМИКОРИЗНЫМ ГРИБОМ
(57) Реферат: Изобретение относится к микологии и физиологии растений, а именно к эндомикоризным грибам, образующим микоризу везикулярно-арбускулярного типа с растением. Предложен способ активации симбиоза растений с эндомикоризным грибом путем воздействия регулятором роста на биологические процессы растений, образующих симбиоз с эндомикоризными грибами арбускулярного типа. В качестве регулятора роста использует раствор гидроптерина при концентрации 10-7-10-6 г/л. Применение гидроптерина для активации симбиоза растений с эндомикоризным грибом позволяет усилить интенсификацию микосимбиотрофизма растений, увеличить длину и вес наземной части и корня растений, повысить содержание хлорофилла в листьях. 6 табл. Изобретение относится к микологии и физиологии растений, а именно к эндомикоризным грибам, образующим микоризу везикулярно-арбускулярного типа с растением. Известный способ предусматривает активацию симбиоза только за счет инокуляции. Известен способ стимуляции эндомикоризных грибов, образующих микоризу везикулярно-арбускулярного типа с растением, см. патент США N 5002603, A 01 H 17/00, 1991. Известен регулятор роста  -индолил-уксусная кислота (ИУК)-природный ауксин, см. Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Дегтярев С.В., Кочиева Е.3., Прокофьев М.И., Новиков Н.Н., Ковалев В.М. Калашников Д.В. Сельскохозяйственная биотехнология. М.: Высш. шк. 1998. С. 416.
Физиологический эффект при использовании этого регулятора проявляется в регуляции растяжения, деления и дифференцировки на клеточном уровне.
В качестве регулятора роста использован фузикокцин – биосинтетический регулятор роста терпеноидной природы.
Данный способ принят за прототип настоящего изобретения.
Однако он обладает рядом недостатков.
Фузикокцин – прототип получен биотехнологическим способом из культуральной жидкости и биомассы гриба. При использовании фузикокцина содержание структур микоризации (F, М, B, A) довольно высокие, особенно на сульфидсодержащих почвах, но широкое применение неэкономично из-за слишком большой стоимости (1 мг до 50$).
В основу настоящего изобретения положено решение задачи получения эффективного и экономичного регулятора, обеспечивающего увеличение продуктивности, улучшение фотосинтеза, повышение сахаров в корнях и усиление интенсификации микосимбиотрофизма растений.
Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что способ активации симбиоза растений с эндомикоризным грибом осуществляют путем воздействия регулятором роста на биохимические процессы растений, образующих симбиоз с эндомикоризными грибами арбускулярного типа, в качестве регулятора роста берут раствор гидроптерина при концентрации 10-7 – 10-6 г/л.
Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию “новизна”.
За счет реализации отличительных признаков изобретения (в совокупности с признаками, указанными в ограничительной части формулы) достигаются важные новые свойства объекта. В предложенном техническом решении проводят обработку посадочного материла (семян, черенков) перед внесением в инокулированную грибом почву раствором гидроптерина при концентрации 10-7-10-6 г/л, что обуславливает интенсификацию микосимбиотрофизма растений, увеличение продуктивности, повышение сахаров в корнях, улучшение фотосинтеза.
Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию “изобретательский уровень”.
Сущность изобретения поясняется примером получения гидроптерина. Гидроптерин экологически безопасен для человека и биосферы. Острая токсичность гидроптерина исследована в опытах на белых мышах и белых крысах. После подкожного введения мышам гидроптерина в дозе 2 г/кг никаких симптомов интоксикации не наблюдалось. У белых крыс после введения им через зонд в желудок взвеси или подкисленного теплого водного раствора гидроптерина в дозе 0.5 г/кг никаких проявлений интоксикации не обнаружено, даже в течение трехнедельного введения с суммарной дозой 1400 мг. Исследование влияния гидроптерина в динамике на функциональное состояние различных физиологических систем (сердечно-сосудистая, нервная система) и органов (селезенка, сердце, легкие, почки, мозг, печень) животных с регистрацией массы тела, записью электрокардиограммы, анализом мочи, крови, определением активности ферментов холинэстеразы, аланин- и аспартатамино-трансферазы не выявило статистически значимой разности между крысами и мышами, получавшими гидроптерин, и животными контрольной группы. Таким образом, гидроптерин может быть отнесен к V классу практически нетоксичных веществ.
Изобретение включает оригинальную технологию получения гидроптерина, которая описывается следующей химической схемой:  Пример 1 (синтез) I стадия – 5-бромурацил: – урацил 504 г (4.5 моль) и 1800 мл воды загружают в трехгорлую колбу объемом 4 л, снабженную обратным холодильником, термометром, эффективной мешалкой и капельной воронкой; – смесь нагревают до 40oC на водяной бане и при интенсивном перемешивании прикапывают 232 мл (4.5 моль) жидкого брома в течение 45 мин, при этом наблюдается небольшой тепловой эффект, подъем температуры до 55-60oC и почти полное растворение исходного урацила; – смесь перемешивают при температуре 80-85oC в течение 1.5 часа, при этом происходит полное обесцвечивание массы и выпадает обильный осадок продукта; – реакционную массу охлаждают сначала до комнатной температуры, затем выдерживают в ледяной воде в течение 2 часов и в холодном состоянии отфильтровывают белый кристаллический осадок; – осадок отжимают от маточного раствора и промывают водой до отрицательной реакции на ион брома и отсутствия примесей 5,5-дибром-6-окси-5,6-дигидроурацила; – осадок отжимают и сушат в сушильном шкафу при температуре 70-75oC до постоянного веса; – получают 816,7 г (95%) 5-бромурацила в виде бесцветных кристаллов с т. пл. 303-305oC с разл.; хроматографически однороден – Rf=0.45 в системе метанол-хлороформ – 1: 4, силуфол УФ 254. Вычислено для C5H3BrN2O2 (М. м. 191.05),%: Br – 41.83, N – 14.66. Найдено, %: Br – 41.67, N – 14.59; – ПМР-спектр, ДМСО-d6,  м.д.: 7.75 (C6-H, д, 1H); 11.15 (NH, д, 1H), 11.50 (NH, с, 1H); УФ-спектр: 0.1 н HCl – макс275 нм (lg  3.88); 0.1 н NaOH макс290 нм (lg 3.86).
II стадия – 2-оксо-(3H)-5,6,7,8-тетрагидроптеридин (гидроптерин)– 1410 мл 70% водного раствора этилендиамина (d=0.975) загружают в трехгорлую колбу объемом 4 л, снабженную обратным холодильником, термометром, эффективной мешалкой; – смесь нагревают до 70-75oC на водяной бане и прибавляют небольшими порциями 860 г (4.5 моль) 5-бромурацила в течение 1 часа. При этом температура реакционной массы не должна превышать 85oC; – наблюдается растворение исходного 5-бромурацила. а затем происходит кристаллизация продукта реакции; – смесь перемешивают при 80-85oC в течение 1.5 часов до исчезновения на хроматограмме исходного урацила; – реакционную массу охлаждают до 50-60oC и приливают при перемешивании 1.5 л метилового спирта; – смесь нагревают при 70-75oC и перемешивают в течение 1 часа; – смесь охлаждают ледяной водой в течение 3 часов и осадок отфильтровывают; – осадок хорошо отжимают от раствора, промывают 450 мл 70% метанола, маточный раствор отделяют для регенерации метанола и этилендиамина, отжимают от растворителя и сушат до постоянного веса; – получают 651 г (85%) 2-оксо-(3H)-5,6,7,8-тетрагидроптеридина моногидрата (гидроптерина) в виде сетло-желтых кристаллов с т. пл. 200-205oC с разл. ; хроматографически однороден Rf=0.8 в системе 5% NH4Cl, силуфол УФ – 254. Вычислено для C6H10N4O2 (М. м. 170.18), %: C – 42.31, H – 5.87, N – 32.94. Найдено, %: C – 42.26, H – 5.81, N – 32.89. Препарат стандартизирован по физико-химическим показателям: – ПМР-спектр, ДМСО-d6, , м. д.: 6.45 (C4-H, с, 1H); 2.80 (CH2CH2, с, 4H); УФ-спектр: вода- макс1= 233 нм (lg = 4.01), макс2= 300 нм (lg 3.77), 0.1 н HCl – макс299 нм (lg 3.60); 0.1 н NaOH макс292 нv (lg 3.55); ИК-спектр (KBr):  C=01645 см-1, кольца1600 см-1.Гидроптерин растворяется в разбавленных щелочах, минеральных кислотах с образованием солей, не растворим в хлороформе, бензоле, эфире. Растворимость в кипящем спирте 1 г/50 мл, в кипящей воде – 1 г/30 мл (хорошо кристаллизуется). Процесс получения 5-бромурацила может быть совмещен со стадией его конденсации с этилендиамином, то есть технологический процесс получения гидроптерина из урацила упрощается и проводится в одном реакторе. Затраты на производство гидроптерина невелики и стоимость продукта определяется лишь ценой недорогого исходного сырья (урацила, брома, этилендиамина). Данная технология пригодна для реализации в промышленном масштабе с использованием стандартного оборудования и отечественного сырья. Способ получения гидроптерина высокопроизводителен, экономичен и стоимость целевого продукта значительно ниже по сравнению с импортными препаратами аналогичного действия. Пример 2 В обработанные спиртом сосуды емкостью 5 кг помещают стерильный субстрат (песчано-глинистая смесь в пропорции 3:1). Вносят 50 г инокуляционного материала (на основе гриба Glomus fasciculatum и Glomus mosseae), высевают семена сорго и выращивают 2.5 месяца, поддерживая постоянный уровень влажности (60% от полной влагоемкости). Поливают 1 раз в неделю по 10 мл на сосуд следующими питательными растворами: Раствор 1: (NH4)2SO4 – 0.12; H2O – 1000 мл; Раствор 2: Ca(NO3)2 2H2O – 4; H2O- 1000 мл; Раствор 3: K2SO4 – 3.5; MgSO4 7H2O – 4.9; CaSO4 2H2O – 29; Раствор 4: CuSO4  5H2O – 0.04; ZnSO4 2H2O – 0.11; FeSO4 – 40; MnCl2O – 0.09; CoSO4 6H2O – 26; H3BO3 – 1.3; NaMoO4 3H2O – 0.0135; H2O – 5000 мл;Раствор 5: Ca(H2PO4)2H2O; H2O – 1000 мл. Наземную часть срезают, а субстратно-корневая смесь является инокляционным материалом, содержащим инфекционные зачатки эндомикоризного гриба. Такой иноколюм сохраняет микоризоинфицирующую способность в течение 6 месяцев при комнатной температуре при хранении в темном месте. Примечание: Микоризообразующие грибы класса Zygomycetes: Glomus mosseae и Glomus fasciculatum предоставлены лабораторией почвенной микологии Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии. Пример 3 Готовят субстрат: почву (дерново-подзолистая, легкосуглинистая) и песок берут в равном соотношении. Вносят субстрат в сосуды объемом 500 мл. Помещают в сосуд на глубину 7-8 см эндомикоризный иноколюм на основе гриба Glomus mosseae. Готовят водный раствор гидроптерина концентрации 10-6 г/л. Берут семена овса экспериментального сорта “Теремок” (Кировская обл.) и замачивают в водном растворе гидроптерина на 1 час. Высаживают семена овса на глубину 2 см и выращивают в сосудах при поддержании постоянной влажности, равной 60% от полной влагоемкости. Поливают семена овса 1 раз в неделю в течение 4-6 недель питательным раствором Прянишникова следующего состава: NH4О3 – 0.084; CaHPO4 2H2O – 0.07; MgSO4 (безводный) – 0.06; KCl – 0.1; FeCl3 – 0.025; CaSO3 2H2O – 0.344.
Определяют влияние гидроптерина на продуктивность овса:наземная часть – длина 150 мм, вес 19 г; корень – длина 145 мм, вес 40.4 г. Определяют влияние гидроптерина на фотосинтез и сахара в корнях: хлорофилл: A – 8.84 мг/л; B – 7.43 мг/л; сахара – 0.05 мг/л. Определяют влияние гидроптерина на развитие эндомикоризного гриба в корне: F – 98%; М – 95%; В – 39.8%; A – 7.1%. Результаты опыта представлены в таблицах 1, 2 и 3. Из таблицы 1 видно, что гидроптерин положительно влияет на продуктивность овса: – увеличивается на 26% вес при постоянной длине (в варианте без инокуляции) – контроль 1; – увеличивается на 21% вес наземной части и на 19% длина корня (в варианте с инокуляцией) – контроль 2 по сравнению с контролем 1. Наиболее эффективная концентрация гидроптерина 10-7-10-6 г/л. Из таблицы 2 видно, что гидроптерин увеличивает хлорофилл A на 13-9%, а хлорофилл В на 21-13% по сравнению с контролем 1. Наиболее эффективная концентрация гидроптерина 10-7-10-6 г/л. Из таблицы 3 видно, что гидроптерин значительно повлиял на микоризацию корней, если при концентрации гидроптерина 10-4 г/л содержание микоризных структур снизилось от 15 до 67%, тогда как при концентрации 10-7-10-6 г/л частота встречаемости микоризной инфекции (F) увеличилась на 660-344% по сравнению с контролем 2. Наиболее эффективная концентрация гидроптерина 10-7-10-6 г/л. Пример 4 Готовят субстрат: почву (дерново-подзолистая, легкосуглинистая) и песок берут в равном соотношении. Вносят субстрат в сосуды объемом 500 мл. Помещают в сосуд на глубину 7-8 см эндомикоризный инокулюм на основе гриба Glomus fasciculatum. Готовят водный раствор гидроптерина концентрации 10-6 г/л. Берут черенки комнатного растения плектрантус (Plectrantus austrelis) и проращивают в воде до образования двух междоузлий и корней. Погружают черенки в водный раствор гидроптерина и выдерживают в течение 1 часа. Поливают плектрантус 1 раз в неделю в течение 4-6 недель питательным растовром Прянишникова следующего состава: NH4NO3 – 0.084; CaHPO4 2H2O – 0.07; MgSO4 (безводный) – 0.06; KCl – 0.1; FeCl3 – 0.025; CaSO4 2H2O – 0.344.
Определяют влияние гидроптерина на продуктивность плектрантуса:наземная часть – длина 191 мм; вес 42.9 г; корень – длина 81 мм; вес 5.9 г. Определяют влияние гидроптерина на развитие эндомикоризного гриба в корне: F – 70.1%; М – 93.7%; B – 7.7%; A – 14.6%. Результаты опыта представлены в таблицах 4 и 5. Из таблицы 4 видно, что гидроптерин увеличил длину и вес наземной части на 24-26% (в варианте без инокуляции) по сравнению с контролем 1 и повысил вес на 43-22% наземной части, длину на 55-36% и вес корня на 23-13% (в варианте с инокуляцией) – контроль 2. Наиболее эффективная концентрация гидроптерина 10-6-10-7 г/л. Из таблицы 5 видно, что гидроптерин увеличивает развитие эндомикоризного гриба в корнях растений, содержание микоризных структур возрастает на 81% по сравнению с контролем 2. Проведено сравнение использования гидроптерина с известными регуляторами роста. Влияние -индолил-уксусной кислоты (-ИУК), лентехнина, моноэтаноламмониевой соли барбитуровой кислоты (МЭАБ), фузикокцина (ФК) и гидроптерина на развитие микоризных грибов в корнях овса, плектрантуса, бархатцев и люцерны представлены в таблице 6.
Из таблицы 6 видно, что наиболее эффективным регулятором роста является гидроптерин.
Гидроптерин увеличивает содержание основных структур микоризного гриба в корнях растений на 20% F, на 70% М, на 6% B по сравнению с фузикокцином на субстрате в приведенных примерах.
Предложенный способ активации симбиоза растений с эндомикоризным грибом путем обработки семян, черенков растений раствором гидроптерина, являющимся высокоэффективным, технологичным и экономичным регулятором роста, апробирован и подтверждается результатами опытов для различных растений, что обуславливает, по мнению заявителей, его соответствие критерию “промышленная применимость”.
Использование гидроптерина для активации симбиоза растений с эндомикоризным грибом позволяет:– усилить интенсификацию микосимбиотрофизма растений; – увеличить продуктивность (длину, вес наземной части и корня); – улучшить фотосинтез (хлорофилл в листьях); – увеличить накопление сахаров в корнях. Формула изобретения
РИСУНКИ
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 25.05.2002
Номер и год публикации бюллетеня: 32-2003
Извещение опубликовано: 20.11.2003
|
||||||||||||||||||||||||||
