Патент на изобретение №2175558

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕГО САЛЬМОНЕЛЛЕЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при производстве сальмонеллезных диагностических и профилактических препаратов. Способ заключается в том, что инактивацию сальмонелл осуществляют формалином, очищают хлороформом, центрифугируют и конъюгируют с изотиоционатом флуоресцина. Затем отмывают от непрореагировавшего красителя путем многократного центрифугирования, стандартизуют и лиофилизируют. Техническим результатом является повышение чистоты и специфичности получаемого препарата. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно иммунологии, и может быть использовано при производстве сальмонеллезных диагностических и профилактических препаратов.

В прикладной иммунологии, практической и научной бактериологической работе одним из наиболее распространенных тестов является реакция агглютинации (РА).

Известно получение сальмонеллезных жидких инактивированных (нагреванием, ацетоном, спиртом или формалином) корпускулярных антигенов, очищенных от среды культивирования центрифугированием с последующей стандартизацией [1].

Наиболее близким к заявляемому способу является способ, заключающийся в культивировании сальмонелл на мясопептонном агаре, получении взвеси микробов в 0,9% растворе натрия хлорида после смыва с питательной среды, инактивации их формалином (группы A, B, C, D, E) или спиртом (брюшнотифозные бактерии), центрифугировании инактивированной взвеси после осаждения сальмонелл, стандартизации по оптическому стандарту и изучении специфических свойств в РА [2] . При соответствии результатов исследования регламентированным требованиям взвеси сальмонелл разливали в ампулы и герметизировали.

Однако полученные по способу-прототипу сальмонеллы содержат антигенные структуры, обуславливающие ложноположительные результаты в РА с возбудителями кишечной группы.

Кроме того, для получения диагностикума по способу-прототипу требуются значительные затраты питательных сред и биомассы сальмонелл.

Исходя из этих негативных явлений был предложен экономичный способ получения сальмонеллезного диагностикума, повышающий качество препарата, сокращающий затраты.

Изобретение направлено на решение задачи – получение комплексного сальмонеллезного диагностикума за счет повышения чистоты и специфичности препарата, обусловленных способом очистки. (Таблица 1).

Решение данной задачи заключается в дополнительной обработке взвесей сальмонелл хлороформом, конъюгацией их с флуоресцентным красителем – изотиоцианатом флуоресцеина.

Существенные признаки заявляемого способа:
ограничительные – инактивация сальмонелл, центрифугирование, стандартизация;
отличительные – инактивация сальмонелл всех групп формалином, обработка хлороформом с последующей конъюгацией с флуоресцентным красителем – изотиоцианатом флуоресцеина, многократное центрифугирование до полного отсутствия красителя в надосадочной жидкости.

Способ осуществляется следующим образом: Культуры сальмонелл серогрупп A, B, C, D, E, выращенные на МПА, смывают (каждую в отдельности) 0,9% раствором натрия хлорида, стандартизируют и соединяют в комплексную взвесь. Взвесь сальмонелл A, B, C, D, E инактивируют формалином. После этого из взвеси сальмонелл путем низкоскоростного центрифугирования осаждают агаровые частицы. Надосадочную жидкость, содержащую сальмонеллы, декантируют и подвергают высокоскоростному центрифугированию для осаждения сальмонелл. Полученный осадок ресуспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида и обрабатывают хлороформом для удаления денатурированных белков, а также липидов. Очищенную взвесь сальмонелл центрифугируют, а осадок ресуспендируют и коньюгируют с изотиоцианатом флуоресцеина. По истечении времени конъюгации меченые сальмонеллы отмывают от непрореагировавшего-красителя, стандартизируют и оценивают в иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации (ИФРМА). При получении результатов, соответствующих регламентированным данным, меченые сальмонеллы лиофилизируют. Для проведения исследований с приготовленным диагностикумом на 1000 проб сывороток потребуется 1 мл культуры сальмонелл с концентрацией 2010⁹ в 1 мл микробной взвеси.

ПРИМЕР 1. Получение целевого продукта по заявляемому способу.

С 1,5 мл скошенного МПА получали 1,0 мл взвесь сальмонелл группы А с концентрацией 20 млрд. в 1 мл микробной взвеси (табл. 1). Полученную взвесь доводили до концентрации 510⁹ сальмонелл в 1 мл микробной взвеси. Приготовленные аналогичным образом взвеси сальмонелл групп B, C, D, E объединяли по 1 мл и получали комплексную взвесь. В 8 мл взвеси сальмонелл групп A, B, C, D, E добавляли 0,04 мл формалина и выдерживали в течение 7 суток при температуре +4-10^oC. Из инактивированной взвеси осаждали крупные агаровые частицы путем центрифугирования при 1500 об/мин, в течение 10 мин. Надосадочную жидкость, содержащую сальмонеллы, декантировали и центрифугировали при 10000 об/мин, в течение 30 мин с целью осаждения сальмонелл. Полученный осадок ресуспендировали в 8,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида. К полученной взвеси добавляли хлороформ до конечной концентрации 0,5%. Смесь встряхивали в течение 5 мин и центрифугировали при 1500 об/мин, в течение 10 мин для осаждения хлороформа и денатурированных белков. Надосадочную жидкость декантировали и центрифугировали при 10000 об/мин, в течение 30 мин. Осадок сальмонелл ресуспендировали в 8,0 мл забуферного физиологического раствора. В сальмонеллезную взвесь добавляли изотиоцианат флуоресцеина из расчета 2,5 мг на 110⁹ микробов. Конъюгацию красителя с сальмонеллами проводили в течение 16 часов при постоянном перемешивании при температуре +4-10^oC. После этого взвесь центрифугировали при 10000 об/мин, в течение 30 мин. Образовавшийся осадок ресуспендировали в 8,0 мл забуферного физиологического раствора. Процедуру отмывания путем центрифугирования повторяли до полного отсутствия красителя в надосадочной жидкости. Осадок очищенных меченых сальмонелл ресуспендировали в дистиллированной воде до концентрации 510⁹ сальмонелл в 1 мл микробной взвеси и исследовали в ИФРМА на специфическую активность. (Таблица 2).

Как следует из данных, представленных в таблице, серии диагностикумов, полученные по заявленному способу, взаимодействуют со специфическими антителами сывороток крови людей, больных сальмонеллезом, моноспецифическими диагностическими сальмонеллезными сыворотками и не реагируют с гетерологичными и близкородственными антителами диагностических сывороток.

На постановку ИФРМА для скрининга 1000 сывороток потребуется 5 мл флуоресцирующего сальмонеллезного диагностикума с концентрацией 510⁹ в 1 мл микробной взвеси.

Таким образом, меченый антиген сальмонелл, полученный по заявленному способу пригоден для применения в качестве диагностикума сальмонеллезного комплексного флуоресцирующего для ИФРМА.

ПРИМЕР 2. Получение целевого продукта по способу-прототипу.

Культуру сальмонелл группы A, выращенную на 45 мл мясопептонного агара, смывали 0,9% раствором натрия хлорида, стандартизировали до концентрации 2010⁹ сальмонелл в 1 мл. Получали 30 мл взвеси культуры сальмонелл группы A. Приготовленную взвесь инактивировали путем добавления формалина до конечной концентрации 0,5% и выдерживали 7 суток. Затем инактивированную взвесь центрифугировали при 1500 об/мин, в течение 10 мин, отделяли надосадочную жидкость и подвергали ее центрифугированию при 3000 об/мин, в течение 30 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 250 мл 0,9% раствора натрия хлорида, стандартизировали до 210⁹ сальмонелл в 1 мл микробной взвеси и исследовали в РА. (Таблица 2).

При соответствии результатов регламентированным данным препарат разливали в ампулы по 10 мл и герметизировали.

Аналогичным образом готовили другие сальмонеллезные диагностикумы серогрупп B, C, D, E. Получали по 250 мл диагностикумов групп B, C, D, E с концентрацией 210⁹ в 1 мл микробной взвеси.

Как следует из данных таблицы 2, препарат взаимодействовал с сальмонеллезными сыворотками группы A и диагностической сывороткой группы A. Кроме этого, были отмечены ложно-положительные результаты с сыворотками к кишечной группе.

Использованные источники
1. Медуницин Н.В. Брюшнотифозные вакцины. Вакцинология. – М.: Триада – X. – 1999. – С. 172-173.

2. Петросян E.А., Коссова А.К., Ефимова А.А. Разработка метода получения очищенных антигенов в производственных условиях. Поливакцины. – Москва, – 1956. – Т. 8. – С. 245-276.

Формула изобретения

1. Способ получения сальмонеллезного диагностикума путем инактивации сальмонелл, их стандартизации и центрифугирования, отличающийся тем, что инактивацию сальмонелл всех групп осуществляют формалином, взвесь сальмонелл очищают хлороформом, очищенную взвесь центрифугируют, осадок, содержащий сальмонеллы, ресуспендируют и конъюгируют с флюоресцентным красителем из расчета 2,5 мг красителя на 110⁹ микробных тел и затем отмывают от непрореагировавшего красителя путем многократного центрифугирования, стандартизуют жидкий препарат до концентрации 510⁹ микроб.кл./мл, стандартизованный препарат, содержащий меченые сальмонеллы, лиофилизинуют с получением сухого флюоресцирующего сальмонеллезного диагностикума.

2. Способ получения сальмонеллезного диагностикума по п.1, отличающийся тем, что в качестве флюоресцирующего красителя используют изотиоцианат флуоресцина.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 28.11.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 10-2004

Извещение опубликовано: 10.04.2004

PD4A – Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:

Федеральное государственное унитарное предприятие “Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам “Микроген”

Извещение опубликовано: 10.10.2004 БИ: 28/2004