Патент на изобретение №2174012
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБЫ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ АЛЛЕРГИИ
(57) Реферат: Изобретение относится к медицине и касается способов получения белкового гидролизата подавляющей регуляции аллергических реакций, способов профилактики или лечения аллергии. Сущность изобретения включает способы получения белкового гидролизата посредством гидролиза белков ферментами, выделяемыми из бактериальных препаратов, содержащих пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протезную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103) пепсином и/или трипсином, а также получение белкового гидролизата, включающей гидролиз белков пепсином и/или трипсином и добавления в гидролизат бактериального препарата, содержащего пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, имеющие вышеуказанные характеристики штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103), а также способы профилактики и лечения вызванных пищей аллергических реакций у грудного ребенка, лечения аллергии к коровьему молоку у пациента, стимуляции, вызывающих иммунологическую толерантность иммунных реакций с использованием полученного белкового гидролизата. Технический результат заключается в усилении активности целевого продукта и повышении эффективности лечения. 5 с. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил. Изобретение относится к способам и средствам подавления вызванных пищевыми продуктами аллергических реакций у пациентов, страдающих пищевой аллергией. В частности, изобретение предоставляет способы профилактики или лечение аллергии, особенно аллергии к коровьему молоку у детей грудного возраста. Изобретение также относится к разработке специальных композиций для страдающих аллергией детей грудного возраста с нарушенной барьерной функцией кишечника. Аллергия к коровьему молоку (АКМ) определяется как иммунологически опосредованная неблагоприятная реакция на белки коровьего молока. В настоящее время способом лечения выбора является полное устранение антигенов коровьего молока. Когда нет материнского молока, у детей грудного возраста с АКМ необходимо использовать замещающую композицию. Гидролизованные композиции, основанные на сыворотке или казеине, полученных из коровьего молока, используются для обеспечения адекватного питания со сниженной антигенной нагрузкой. Предварительная тепловая обработка коровьего молока главным образом воздействует на конформацию белков и облегчает их гидролиз. Последующий ферментативный гидролиз пепсином, трипсином, экстрактами поджелудочной железы и экстрактами из слизистой оболочки кишечника вызывает прогрессирующее разрушение последовательных эпитопов и очищает композиции в минимально антигенную и аллергенную форму. В большинстве случаев экстенсивно гидролизованные композиции, полученные из коровьего молока, могут безопасно внедряться в практику, и они эффективны, а также хорошо переносятся клинически и метаболически. Однако ферментативный гидролиз необязательно делает композицию неаллергенной, поскольку оптимальная степень гидролиза неизвестна, и в гидролизате выявляются следы исходного белка. Поэтому назначание этих заменителей детям с аллергией к коровьему молоку должно производиться с осторожностью. До сих пор, подход к прекращению аллергического воспаления с помощью устранения антигена был неудовлетворительным, особенно у пациентов с множественной пищевой аллергией (Sampson et al., 1992). У этих пациентов часто выявляется повышенная кишечная проницаемость и нарушение защитной барьерной функции кишечника (Majamaa et al., 1996, Majamaa and Isolauri, 1996). Это усиливает опасность нарушений роста и сенсибилизации к множеству продуктов питания. Срочно необходимы новые подходы к лечению аллергии к коровьему молоку для улучшения заместительных композиций при АКМ. Обработка антигена в кишечнике определяет последующую иммунную реакцию на антиген. В норме антигены всасываются через эпителий по двум функциональным путям. Главный путь представляет собой деградационное снижение иммуногенности антигена. Второстепенный путь обеспечивает возможность транспорта интактных белков, что имеет принципиальное значение для антиген-специфических иммунных реакций. Аберрантное всасывание антигена усиливает процесс сенсибилизации (Fargeas et al., 1995). Дифференциальная выработка цитокинов Т-хелперными (Th) клетками во время иммунной реакции оказывает важное регулирующее влияние на природу иммунного ответа. Цитокиновый профиль естественного иммунного ответа определяет фенотип последующего иммунного ответа. Кроме регуляции синтеза lgE, IL4 играет ключевую роль для развития и созревания фенотипа Th2, характерного для аллергического воспаления. Как оказывается, этот процесс является ключевым для развития устойчивости к поступившему с пищей белку. Устойчивость при пероральном поступлении представляет собой состояние антиген-специфической системной ареактивности, характеризуемой местной антиген-специфической реакцией IgA. Недавно было показано, что выделенный из кишечника человека штамм Lactobacillus штамм GG (Lactobacillus GG, АТСС 53103), стимулирует местные реакции IgA против пищевых антигенов, встречаемых при энтеральном прохождении и могут поэтому помогать при иммунной ликвидации (Isolauri et al., 1993). В настоящее время пока не известно, могут ли конкретные штаммы кишечных бактерий непосредственно изменять иммуногенность пищевых антигенов и, следовательно, подавлять аллергические реакции. Молочные бактерии включены в микробную флору здорового кишечника. Было высказано предположение, что молочные бактерии действуют в кишечном тракте путем конкуренции с патогенными микробами на слизистой оболочке кишечника за рецепторы и питательные вещества. Пробиотики представляют собой ценные микробные препараты, которые укрепляют здоровье путем сохранения естественной микрофлоры в кишечнике. Микробные препараты могут быть признаны как пробиотические, если известны их функционирующие микробы и механизм их действия. Пробиотики прикрепляются на слизистой оболочке кишечника, образуют колонии в кишечном тракте человека и предотвращают прикрепление вредных микробов. Ключевое предположение состоит в том, что они попадают в слизистую оболочку верхних отделов кишечника и не разрушаются в верхней части желудочно-кишечного тракта. Lactobacillus GG представляет собой одну из известных бактерий, имеющих пробиотические характеристики. Описание изобретения Авторы настоящего изобретения обнаружили, что определенные бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности Lactobacillus, и особенно бактерии, имеющие пробиотические характеристики, могут использоваться для повышения эффективности элиминационной диеты и для повышения устойчивости при пероральном поступлении, при профилактике или лечении пищевых аллергических реакций у пациента. Один аспект изобретения состоит в том, что для указанной цели могут также использоваться белковые гидролизаты, полученные с помощью гидролиза указанных выше бактерий желудочно-кишечного тракта. Мы показываем здесь, что гидролизаты белка, полученные в соответствии с этим изобретением, оказывают иммунологическое воздействие, способствующее гипоаллергенности. Гидролизаты оказывают подавляющее регулирующее влияние на аллергические реакции, способствуя таким образом барьерной функции кишечника, т.е., стабилизируя барьер слизистой оболочки кишечника. Настоящее изобретение предоставляет усовершенствованную композицию гидролизата белка, оказывающую подавляющее регулирующее влияние на аллергические реакции и способствующую иммунной барьерной функции кишечника. Композицию гидролизата можно получить с помощью гидролиза белков ферментами, полученными из пробиотических бактерий желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103), и трипсином и/или пепсином. Альтернативно, композиция белкового гидролизата изобретения может быть получена с помощью гидролиза белков трипсином и/или пепсином и добавления в полученный таким образом гидролизат бактериального препарата, включающего пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (ATCC 53103). Бактерии добавляются в композицию гидролизата предпочтительно в виде лиофилизированного препарата. При введении такой композиции гидролизата пациенту следует ожидать, что in vivo будут высвобождаться гидролизирующие ферменты присутствующих бактерий, посредством чего достигается такой же эффект, как с помощью определенной выше усовершенствованной композиции гидролизата. Кроме того, жизнеспособные бактерии стабилизируют барьер слизистой оболочки кишечника, усиливая местную защиту. Один из вариантов реализации данного изобретения представляет собой способ профилактики или лечения вызванных пищей аллергических реакций у грудного ребенка, причем этот способ включает этап введения грудному ребенку с риском развития такой реакции усовершенствованной композиции белкового гидролизата изобретения или, альтернативно, композиции белкового гидролизата вместе с бактериальным препаратом, включающим пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103). Еще одним вариантом реализации этого изобретения является способ лечения аллергии к коровьему молоку у пациента, включающий пероральное введение пациенту усовершенствованной композиции белкового гидролизата изобретения или, альтернативно, введение композиции белкового гидролизата вместе с бактериальным препаратом, включающим пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103). Изобретение также предоставляет способ стимуляции вызывающих иммунологическую толерантность иммунных реакций на пищевые антигены у пациента, включающий оральное введение усовершенствованной композиции белкового гидролизата изобретения пациенту или, альтернативно, бактериального препарата, включающего пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103 или, альтернативно, композиции белкового гидролизата вместе с бактериальным препаратом, включающим пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС СС 53103). Когда в определенных выше способах изобретения композиция белкового гидролизата используется в комбинации с выбранными пробиотическими бактериями как определено выше, такая композиция может быть любой подходящей известно или новой композицией белкового гидролизата. Поэтому она может быть или частичным белковым гидролизатом, или, альтернативно, экстенсивно гидролизованной композицией. Препарат белкового гидролизата, подходящий для этой цепи, раскрыт, например, в заявке на патент ЕР N 601802. Предпочтительной бактерией для использования в композициях и способах изобретения является Lactobacillus GG (АТСС 53103). В этом описании и в прилагаемой формуле изобретения фразу “бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103)” следует понимать как определяющую бактерии, чьи адгезионные и колонизирующие характеристики сравнимы с таковыми штамма LGG, например, как определено в патенте ЕР 199535. Предполагается, что эти бактерии имеют такой же вид ферментной системы как LGG, что значит, что ферменты, полученные из таких бактерий, способны разлагать белки для выработки продуктов гидролиза с такими же эффектами, как эффекты продуктов, полученных с использованием ферментов, полученных из LGG. Сокращения ДИ – доверительный интервал IFN-  – -интерферонIgA – Иммуноглобулин А IgE – Иммуноглобулин E IL-4 – Интерлейкин-4 LGG – Lactobacillus GG (ATCC 53103) OKT3 – антитело против CD3 МПКК – мононуклеарные клетки периферической крови TNF-  – фактор некроза опухоли WF – испытуемая группа, получающая экстенсивно гидролизованную сывороточную композицию WF-GG – испытуемая группа, получающая экстенсивно гидролизованную сывороточную композицию и препарат LGG П/Т-казеин = казеин, гидролизованный пепсином и трипсином П/Т- s1-казеин = s1-казеин, гидролизованный пепсином и трипсиномКраткое описание чертежей Фиг. 1A-1D. Вызванные митогеном пролиферативные реакции МКПК in vitro на П/Т-казеин = (1A), П/T- s1-казеин (1B), П/Т-казеин, дополнительно гидролизованный ферментами, полученными из LGG (1С) и П/Т-s1-казеин, дополнительно гидролизованный ферментами, полученными из LGG (ID). Результаты выражены в виде среднего количества в минуту для культур без гидролизованного продукта (PHA-RPMI 1640) и с гидролизованным продуктом при трех концентрациях (0,10 и 1000 мкг/мл). Горизонтальные линии представляют геометрическую среднюю величину количеств в минуту по шести экспериментам, одинаково рассчитанную для каждого индивидуума.
Фиг. 2. Клиническая балльная оценка атопического дерматита (SCORAD) у каждого пациента и медиана балльной оценки для степени (А), интенсивности (В) и субъективной балльной оценки (С) атопического дерматита перед лечением (О) и через один месяц (Т) у грудных детей, получающих экстенсивно гидролизованную сывороточную композицию без Lactobacillus GG (WF) или такую же композицию с Lactobacillus GG (WF-GG).
Фиг. 3. Влияние казеина и казеина после разложения под действием Lactobacillus GG на выработку IL-4 и IFN- МКПК у пациентов с атопией (а, b) и у не страдающих атопией здоровых детей (с, d). Белые столбики представляют медиану выработки цитокина в контрольных культурах; черные столбики – в культурах, содержащих очищенный казеин; в заштрихованные столбики – в культурах, содержащих казеин после разложения под действием Lactobacillus GG. Взаимно пересекающиеся линии представляют верхние и нижние квартили. Статистически достоверное попарное сравнение с контрольными культурами.
Фиг. 4. Влияние s1-казеина и s1-казеина после разложения под действием Lactobacillus GG на выработку IL-4 и IFN- МКПК у пациентов с атопией (а, b) и у не страдающих атопией здоровых детей (с, d). Белые столбики представляют медиану выработки цитокина в контрольных культурах; черные столбики – в культурах, содержащих очищенный s1-казеин; и заштрихованные столбики – в культурах, содержащих s1-казеин после разложения под действием Lactobacillus GG. Взаимно пересекающиеся линии представляют верхние и нижние квартили. Статистически достоверное попарное сравнение с контрольными культурами.
Следующие примеры далее иллюстрируют изобретение. Описаны способы получения усовершенствованного гидролизата, а также эксперименты, показывающие благоприятный терапевтический эффект, наблюдающийся в настоящих исследованиях.
Экспериментальные исследованияПример 1. Подавление пролиферации лимфоцитов in vitro бычьими казеинами, гидролизованными ферментами, полученными из Lactobacillus GG. 1a. Гидролиз белков коровьего молока Общий казеин и компоненты казеина ( s1-казеин) очищали из коровьего молока (Syvaoja, 1992). Гидролиз ферментной смесью, полученной из Lactobacillus GG, применялся отдельно для казеина и s1-казеина. Ферменты выделяли с использованием модифицированного способа Exterkate и de Veer, 1985. Вкратце, ферменты высвобождались с помощью обработки ультразвуком замороженных бактериальных клеток. Надосадочную жидкость центрифугированных клеток отделяли и использовали для гидролиза казеина и s1-казеина. Гидролиз проводили в течение 24 ч при 34oC.
Полученные таким образом гидролизаты GG далее подвергали гидролизу пепсином и трипсином. Вкратце, сначала образцы подвергали гидролизу с использованием 0,1% пепсина в 0,1 моль/л HCl в течение 3 часов при 37oC, pH 2,5. После доводки pH с помощью 250 мг NaHCO3 и 2 моль/л NaOH в образцы добавляли 0,1% трипсин, и их подвергали гидролизу в течение 5 часов при 37oC, pH 8,0.
Образцы П/Т-казеина и П/Т-s1-казеина получали как описано выше только с использованием пепсина и трипсина с помощью гидролиза очищенного казеина и s1-казеина без гидролиза GG.
1.b. Тест трансформации лимфоцитовИспользовали модификацию микрометода определения вызванной митогеном трансформации лимфоцитов цельной крови. В качестве доноров крови для эксперимента использовали от шести до восьми здоровых лиц-добровольцев. Вкратце, гепаринизированную венозную кровь получали и разводили 1:7 питательной среды RPM1 1640 (Grand Island Biological CO. NY, USA), содержащей антибиотики. Фитогемагглютинин (ФГГА) (Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA) разводили RPM1 1640, содержащей антибиотики с диапазонами конечных концентраций в культурах от 5 до 1250 мкг/мл. Лиофилизированные гидролизаты казеина и s1-казеина разводили в RPM1 1640 до их конечных концентраций 0,1 мкг/мл (низкая), 10 мкг/мл (средняя) и 1000 мкг/мл (высокая) как доказано нетоксических для Т клеток в исследованиях исключения красителя с эозином.
Было проведено две серии экспериментов для исследования вызванных митогеном пролиферативных реакций мононуктоеарных клеток периферической крови (МКПК) на (А) казеин, гидролизованный пепсином и трипсином (= П/Т-казеин), (В) s1-казеин, гидролизованный пепсином и трипсином (=П/Т-s1-казеин), (С) П/Т-казеин, дополнительно гидролизованный ферментами, полученными из Lactobacillus GG, и (D) П/Т-s1-казеин, дополнительно гидролизованный ферментами, полученными из Lactobacillus GG.
Эксперименты состояли из четырех контрольных культур с различными разведениями питательной среды и митогена, а так же соответствующих испытуемых культур с 25 мкл гидролизованных продуктов в трех различных концентрациях. Количественное определение проводили, как описано у Sutas et al., 1996. Вызванная митогеном пролиферация МКПК выражалась в виде импульсов в минуту с исключением фона. Результаты были представлены для контрольных культур, содержащих 125 мкг/мл ФГА и RPM1 1640, и для трех испытуемых культур, содержащих 125 мкг/мл ФГА, и гидролизованные продукты в низкой, средней и высокой концентрациях.
1.с. Статистический анализДля сравнения изменения количества импульсов в минуту каждой из испытуемых культур с изменениями контрольных культур использовали непараметрический парный критерий (согласованный ранговый критерий Уилкоксона). Уровень достоверности был p<0,05. Статистически достоверные результаты парных сравнений были представлены, как подавление или стимуляция в соответствии со снижением или увеличением количеств импульсов в минуту в испытуемой культуре. 1.d. Результаты В экспериментах, проведенных с П/Т-казеином и с П/Т- s1-казеином, дополнительно гидролизованными ферментами, полученными из Lactobacillus GG, вызванная митогеном пролиферации МКПК была значительно подавлена при 0,1, 10 и 1000 мкг/мл (p = 0,03, p = 0,03 и p = 0,03) (фиг. 1C и 1D), в сравнении с П/Т-казеином и с П/T-s1-казеином (фиг. 1A и 1B).
Пример 2. Лечение грудных детей с атопическим дерматитом композицией белкового гидролизата с добавкой молочнокислых бактерий2а. Пациенты и структура исследования Исследование включало 31 грудного ребенка в возрасте от 2,5 до 15,7 месяцев (средний возраст 8 месяцев), отвечающих критериям Hanifin (Hanifin, 1987) атопической экземы у детей. Они были направлены в педиатрическую клинику на основании атопической экземы и подозрения на аллергию к коровьему молоку. Средний возраст в начале симптомов был 2,4 месяца. Общая продолжительность грудного вскармливания составила 5,9 месяцев. Наличие в семейном анамнезе заболеваний атопических заболеваний (астма, атопическая экзема и аллергический ринит) или пищевая аллергия у родственников первой степени была отмечена у 26 (84%) пациентов. Экзематозные поражения лечили смягчающими средствами и кортикостероидами для местного применения. Ни один пациент не получал системной кортикостероидной терапии. Кроме атопической экземы, у 9 пациентов (19%) наблюдались желудочно-кишечные расстройства, такие как частый жидкий стул, рвота или диарея. После периодов обследования пациентов подвергали двойному слепому плацебо-контролируемому исследованию с применением провокационной пробы с коровьим молоком. В окончательную популяцию исследования были включены только пациенты, имеющие положительную реакцию (27/31). Пациентов методом рандомизации на один месяц делили на две группы. Одна группа (WF, n = 14) получала экстенсивно гидролизованную сывороточную композицию (Valio Ltd, Helsinki, Finland, ЕР-А-601802) и другая группа (FW-GG, n = 13) получали такую же композицию с дополнительным препаратом Lactobacillus GG (5 x 10 Кое/г) (поставляемым Valio Ltd, Helsinki, Finland). По истечении одномесячной терапии композициями, назначаемыми их группе, обе группы в течение еще одного месяца получали экстенсивно гидролизованную сывороточную композицию (Valio Ltd). Перед пищевым воздействием у всех пациентов определяли общую концентрацию IgЕ в сыворотке, специфической IgЕ коровьего молока (радиоаллергосорбентный тест RAST, Pharmacia, Uppsala, Sweden) и с помощью прокола проводили кожную аллергическую пробу. Пробу с помощью прокола проводили на ладонной поверхности предплечья с использованием имеющегося в продаже аллергена коровьего молока ALK (Allergologisk Laboratorium, Horsholm, Denmark) и испытуемой композиции, разведенной до нормальной концентрации для кормления. Использовали ланцет длиной 1 мм с одним острием и козырьком для предотвращения проникновения (ALK) с применением в качестве положительного контроля гистамина дигидрохлорида 10 мг на миллилитр (ALK). Реакции определяли через 15 минут, и реакцию, составляющую половину и более размера реакции на гистамин, регистрировали как положительную при условии, что средний диаметр волдыря был по меньшей мере 3 мм, а отрицательный контроль в то же самое время составлял 0 мм. Перед началом лечения и через 1 (соответствующий периоду исследования) и 2 месяца брали образцы кала для определения -1 антитрипсина и TNF- (фактор опухолевого некроза).
Балльную оценку тяжести атопического дерматита проводили в соответствии с методом SCORAD, установленным European Task Force on Atopic Dermatitis (1993). Вкратце, степень (балльная оценка А) дерматита оценивали с использованием правила девяток. Интенсивность (балльная оценка В) дерматита представляла сумму отдельных балльных оценок (0-3) эритемы, отека и/или папул, экскориации, лихенификации и сухости. Субъективные (балльная оценка С) проявления (оцениваемые в баллах от 1 до 10), включая зуд и потерю сна, оценивались по оценкам родителей. SCORAD получали с помощью расчета: A/5+3.5 x В+С.
Протокол исследования был утвержден Обзорным комитетом по этике университетского госпиталя Тампере. У родителей получали информированное согласие.
2.b. Определение -1 антитрипсина в образцах калаЗамороженные образцы кала оттаивают при комнатной температуре и гомогенизируют. Приблизительно 1 г переносят в стеклянную трубку и лиофилизируют. Полученный в результате сухой материал измельчают и 50 мг переносят в трубку Ерреndorf. Добавляют один мл раствора 0,15 М NaCl и -1 антитрипсин экстрагируют с помощью энергичного смешивания во встряхивающем смесителе в течение 20 минут при комнатной температуре. Полученную в результате суспензию центрифугируют при 25000 g в течение 10 минут для удаления остатков органических веществ, и надосадочную жидкость используют для определения -1 антитрипсина с использованием нефелометра Behring BNA в соответствии с инструкциями производителя. Результаты представлены в виде мг/г сухой массы лиофилизированного кала.
2.с. Определение TNF- в образцах калаГлубоко замороженные образцы кала оттаивают при комнатной температуре, суспензируют 1: 1 (мас./об.) в физиологическом солевом растворе и дают выпасть в осадок. 0,5-1,0 мл надосадочной жидкости переносят в трубку Eppendorf и центрифугируют при 25000 g в течение 10 минут. Затем надосадочную жидкость используют для определения TNF- . Для определений TNF- в кале используют имеющийся в продаже набор для ферментной иммунопробы (Human TNF- ELISA Kit, Endogen Inc. , Boston, Massachusetts, USA) в соответствии с инструкциями для образцов сыворотки.
2.d. СтатистикаПо причине асимметричного распределения концентрации IgE в сыворотке, использовали логарифмическое (ln) преобразование, и данные представляли в виде средних величин с 95% доверительным интервалом (ДИ). Концентрации воспалительных параметров представлены медианами с нижней и верхней квартилями. При статистических сравнениях использовали согласованный ранговый критерий Уилкоксона и U-критерий Mann-Whitney. 2.с. Результаты 2.е.1. Клинические данные Результаты оценки тяжести атопического дерматита у каждого пациента перед началом лечения и через месяц, т.е. после периода исследования, представлены на фиг. 2. Перед лечением медиана (нижняя квартиль – верхняя квартиль) балльной оценки SCORAD составила 21 (14-31) в группе WF и 26 (17-38) в группе WF-GG (р = 0,33). У пациентов, получавших Lactobacillus GG, через месяц после вмешательства было значительное улучшение балльной оценки SCORAD (p = 0,008), но не у пациентов, получавших экстенсивно гидролизованную композицию без Lactobacillus GG (p = 0,89). Затем балльная оценка SCORAD в группе WF составила 19 (13-31) и в группе WF-GG 15 (7-28). Уменьшение балльной оценки SCORAD в группе WF-GG было вследствие снижения степени (балльная оценка A, p = 0,004), интенсивности (балльная оценка В, p = 0,05) и субъективной балльной оценки (балльная оценка C, p= 0,01) атопического дерматита (фиг. 2). В группе WF улучшение балльной оценки SCORAD было достигнуто за 2 месяца, а в группе WF-GG она оставалась неизменной после прекращения введения Lactobacillus GG. Через 2 месяца медиана (нижняя квартиль – верхняя квартиль) балльной оценки SCORAD составила 14 (2-38) в группе WF и 16 (6-25) в группе WF-GG. 2.е.2. Концентрация -1 антитрипсина и TNF- в калеУ здоровых пациентов контрольной группу (n = 9) медиана (нижняя квартиль – верхняя квартиль) концентрации -1 антитрипсина была 0,5 (0,5-1,7) мг/г. Перед лечением концентрации -1 антитрипсина была сравнима в группах WF и WF-GG (p = 0,22). Как показано в таблице 1, в течение одномесячного периода исследования концентрация -1 антитрипсина значительно снизилась в группе WF-GG (p = 0,33), но не в группе WF (p = 0,68). Через два месяца концентрация -1 антитрипсина в группе WF была 1,2 (0,5-1,6) и 0,5 (0,5-0,7) в группе WF-GG.
У здоровых пациентов контрольной группы концентрация TNF- в кале была 0(0-0,08) пкг/г. Концентрация TNF- в кале была значительно выше у детей с атопией, p>0,0001 (см. таблицу). Перед лечением концентрация TNF- была сравнима в группах WF и WF-GG (p = 0,57). Концентрация TNF- кале значительно снизилась в группе WF-GG (р = 0,003), но не в группе WF (p= 0,38) в течение одномесячного периода исследования (см. таблицу). Снижение концентрации TNF- было достигнуто за 2 месяца в группе WF, в то время как в группе WF-GG у пациентов, которым также вводили экстенсивно гидролизованную композицию без Lactobacillus GG, была выявлена тенденция к увеличению концентрации TNF-. Затем концентрация TNF- в группе WF была 84(25-129) и 144 (20-338) в группе WF-GG.
Пример 3. Подавляющая регуляция выработки цитокина мононуклеарными клетками периферической крови у детей с атопией3.а. Пациенты и методы Всего исследовали 14 пациентов в возрасте 5-29 (в среднем 16) месяцев, отвечающих критериям Hanifin (Hanifin, 1987) атопического дерматита и восемь подобранных по возрасту детей без атопии. Во время исследования ни один из них не получал системных кортикостероидов. Асцитическая жидкость, содержащая ОКТ3 (антитело против CD3) была любезно преподнесена доктором М.Kaartinen из Отделения бактериологии и иммунологии Хельсинского университета, Хельсинки, Финляндия. Общий коровий казеин очищают из коровьего молока, как описано Syvaoja (1992). Очищенный казеин гидролизуют ферментами, полученными из Lactobacillus GG, как описано в примере 1. Очищенный казеин или казеин после разложения под воздействием Lactobacillus GG лиофилизируют и хранят при комнатной температуре. Перед экспериментами их разводят RPM1 1640 и применяют стерилизационную фильтрацию (0,1 мкм, Millipore corporation, Bedford, MA, USA). Полный состав питательной среды включал RPM1 1640 с 10% плодной бараньей сыворотки, 10 мМ буфера Hepes, 2 mML-глютамина (Gibco Life Technologies, Paisley, UK), 50 ЕД/мл бензилпенициллина (Sigma, St. Louis, МО, USA), 10 мг/мл гентамицина (Roussel Laboratories Ltd, Uxbridge, Middlesex, UK). Получают периферическую венозную кровь (5 мл). МКПК, содержащие 90% лимфоидных клеток, выделяют с помощью градиентного центрифугирования на FicollPaque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) и суспендируют при концентрации 1 х 106 клеток/мл в полной питательной среде. Ячейки для культур предварительно покрывают асцитической жидкостью, содержащей антитело против CD3 в предварительно испытанном оптимальном разведении. Испытуемая культура дополнительно содержит разведение казеина или казеина после разложения под воздействием Lactobacillus GG в конечной концентрации 1 мг/мл. Эти эксперименты повторяют для очищенного бычьего s1-казеина или GG s1-казеина после разложения под воздействием Lactobacillus. Через 24 ч инкубации в увлажненной атмосфере 5% CO2 при 37oC надосадочную жидкость собирают и хранят при -70oC для количественных определений цитокина. IL-4 и IFN- в надосадочной жидкости культур определяют с помощью имеющихся в продаже наборов ELISA в соответствии с инструкциями производителя (IL-4; CLB, Compact Human lnterleukin-4 ELISA kit. Central Laboratory оf The Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam, The Netherlands; IFN-, EIFNG, Endogen Inc., Cambridge MA, USA). Результаты различных определений уравнивают с использованием сравнения стандартных кривых и выражают в виде пкг/мл. Чувствительность количественных определений IL-4 – 2,3 пкг/мл и IFN- – 5 пкг/мл. При сравнении испытуемых культур с контрольными культурами используют согласованный ранговый критерий Уилкоксона. Уровень достоверности – p<0,05.
3.b. Результаты в культурах, содержащих очищенный казеин, была сравнима с контрольными культурами, p = 0,10 и p = 0,10 (фиг. 3c, d). Аналогично данным, полученным у пациентов с атопией, выработка IL-4 в культурах, содержащих казеин, разложенного под воздействием Lactobacillus GG, была значительно меньше, чем в контрольных культурах, p = 0,01 (фиг. 3c), а выработка IFN- в этих культурах оставалась сравнимой с контрольными культурами, p = 0,50 (фиг. 3d). Аналогичные результаты были получены с s1-казеином и s1-казеином, разложенным под воздействием Lactobacillus GG (фиг. 4).
References1. European task force on atopic dermatitis. Severity scoring of atopic dermatitis: the SCORAD index. Dermatology 1993; 186: 23-31. 2. Exterkate F and de Veer G. Partial isolation and degradation of caseins by cell wall proteinase(s) of Streptococcus cremoris. Appl Environ Microbiol 1985; 49: 328-32. 3. Fargeas MJ, Theodorou V, More J, Wal JM, Fioramonti J, Bueno L. Boosted systemic immune and local responsiveness after intestinal inflammation in orally sensitized guinea pigs. Gastroenterology 1995; 109:53-62. 4. Hanifin JM. Epidemiology of atopic dermatitis. Monogr Allergy 1987; 21:116-131. 5. Isolauri E, Majamaa H, Arvola T, Rantala I, Virtanen E, Arvilommi H. Lactobacillus casei strain GG reverses increased intestinal permeability induced by cow milk in suckling rats. Gastroenterology 1993; 105:1643-1650. 6. Majamaa H, Isolauri E. Evaluation of gut mucosal barrier: evidence for increased antigen transfer in children with atopic eczema. J Allergy Clin Immunol 1996, in press. 7. Majamaa H, Miettinen A, Laine S, Isolauri E. Intestinal inflammation in children with atopic eczema: faecal eosinophil cationic protein and tumor necrosis factor-a as noninvasive indicators of food allergy. Clin Exp. Allergy 1996; 26:181-187. 8. Sampson НА, James MJ and Bernhisel-Broadbent J. Safety of an amino acid-derived infant formula in children allergic to cow milk. Pediatrics 1992; 90:463-465. 9. Sutas Y, Soppi E, Korhonen H, Syvaoja EL, Saxelin M, Rokka T, Isolauri E. Suppression of lymphocyte proliferation in vitro by bovine caseins hydrolyzed with Lactobacillus casei GG derived enzymes. J Allergy Clin Immunol 1996, in press. 10. Syvaoja EL. Quantitative determination of the main casein components and purification of as2– and k-casein from bovine milk. Milchwissenschaft 1992; 47:563-566е Формула изобретения
РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||
