Патент на изобретение №2175189

(54) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ СОРГО В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

(57) Реферат:

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть применено в селекции сорго при создании нового исходного материала на основе генной и клеточной инженерии, мутационной селекции в культуре in vitro, при клональном размножении ценных генотипов (стерильных растений, гаплоидов и т. п. ). Для получения и размножения эмбриогенных каллусных культур и регенерации растений сорго используют модифицированную среду Мурасиге и Скуга с увеличенной концентрацией ионов NO₃ ^– и NH₄ ⁺, составляющей 61-88 mM для ионов NO₃ ^–, лучше всего 72,4 mM, и 48-78 mM, для ионов NH₄ ⁺, лучше всего 62,5 mM (среда М2). Концентрация индукторов каллусогенеза составляет 1 г/л L-аспарагина и 2 г/л L-пролина. Предлагаемый способ значительно усиливает рост эмбриогенного каллуса (ЭК) и его регенерационную способность у разных образцов сорго и тем самым позволяет получать большую частоту формирования культур с ЭК, большую массу ЭК и большее количество растений-регенерантов. 1 з.п.ф-лы, 4 табл., 1 ил.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в селекции сорго при создании нового исходного материала на основе генной и клеточной инженерии, мутационной селекции в культуре in vltro, при клональном размножении ценных генотипов (стерильных растений, гаплоидов и т.п.).

Известен способ размножения (регенерации) растений сорго в культуре in vitro (авт. св. СССР N 1107799: A 01 H 1/00; 15.06.1982; опубл. 15.10.1984; бюл. N 30), заключающийся в отборе регенерационноспособных типов тканей в каллусных культурах, формирующихся из зрелых зародышей на модифицированной среде по Мурасиге и Скугу (MS), содержащей 2,4-D и цитокинин (кинетин или 6-БАП), и пересадке их на среду для регенерации (MS с ИУК).

₃ ^– и NH₄ ⁺ (для MS, соответственно, 39.9 mM и 20.6 mM), 2,4-D и аминокислоты L-аспарагин и L-пролин, добавляемых в среду совместно в высоких концентрациях (2-3 г/л), отборе эмбриогенного каллуса (белой матовой ткани или рыхлого эмбриогенного каллуса), его размножении и пересадке на регенерационную среду (MS с ИУК и кинетином) для получения растений-регенерантов.

Прототип позволяет получать более однородные каллусные культуры, в которых способные к регенерации растений типы тканей представлены только эмбриогенным каллусом, способным к длительной пролиферации при субкультивировании на средах с аминокислотами. Добавка аминокислот подавляет выделение специфического токсического пигмента, характерного для каллусных культур сорго, и у некоторых образцов способствует формированию рыхлого эмбриогенного каллуса – наиболее ценного каллусного морфотипа, формирующегося у злаков в культуре in vitro.

Недостатком данного способа является сравнительно небольшой выход эмбриогенного каллуса у многих образцов сорго – слабый рост, сравнительно низкая частота формирования эмбриогенных культур, – что, в свою очередь, снижает выход растений-регенерантов.

Цель изобретения – повышение выхода эмбриогенного каллуса и растений-регенерантов сорго.

Поставленная цель достигается тем, что по предлагаемому способу регенерации растений сорго в культуре in vitro, включающему получение эмбриогенных каллусных культур на питательной среде по Мурасиге и Скугу, содержащей в своем составе ионы NO₃ ^– и NH₄ ⁺ в приемлемых концентрациях и индукторы каллусогенеза, например, такие как 2,4-D и аминокислоты L-аспарагин и L-пролин, размножение полученного эмбриогенного каллуса на среде того же состава и пересадку его на среду для регенерации, содержащую индукторы морфогенеза, например, такие как ИУК и кинетин, для получения и размножения эмбриогенных каллусных культур используют модифицированную среду MS с концентрацией ионов NO₃ ^– и NH₄ ⁺, составляющей 61 – 88 mM для ионов NO₃ ^–, лучше всего 72.4 mM, и 48 – 78 mM для ионов NH₄ ⁺, лучше всего 62.5 mM (т.е. среду M2).

Для получения нужной концентрации ионов NO₃ ^– и NH₄ ⁺ концентрацию KNO₃ в стандартной рецептуре среды MS снижают до 9.9 mM, а концентрацию NH₄NO₃ повышают до 62.5 mМ.

Доказательства наличия “изобретательского уровня”
В науке и технике не обнаружено решений, обладающих совокупностью признаков, аналогичной предлагаемому. Необходимо отметить существенную и неочевидную роль предлагаемой высокой концентрации источников неорганического азота в сочетании с добавкой L-аспарагина и L-пролина для достижения цели изобретения. Не является очевидным использование высокой концентрации ионов NH₄ ⁺ и NO₃ ^– для значительного увеличения выхода эмбриогенного каллуса и растений-регенерантов у разных образцов сорго.

Таким образом, предлагаемое техническое решение отвечает критерию “изобретательский уровень”.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Первичные экспланты (незрелые зародыши, фрагменты молодых метелок) после стерилизации 70%-ным спиртом (30 с) и 5-7%-ным хлорамином (5 мин) культивируют в темноте (t^o = 261^oC) предлагаемым способом на предлагаемой модифицированной среде (M2), минеральный состав которой указан в сноске табл. 1, содержащей также агар, сахарозу (30 г/л), витамины B1, B6, РР, мезоинозит (100 мг/л), 2,4-D (1.0 мг/л), L-аспарагин (1.0 г/л) и L-пролин (2.0 г/л) при pH 5.8-6.0. Из первичных эксплантов на этой среде получают большие массы эмбриогенного каллуса. Полученный эмбриогенный каллус с агрегатами эмбриоидов пересаживают для размножения на среду M2 того же состава, либо для регенерации растений на среду MS, содержащую 1.0 мг/л ИУК и 0.1 мг/л кинетина. На среде для регенерации из эмбриогенного каллуса получают растения-регенеранты, пригодные для пересадки в почву.

Пример конкретного выполнения предлагаемого способа.

Молодые метелки (длиной 1.5-3.5 см), находящиеся на стадиях формирования примордиев вторичных веточек или колосков, сортообразцов Волжское-2, Желтозерное-10, Сизый, КВВ-181, Раннее-7, МСТ-140 стерилизовали 70%-ным спиртом (30 с) и 5-7%-ным хлорамином (5 мин), промывали автоклавированной водой, нарезали на фрагменты длиной 3-4 мм и помещали в пробирки на поверхность питательной среды M2, а также для сравнения – других сред (табл. 1).

Среда M2 отличалась от среды MS приблизительно трехкратным увеличением концентрации ионов NH₄ ⁺ и двухкратным увеличением концентрации ионов NO₃ ^–, что достигалось приготовлением модифицированной среды MS, содержащей 9.9 mM KNO₃ и 62.5 mM NH₄NO₃.

Среда M21 имела уровень ионов NH₄ ⁺ среды MS и уровень NO₃ ^– среды M2, что достигалось приготовлением модифицированной среды MS, содержащей 51.9 mM KNO₃ и 20.6 mM NH₄NO₃.

Среда M23 имела уровень NH₄ ⁺ среды M2 и уровень NO₃ ^– среды MS, что достигалось приготовлением модифицированной среды MS, содержащей 7.4 mM KNO₃, 32.5 mM NH₄NO₃ и 15.1 mM (NH₄)₂SO₄.

Среда M24 имела шестикратное увеличение уровня NH₄ ⁺ и четырехкратное увеличение уровня NO₃ ^–, по сравнению со средой MS, т.е. удвоенную концентрацию данных ионов по сравнению со средой M2, что достигалось приготовлением модифицированной среды MS, содержащей 6.6 mM KNO₃ и 125.0 mM NH₄NO₃.

Все среды содержали 1.0 мг/л 2,4-D, 1.0 г/л L-аспарагина и/или 2.0 г/л L-пролина, витамины B1 (1.0 мг/л), B6 (1.0 мг/л), PP (1.3 мг/л), 100 мг/л мезоинозита, 3% сахарозы, агар (6 г/л) и имели pH 5.8-6.0. Культивирование проводили в темноте (t^o = 26^oC).

Для регенерации растений эмбриогенный каллус, имеющий вид компактной белой матовой ткани, пересаживали на среду для регенерации (MS, 1.0 мг/л ИУК, 0.1 мг/л кинетина) и культивировали на свету (t^o = 26^oC; фотопериод 16 ч).

Для оценки влияния равных сред учитывали долю культур с эмбриогенным каллусом (ЭК), интенсивность роста ЭК, количество регенерантов (развитых побегов) длиной более 3 см на среде для регенерация. Интенсивность роста каллуса оценивали взвешиванием и/или визуально (в баллах шкалы: 0 – отсутствие роста, … , 4 – интенсивный рост).

Результаты культивирования, приведенные в табл. 1, показали, что среда M2АП (с 72.4 mM NO₃ ^– и 62.5 mM NH₄ ⁺) значительно превосходила среду MSАП (с 39.9 mM NO₃ ^– и 20.6 mM NH₄ ⁺ – прототип) по интенсивности роста каллуса, при этом рост эмбриогенного каллуса стимулировался наиболее эффективно: масса ЭК на среде M2АП превышала массу ЭК на среде MSАП в 2 раза. Наибольший стимулирующий эффект неорганического азота среды M2 наблюдали при добавке обеих аминокислот: L-аспарагина и L-пролина. Увеличение концентрации только ионов NO₃ ^– (среда M21АП с 72.5 mM NO₃ ^– и 20.6 mM NH₄ ⁺) или только ионов NH₄ ⁺ (M23АП с 39.9 mM NO₃ ^– и 62.5 mM NH₄ ⁺) вызывало значительно более слабый стимулирующий эффект, чем увеличение уровня концентрации обоих ионов. Дальнейшее пропорциональное увеличение концентрации ионов NO₃ ^– и NH₄ ⁺ (среда M24АП с 131.6 mM NO₃ ^– и 125.0 mM NH₄ ⁺) оказывало ингибирующий эффект как на увеличение общей массы каллуса, так и массы эмбриогенного каллуса. Двухфакторный дисперсионный анализ подтвердил значимость наблюдавшихся различий и достоверность (p<0.05) взаимодействия ионов NO₃ ^– и NH₄ ⁺ в индукции и росте эмбриогенного каллуса сорго (табл. 2).

Таким образом, увеличение концентрации ионов NH₄ ⁺ и NO₃ ^– в питательной среде, содержащей аминокислоты L-аспарагин (1.0 г/л) и L-пролин (2.0 г/л), значительным образом стимулировало рост эмбриогенного каллуса сорго.

Зависимость массы ЭК от концентрации ионов NO₃ ^– и NH₄ ⁺ при одновременном увеличении их содержания в питательной среде, как было описано выше, графически представлена на чертеже (А и Б соответственно). Учитывая, что в прототипе концентрация ионов NO₃ ^–составляет 39.9 mM, а также величину ошибки средней (99 мг), очевидно, что статистически значимый эффект наблюдается в диапазоне концентраций 61-88 mM NO₃ ^–. Аналогичным образом, учитывая, что в прототипе концентрация ионов NH₄ ⁺ составляет 20.6 mM, статистически значимый эффект наблюдается в диапазоне концентраций 48-79 mM NH₄ ⁺.

Стимулирующий эффект среды M2 с аминокислотами L-аспарагином и L-пролином был проверен нами на четырех различных сортообразцах сорго. Было выявлено, что среда по предлагаемому способу благоприятна для получения эмбриогенного каллуса у равных сортообразцов, превосходя все другие среды, разработанные ранее для получения морфогенных каллусных культур у сорго: MS с 6-БАП (по аналогу), а также MS с аминокислотами L-аспарагином и L-пролином (по прототипу) (табл. 3).

Для получения растений-регенерантов ЭК, полученный у сортообразцов Сизый и MCT-140 на средах M2АП и MSАП, пересаживали на среду для регенерации (MS+ИУК+кинетин). Было обнаружено, что эмбриогенный каллус, полученный на среде M2 с L-аспарагином и L-пролином, обладает значительно более высокой регенерационной способностью по сравнению с морфологически сходным каллусом, полученным на среде M2 с L-аспарагином и L-пролином (табл. 4). Так, у образца Сизый ЭК со среды M2АП дал значительно более высокую частоту культур с регенерантами (в 3 раза) и большее количество регенерантов в расчете на одну такую культуру (в 12 раз). У образца MCT-140 было также получено значительно большее количество регенерантов из ЭК со среды M2АП, поскольку ЭК на данной среде в каждой культуре имел большую массу, и, следовательно, количество регенерантов в расчете на один ЭК, пересаженный на среду для регенерации, для данной среды было значительно выше. Всего при использовании предлагаемого способа у двух испытанных образцов было получено 170 регенерантов против 31 по прототипу.

Таким образом, приведенные данные и их анализ показывают, что среда M2 по предлагаемому способу с увеличенной концентрацией ионов NO₃ ^– и NH₄ ⁺ в сочетании с добавкой аминокислот (L-аспарагином и L-пролином) значительно усиливает рост ЭК сорго и его регенерационную способность, т.е. позволяет получать большую частоту культур с ЭК, его большую массу и большее количество растений-регенерантов по сравнению с прототипом и другими средами и может использоваться в прикладных и фундаментальных работах, связанных с получением больших количеств ЭК и растений-регенерантов у разных сортообразцов сорго.

Формула изобретения

1. Способ регенерации растений сорго в культуре in vitro, включающий получение эмбриогенных каллусных культур на питательной среде по Мурасиге и Скугу, содержащей в своем составе ионы NO₃ ^– и NH₄ ⁺ в приемлемых концентрациях и включающий индукторы каллусогенеза 2,4 – D и аминокислоты L-аспарагин и L-пролин, размножение полученного эмбриогенного каллуса на среде того же состава и пересадку его на среду для регенерации, содержащую индукторы морфогенеза ИУК и кинетин, отличающийся тем, что для получения и размножения эмбриогенных каллусных культур используют модифицированную среду Мурасиге и Скуга с концентрацией ионов NO₃ ^– и NH₄ ⁺, составляющей 61-88 mM для ионов NO₃ ^–, и 48-78 mM для ионов NH₄ ⁺.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация ионов предпочтительно составляет для NO₃ ^– – 72,4 mM, а для NH₄ ⁺ – 62,5 mM.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 14.12.2001

Номер и год публикации бюллетеня: 19-2003

Извещение опубликовано: 10.07.2003