Патент на изобретение №2173519

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУКТОРА УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К ГРИБКОВЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению биологических средств защиты растений, и касается способа получения индуктора устойчивости растений к грибковым заболеваниям. Индуктор устойчивости растений извлекают из культуральной жидкости гриба Sclerotinia sclerotiorum. Гриб выращивают глубинным способом на жидких питательных средах, содержащих минеральные и органические компоненты. Культуральную жидкость, содержащую экзогенный индуктор, отделяют центрифугированием от образовавшегося мицелия и очищают на анионите, например АРА-2р. Полученный центрифугат сорбируют на твердый сорбент, например активированный уголь, с последующей десорбцией органическим растворителем диметилсульфоксидом (ДМСО). Сорбент промывают ацетоном или хлороформом, вымораживают ДМСО из полученной смеси при температуре -20°С, затем выделяют фильтрацией на стеклянном пористом фильтре индуктор, который концентрируют и упаривают при 40°С примерно в 100 раз. Величина иммунного ответа при биотестировании индукторами, полученными из культуральных жидкостей гриба, выращенного для получения каждого индуктора на определенной питательной среде для семян подсолнечника, составила 32,8-62,2, для семян огурца – 29,3-60,3%. При полевых испытаниях семян подсолнечника, обработанных индукторами, полученными из культуральных жидкостей гриба, выращенного для получения каждого индуктора на определенной питательной среде, процент поражения корешков подсолнечника белой гнилью составил 20-29,1. 5 з. п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению биологических средств защиты растений, и может быть использовано в сельском хозяйстве, растениеводстве для получения экологически чистой продукции.

Известен способ профилактики болезней растений путем иммунизации семян индукторами устойчивости, представляющими собой физиологически активные вещества [1] . Однако данный способ не нашел широкого применения из-за низкой эффективности.

Известен способ иммунизации грибными метаболитами устойчивости озимой пшеницы к возбудителям корневой гнили [2]; однако указанный способ не нашел широкого применения из-за необходимости использовать большие объемы культуральной жидкости.

Известен способ индуцирования растений кукурузы к корневым гнилям и плесневению семян с помощью грибной вакцины-культуральной жидкости трех самых агрессивных почвенных фитопатогенов [3]. Однако указанный способ иммунизации не нашел широкого применения так же, как и в предыдущем случае, из-за необходимости использовать большие объемы культуральной жидкости.

Известен способ повышения устойчивости огурца к белой гнили, заключающийся в предпосевном замачивании семян огурца в культуральной жидкости гриба возбудителя белой гнили в течение 24 ч [4]. Но этот способ не нашел широкого применения из-за довольно продолжительной операции замачивания семян.

Предлагаемый способ получения индуктора устойчивости растений к грибковым заболеваниям предусматривает извлечение его из культуральной жидкости гриба – возбудителя белой гнили Sclerotinia sclerotiorum с помощью сорбента с последующей десорбцией индуктора органическими растворителями и концентрированием путем упаривания.

Наиболее близким по техническому решению является способ иммунизации растений огурца культуральной жидкостью гриба-возбудителя белой гнили путем замачивания семян в ней [4].

Пример 1. Для получения 100 л культуральной жидкости (КЖ) гриба Sclerotinia sclerotiorum в ферментере готовили жидкую минеральную среду, содержащую: MgSO₄ – 13 г, KCl – 14,9 г, NH₄NO₃ – 100 г, KH₂PO₄ – 68,0 г, ZnSO₄ 7H₂O – 1,13 г, MnSO₄ 7H₂O – 1,39 г, FeCl₃ – 400 мг, сахароза – 50 г. Стерилизация при 0,5 ати 30 мин. Стерильную среду, охлажденную до 22^oC, инокулировали 5 л посевной культуры Sclerotinia sclerotiorum, выращенной на питательной среде вышеприведенного состава в течение 5 суток в колбе на качалке при температуре 22^oC, 220 об./мин^-1. Выращивание проводили в течение 5 суток в ферментере. Содержимое ферментера центрифугировали при 4000 об. /мин^-1. Проводили очистку полученной КЖ на анионите АРА-2р в соотношении 10 л КЖ на 0,8 кг анионита. В очищенную культуральную жидкость (КЖ) вносили активированный уголь (АУ) из расчета 20 г АУ на 1 л КЖ, т.е. 2 кг, интенсивно перемешивали в течение 30 мин, оставляли на 5 ч, декантировали, твердую фазу подсушивали при температуре 305^oC до воздушно-сухого состояния, помещали на нутч-фильтр; проводили десорбцию, пропуская растворитель ДМСО (диметилсульфоксид) через осадок, из расчета 2,5 части растворителя на 1 часть десорбируемой массы на фильтре. Для полноты удаления ДМСО осадок на фильтре промывали хлороформом из расчета 5:1. Полученную смесь после фильтра помещали в морозильную камеру при температуре -20^oC до полной кристаллизации ДМСО, беловато-серые кристаллы которого отделяли фильтрованием на стеклянном пористом фильтре N 1 под вакуумом. Полученный фильтрат упаривали на роторном испарителе при 40^oC примерно в 100 раз, т.е. до 100 мл. Полученный сироп использовали для выявления активности индуктора устойчивости. Результаты приведены в табл. 1.

Пример 2. Для получения 100 л культуральной жидкости (КЖ) гриба Sclerotinia sclerotiorum в ферментере готовили жидкую питательную среду следующего состава:
Измельченные листья подсолнечника – 5 кг
Лимонная кислота – 500 г
Сахароза – 100 г
Вода – До 100 л
Среду стерилизовали в течение 40 мин при 0,5 ати (кгс/см²). Стерильную среду охлаждали до 22^oC, инокулировали 5 л посевной культуры Sclerotinia sclerotiorum, выращенной как описано в примере 1. Дальнейшие операции осуществляли, как описано в примере 1. Результаты выявления индуктора устойчивости приведены в табл. 1.

Пример 3. Для получения 100 л КЖ гриба Sclerotinia sclerotiorum в ферментере готовили жидкую питательную среду следующего состава: листья и стебли (измельченные) донника лекарственного – 5 кг, лимонная кислота – 500 г, сахароза – 100 г, вода – до 100 л. Далее все технологические проводили как описано в примере 1.

Пример 4. Для получения 100 л КЖ гриба Sclerotinia sclerotiorum в ферментере готовили жидкую питательную среду следующего состава: листья и стебли (измельченные) люцерны – 5 кг, лимонная кислота – 500 г, сахароза – 100 г, вода – до 100 л. Далее все технологические операции проводили, как описано в примере 1. Результаты опытов 3 и 4 представлены в табл. 1.

Пример 5. Для получения 5 л КЖ известным способом [4] выращивали возбудитель белой гнили Sclerotinia sclerotiorum на жидкой питательной среде состава, как описано в примере 1. Приготовленную минеральную среду разливали в колбы, стерилизовали 30 мин при 1 кгс/см², инокулировали мицелием гриба и помещали в термостат при 22^oC для поверхностного выращивания гриба. По истечении 5 суток выращивания отделяли образовавшуюся пленку от КЖ, а КЖ использовали для опытов. Результаты приведены в табл. 1.

Пример 6. Проводили биотестирование семян подсолнечника и огурца по схеме, как описано в примере 1. Проращивание обработанных семян проводили в течение 10 дней в условиях фитотрона при 281^oC и освещенности 50 тыс. лк и относительной влажности 90-100%.

Пример 7. Проводили полевые опыты по индуцированию устойчивости подсолнечника к белой гнили индуктором устойчивости с помощью индуктора, полученного по заявляемому способу. Опыты проводили в Краснодарском крае на естественном инфицированном фоне (зараженное поле). 20 кг семян подсолнечника обрабатывали раствором индуктора в сосуде-реакторе под давлением 2-2,5 кгс/см² в течение 20 мин. Обработанные семена подсушивали, загружали в мешки до высева. Схема проведения опыта и результаты наблюдений приведены в табл. 2.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет:
– получать концентрированный продукт, содержащий индуктор устойчивости, что дает возможность разработать товарную (коммерческую) форму препарата вместо использования нативной КЖ в больших объемах и не подлежащeй хранению;
– осуществить безотходную технологию получения индуктора устойчивости, т. к. все используемые для обработки КЖ компоненты могут использоваться многократно после регенерирования;
– нарабатывать препарат независимо от сезона года.

Список литературы
1. Шкаликов B.A. и соавт. Оценка физиологически активных веществ в защите зерновых культур от корневой гнили.- M., Известия ТСХА, 1993 г., вып. 4, с. 106-111.

2. Гаврилов A. A. Индуцированная грибными метаболитами устойчивость озимой пшеницы к возбудителям корневой гнили.- Автореферат диссертации на соискание канд. биол. наук, М., 1993 г.

3. Сокирко В.П. Создание индуцированной устойчивости у растений кукурузы к корневым гнилям и плесневению семян с помощью грибной вакцины/Cб. Защита с/х культур от вредителей, болезней, сорняков (Труды Кубанского СХИ), Краснодар, 1990 г., вып. 307 (335), с. 30-37.

4. Переверзева В.Ф. Особенности белой гнили на огурцах и биологические меры борьбы с белой гнилью в закрытом грунте.- Автореферат диссертации на соискание канд. биол. наук, Минск, 1989 г.

Формула изобретения

1. Способ получения индуктора устойчивости растений к грибковым заболеваниям, включающий выращивание гриба-возбудителя болезни на жидкой питательной среде, иммунизацию растений индуктором, выделяющимся в культуральную жидкость, отличающийся тем, что выращивание возбудителя болезни ведут глубинным способом на жидких питательных средах, содержащих минеральные или органические компоненты, культуральную жидкость, содержащую экзогенный индуктор, отделяют от образовавшегося мицелия, очищают на анионите, сорбируют на твердый сорбент с последующей десорбцией органическими растворителями и концентрируют упариванием.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что глубинное выращивание гриба-возбудителя болезни, например Sclerotinia sclerotiorum, ведут на жидкой питательной среде, содержащей органические компоненты: измельченные растения подсолнечника, или донника лекарственного, или люцерны в количестве 50 г в литре среды, лимонную кислоту в количестве 5 г в литре среды, сахарозу в количестве 1 г в литре среды.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что отделение мицелия от культуральной жидкости ведут центрифугированием, очистку проводят с помощью анионита, например, APA-2p, а последующую сорбцию индуктора осуществляют с помощью твердого сорбента, например активированного угля, в соотношении 1 : 50 с последующим удалением влаги высушиванием до воздушно сухого состояния.

4. Способ по любому из пп.1 – 3, отличающийся тем, что десорбцию индуктора ведут с помощью органического растворителя диметилсульфоксида (ДМСО) с последующей промывкой сорбента ацетоном или хлороформом и вымораживанием ДМСО из полученной смеси при температуре ниже температуры замерзания ДМСО, отделением кристаллов ДМСО от жидкой фракции, содержащей индуктор и растворитель, фильтрацией на стеклянном пористом фильтре.

5. Способ по любому из пп.1 – 4, отличающийся тем, что концентрирование индуктора устойчивости осуществляют удалением органического растворителя упариванием.

6. Способ по любому из пп.1 – 5, отличающийся тем, что оценку иммунного ответа определяют на проростках подсолнечника, для чего семена предварительно выдерживали под давлением в течение 20 мин в растворе индуктора, а выросшие проростки инокулировали возбудителем болезни.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 01.07.2004

Извещение опубликовано: 27.04.2005 БИ: 12/2005