Патент на изобретение №2175195

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВОЙ ФРАКЦИИ, ОБОГАЩЕННОЙ АНГИОГЕНИНОМ

(57) Реферат:

Изобретение относится к молочной промышленности и может быть использовано для выделения белковой фракции, обогащенной ангиогенином. Молочный ультрафильтрат осаждают насыщенным раствором сульфата аммония преимущественно при 3-5°С. Центрифугируют преимущественно со скоростью не менее 12000 об/мин в течение 0,5-1,5 ч и проводят двойной диализ преимущественно при 7-9°С в течение 10-12 ч против воды и против натрий-фосфатного буфера с последующей сорбцией белков и элюированием белковой фракции с оптической плотностью более 0,1 при длине волны 280 нм, при этом в качестве сорбента используют сефадекс G75. Изобретение позволяет повысить эффективность выделения белковой фракции, обогащенной ангиогенином, и снизить затраты. 5 з.п.ф-лы.

Изобретение относится к способу выделения белковой фракции, содержащей ангиогенин – ценное биологически активное вещество, и может быть использовано в молочной промышленности.

Известно, что ангиогенин коровьего молока представляет собой одноцепочечный белок, состоящий из 125 остатков аминокислот, с молекулярной массой ~ 14 кДа и является мощным стимулятором ангиогенеза (The angiogenins /Strydom D. J. /CMLS). Известно также, что ангиогенин обладает иммунорегуляторной функцией (Ангиогенин и механизм ангиогенеза /Мертвецов Н.П., Стефанович Л.Е. – Новосибирск: Наука, Сибирское предприятие РАН, 1997). Биологическая активность ангиогенина, а также его присутствие в молоке млекопитающих позволяет рассматривать содержащую его фракцию как перспективную биологически активную добавку.

Известен способ выделения ангиогенина из коровьего молока (Патент РФ N 2109748, МПК⁶ С 07 К 14/515, 1998), включающий очистку молока от жировой фракции, сорбцию белков на ионообменной смоле карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ), элюирование белковой фракции с последующим выделением фракции с оптической плотностью более 0,1 при длине волны 280 нм. Затем осуществляют дальнейшую очистку ангиогенина путем гидрофобной хроматографии и последующего диализа.

Недостатком известного способа является использование цельного молока в качестве исходного сырья, которое могло быть использовано на пищевые цели: для выделения 3,27 мг чистого ангиогенина требуется 3 л молока, а также длительность и многоэтапность очистки. Кроме того, в известном способе выделенная фракция содержит три группы белков: с молекулярной массой 14,3-17,8 кДа, 45 кДа и 67 кДа, т.е. смесь белков, из которой далее выделяют чистый ангиогенин.

В то же время известно, что в молочной промышленности при производстве молочных продуктов образуется большое количество побочных продуктов, таких как сыворотка, пахта, ультрафильтрат, которые не всегда находят дальнейшее применение. Широкое распространение ультрафильтрационных методов обработки привело к увеличению количества вырабатываемого ультрафильтрата, который в большинстве случаев не подвергается дальнейшей переработке, а отдается в натуральном виде на корм скоту (Мембранные и молекулярно-ситовые методы переработки молока /Фетисов Е.А., Чагаровский А.П. – М.: Агропромиздат, 1991.-272 с. ). Таким образом, применение молочного ультрафильтрата для выделения биологически активных веществ является актуальным и обладает практической значимостью.

Задачей изобретения является разработка эффективного и дешевого способа выделения белковой фракции, обогащенной ангиогенином, на основе вторичного молочного сырья, а именно молочного ультрафильтрата.

Поставленная задача достигается способом, включающим осаждение молочного ультрафильтрата, в частности насыщенным раствором сульфата аммония при 4^oC, отделение осадка путем центрифугирования, диализ против воды и против 0,05М натрий-фосфатного буфера, гель-фильтрацию путем нанесения диализованного ультрафильтрата на ионообменную колонку, содержащую в качестве сорбента сефадекс, с последующим элюированием с помощью раствора 0,2 М хлорида натрия в 0,05 М натрий-фосфатном буфере со значением pH 6,7 со скоростью не более 3-4 мл/ч и выделением фракции с оптической плотность при длине волны 280 нм более 0,1.

Предпочтительно центрифугирование проводят со скоростью не менее 12000 об/мин в течение не более 1 ч.

Диализ предпочтительно проводят при температуре не более 8^oC в течение 10-12 ч.

Предлагаемый способ предусматривает использование для получения фракции, обогащенной ценным биологически активным веществом ангиогенином, вторичного молочного сырья, а именно молочного ультрафильтрата, наиболее дешевого и наименее применяемого в производстве вторичного сырья. Поскольку концентрация ангиогенина в цельном молоке составляет до 8 мг/л (Количественный анализ ангиогенина в молоке коров /Тихомирова Н.А. – Молочная промышленность, N 10, 1999), а выход ангиогенина в ультрафильтрат – до 45-60%, использование именно этого вторичного сырья представляет большой практический интерес.

Для выделения обогащенной ангиогенином белковой фракции впервые в качестве сорбента использован известный сорбент на основе декстранов – сефадекс G-75 сверхтонкий с размером частиц сухого геля 10-40 мкм. В отличие от известного способа применение этого сорбента позволило выделить белковую фракцию только с одной группой белков с молекулярной массой 12,3-14,3 кДа, что было подтверждено электрофоретическим методом.

Предлагаемый способ обеспечивает получение из молочного ультрафильтрата белковой фракции, содержащей ангиогенин в количестве ~ 3,3 мг/л, которую далее можно использовать в качестве биологически активной добавки в производстве новых молочных продуктов, и тем самым комплексно использовать молочное сырье.

Способ осуществляется следующим образом.

Молочный ультрафильтрат осаждается насыщенным раствором сульфата аммония при температуре 4^oC, осадок отделяется путем центрифугирования, диализируется против воды и против 0,05М натрий фосфатного буфера, проводится гель-фильтрация путем нанесения диализованного ультрафильтрата на ионнообменную колонку, содержащую в качестве сорбента сефадекс, с последующим элюированием с помощью раствора 0,2 М хлорида натрия в 0,05 М натрий-фосфатном буфере со значением pH 6,7 со скоростью не более 3-4 мл/ч. Все фракции с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 объединяют.

Пример 1.

2 л ультрафильтрата, полученного в результате ультрафильтрации цельного молока при производстве детского творога, осаждали 65% насыщенным раствором сульфата аммония в течение двух суток при температуре 4^oC. Образовавшийся осадок центрифугировали со скоростью 12000 об/мин в течение 50 мин и диализовали против воды и 0,05 М натрий-фосфатного буфера с pH 6,7 в течение 10 часов при температуре 4^oC. Определяли содержание белка в диализованном ультрафильтрате по методу Лоури, которое составило 8 мг белка на 1 мл ультрафильтрата. Затем подготовленным сефадексом заполняли колонку размером (1,5х95)см и наносили диализованный ультрафильтрат.

Элюирование проводили раствором 0,2 М хлористого натрия в 0,05 М натрий-фосфатном буфере с pH 6,7 со скоростью 3 мл/ч. Выделяли белковую фракцию с оптической плотностью более 0,1 при длине волны 280 нм. Выход ангиогенина составил 67%. Определяли концентрацию ангиогенина в выделенной фракции по количественному методу определения ангиогенина в биологическом сырье (Патент РФ N 2110066, МПК⁶ G 01 N 33/04, 1998). Концентрация ангиогенина составила 3,35 мг/л.

Пример 2.

2 л ультрафильтрата, полученного в результате ультрафильтрации цельного молока при производстве детского творога, осаждали 100% насыщенным раствором сульфата аммония в течение двух суток при температуре 4^oC. Образовавшийся осадок центрифугировали при 14000 об/мин в течение 35 мин и диализовали против воды и 0,05 М натрий-фосфатного буфера с pH 6,7 в течение 12 часов при температуре 8^oC. Определяли содержание белка в диализованном ультрафильтрате по методу Лоури, которое составило 8 мг белка на 1 мл ультрафильтрата. Затем подготовленным сефадексом заполняли колонку размером (1,5х95)см и наносили диализованный ультрафильтрат.

Элюирование проводили раствором 0,2 М хлористого натрия в 0,05 М натрий-фосфатном буфере с pH 6,7 со скоростью 4 мл/ч. Выделяли белковую фракцию с оптической плотностью более 0,1 при длине волны 280 нм. Выход составил 72,8%. Концентрация ангиогенина составила 3,64 мг/л.

Сравнительный пример.

Свежее цельное молоко в количестве 2 л обезжиривали центрифугированием (3000 об/мин, 30 мин) при 4^oC. Обезжиренное молоко суспендировали в предварительно подготовленную карбоксиметилцеллюлозу. Затем измеряли значение pH смеси и, если это необходимо, доводили его до значения 6,7 с помощью 0,1 М соляной кислотой. Сорбцию вели в течение одного часа при температуре 4^oC. После сорбции отделяли сорбент от жидкой фазы, промывали его пятью объемами 0,05 М натрий-фосфатного буфера, pH 6,7, при объемном соотношении карбоксиметилцеллюлоза : буфер = 1 : 5. Затем сорбент помещали в ионообменную колонку размером (2,5х50)см. Колонку промывали 0,2 л того же буфера со скоростью 200 мл/ч и элюировали белки смесью хлорида натрия и натрий-фосфатного буфера со скоростью 100 мл/ч. Собирали фракции объемом 10 мл и все фракции с оптической плотностью более 0,1 при длине волны 280 нм объединяли.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет использовать молочный ультрафильтрат в качестве дешевого исходного сырья для получения ангиогенина, а также выделять белковую фракцию, содержащую ангиогенин, с использованием сефадекса в качестве сорбента. Полученную белковую фракцию можно использовать как биологически активную добавку при производстве молочных продуктов, в особенности для повышения биологической ценности стерилизованных молочных продуктов.

Формула изобретения

1. Способ выделения белковой фракции, обогащенной ангиогенином, из молочного сырья, включающий сорбцию белков и элюирование белковой фракции с оптической плотностью более 0,1 при длине волны 280 нм, отличающийся тем, что в качестве молочного сырья используют молочный ультрафильтрат и в качестве сорбента – сефадекс G-75, предварительно осуществляют осаждение ультрафильтрата насыщенным раствором сульфата аммония с последующим центрифугированием и двойным диализом против воды и против натрий-фосфатного буфера.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что элюирование проводят со скоростью 3 – 4 мл/ч.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что осаждение проводят при 3 – 5^oC.

4. Способ по пп.1 – 3, отличающийся тем, что центрифугирование проводят со скоростью не менее 12000 об./мин.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что центрифугирование проводят 0,5 – 1,5 ч.

6. Способ по пп.1 – 5, отличающийся тем, что диализ проводят при 7 – 9^oC в течение 10 – 12 ч.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 24.06.2003

Извещение опубликовано: 20.11.2004 БИ: 32/2004

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 10.08.2005 БИ: 22/2005

MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины за
поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 24.06.2008

Дата публикации: 10.03.2011