Патент на изобретение №2174233

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТОКСОПЛАЗМОЗА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и касается получения антитоксоплазменных иммуноглобулинов для обнаружения токсоплазм в патологическом материале прямым методом флуоресцирующих антител (МФА). Задача настоящего изобретения заключается в упрощении способа получения высокоактивных и специфических антител к токсоплазмам для выявления антигенов T: gondii непосредственно в клиническом материале от больных токсоплазмозом, а также в патологоанатомических образцах в прямом варианте МФА. Сущность изобретения состоит в том, что сыворотку получают на 10-14 сутки обострения болезни от больных хронической формой токсоплазмоза, болеющих на протяжении 2-10 лет, в количестве 5-10 мл, с титрами антител НМФА 1: 640 или в ИФА 1: 3200, инактивируют при 56°С в течение 30 мин, после чего выделяют фракцию иммуноглобулинов двухкратным осаждением 20%-ным раствором полиэтиленгликоля, тип 6000, метят флуоресцеин-5-изотиоцианатом в соотношении Ig : ФИТЦ 20:1. Технический результат заключается в том, что предлагаемый способ позволяет получить иммунофлуоресцирующие антитела к токсоплазмам с высокой активностью (1: 256 – 1:2000), специфичностью и способностью экспрессно обнаружить токсоплазмы в клиническом и патологоанатомическом материале, имеющим посторонние примеси, в прямом варианте МФА, упростив тем самым метод диагностики токсоплазмоза. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и касается получения антитоксоплазменных иммуноглобулинов для прямого обнаружения токсоплазм в патологическом материале.

В связи с разнообразием характера течения болезни при токсоплазмозе практически исключается возможность постановки диагноза только на основании клинической картины. В большинстве случаев при диагностике токсоплазмоза ориентируются на выявление в сыворотках крови токсоплазменных антител. В то же время способность токсоплазм поражать клетки всех типов тканей, определяющая многообразие клинических проявлений заболевания, не всегда сопровождается выработкой специфических антител. Поэтому вопрос о выделении токсоплазм и обнаружение их в клиническом материале у больных с подозрением на токсоплазмоз, а также в патологоанатомических образцах остается актуальным.

Существующие методы исследования возбудителя токсоплазмоза включают поиск его путем непосредственной микроскопии материала в гистологических срезах внутренних органов либо с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также выделение микроорганизма на восприимчивых лабораторных животных.

Перечисленные методы диагностики токсоплазмоза не пользуются широкой популярностью в практической медицине. Несмотря на то, что метод прямой микроскопии несложен и доступен, он не всегда информативен и его отрицательный результат не исключает наличия токсоплазменной инфекции. Выделение токсоплазм методом биопробы предполагает работу с живым возбудителем и восприимчивыми лабораторными животными (белые мыши, морские свинки, кролики или хомяки), трудоемок, дорогостоящ и продолжителен по времени получения результата. (Эпидемиология, клиника, диагностика и лечение токсоплазмоза. Методические рекомендации. Авторы: Л.И.Грачева, Д.Б.Гончаров -М., 1998, с. 24). ПЦР – дорогостоящий диагностический тест и доступен не всем лабораториям.

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является сэндвичная иммунологическая проба. При выполнении данного теста для обнаружения в образце биологической жидкости животных антигена Toxsoplasma gondii, который вызывает острую форму токсоплазмоза, на поверхности твердого субстрата сорбируют F (ав¹)₂ – фрагмент Ig-антител к упомянутому антигену либо моноклональные антитела к нему, добавляют к сорбируемому материалу исследуемый образец и инкубируют полученную смесь. Разделяют адсорбируемые и неадсорбируемые фракции инкубируемой смеси и к первой из них добавляют меченые антитела к Т. gondii. Вторую смесь также инкубируют и затем разделяют адсорбированную и неадсорбированную ее фракции. В первой определяют присутствие меченого антитела (США, патент N 4361647).

Недостатками выполнения данного иммунологического теста является его многоэтапность, дороговизна, необходимость иммунизации животных для получения иммунных специфических к T.gondii сывороток и F (ав¹)₂ фрагмента либо моноклональных антител, которые используются в качестве “подложки”.

Целью настоящего изобретения является упрощение способа получения высокоактивных и специфических антител к токсоплазмам для выявления антигенов Т. gondii непосредственно в клиническом материале от больных токсоплазмозом, а также в патологоанатомических образцах в прямом варианте МФА.

Поставленная цель достигается тем, что иммунную сыворотку к токсоплазмам получают от больных людей хронической формой токсоплазмоза, болеющих в течение 2-10 лет, на 10-14 сутки периода обострения (повышение температуры, увеличение периферических лимфатических узлов, головная боль, сильная слабость) отбирают сыворотку в количестве 5-10 мл от одного больного и определяют титры специфических антител НМФА и в ИФА. Сыворотку с высоким титром специфических токсоплазменных антител ( 1:640 в НМФА или 1:3200 в ИФА) инактивируют при 56^oC в течение 30 мин и центрифугируют при 13000 об/мин для удаления аггрегированных белков в течение 30 мин. Надосадочную жидкость отсасывают и помещают на мешалку. Добавляют равный объем 20% раствора полиэтиленгликоля, тип 6000. После экспозиции 20 мин при комнатной температуре осадок отделяют центрифугированием при 13000 об/мин в течение 30 мин. Надосадок удаляют, а осадок растворяют в 0,1 М фосфатно-буферном растворе, pH 7,5, до первоначального объема. Снова добавляют равный объем раствора ПЭГ и после экспозиции центрифугируют повторно. Надосадок удаляют, а осадок растворяют в 0,1 М фосфатно-буферном растворе, pH 7,5, до первоначального объема (5 мл). Добавляют 1% хлороформа, перемешивают, помещают в холодильник и через 2 часа центрифугируют при 13000 об/мин – 30 мин. Надосадочная жидкость представляет собой раствор иммуноглобулина (Ig). Осуществляют метку флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) в соотношении Ig:ФИТЦ 20:1.

Полученные таким образом иммуноглобулины в разведении 1:256 – 1:2000 способны обнаруживать антигены токсоплазм как в клиническом материале от больных, так и в патологоанатомических образцах от плода при поздних выкидышах и от мертворожденных детей.

Примеры конкретного выполнения.

I. Отбор сывороток
1. У больных хронической формой токсоплазмоза, болеющих в течение 2-10 лет, на 10-14 сутки периода обострения проводят забор крови в количестве 5-10 мл.

2. Определяют титры антител к токсоплазмам в сыворотке крови в НМФЛ или ИФА.

3. При наличии специфических антител в титре 1:640 в НМФА или 1: 3200 в ИФА выделяют иммуноглобулин двухкратным осаждением 20% раствором ПЭГ.

4. Метят в соотношении Ig: ФИТЦ – 20:1.

5. Определяют рабочее разведение полученного конъюгата Igтокс -ФИТЦ.

II. Обнаружение T.gondii в образце мочи новорожденного с подозрением на токсоплазмоз.

1. Пробу мочи от новорожденного центрифугируют при 2,5 тыс. об/мин в течение 10 мин и осадок (10 мкл) наносят на предметное стекло.

2. Фиксируют спиртом или ацетоном 15 мин.

3. Наносят Igтокс – ФИТЦ, в рабочем разведении 1:256 в количестве 10 мкл.

4. Экспозиция 30 мин при 37^oC во влажной камере.

5. Отмывают физиологическим раствором 3 раза по 5 мин.

6. Промывают дистиллированной водой.

7. Высушивают.

8. Просматривают в ЛЮМ микроскопе после нанесения на препарат монтирующей жидкости.

III. Проверка специфичности – см. таблицу.

Результаты проверки специфичности флуоресцирующих токсоплазменных иммуноглобулинов даны в табллице.

В результате предлагаемого способа были получены иммунофлуоресцирующие антитела к токсоплазмам (Igтокс-ФИТЦ) с высокой активностью (1:256 – 1:2000) и специфичностью, позволяющие экспрессно обнаружить в прямом варианте МФА токсоплазмы в клиническом и патологоанатомическом материале, имеющим посторонние примеси, упростив тем самым метод диагностики токсоплазмоза. 5 мл специфической токсоплазменной сыворотки достаточно на 1000 исследуемых образцов. Полученный препарат сохраняет свои свойства на протяжении 12 месяцев.

Формула изобретения

Способ получения иммунофлуоресцирующих антител для обнаружения возбудителя токсоплазмоза, включающий выделение из сыворотки иммуноглобулинов, отличающийся тем, что сыворотку получают на 10-14 сутки обострения болезни от больных хронической формой токсоплазмоза, болеющих на протяжении 2-10 лет в количестве 5-10 мл, с титрами антитела в НМФА > 1 : 640 или в ИФА > 1 : 3200, инактивируют при 56°С в течение 30 мин, после чего выделяют фракцию иммуноглобулинов двухкратным осаждением 20%-ным раствором полиэтиленгликоля, тип 6000, и метят флуоресцеин-5-изотиоцианатом в соотношении Igтокс-ФИТЦ-20 : l.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 31.12.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 13-2004

Извещение опубликовано: 10.05.2004