Патент на изобретение №2173342

Published by on




РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ



ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(19) RU (11) 2173342 (13) C1
(51) МПК 7
C12N1/20, A61K39/07
C12N1/20, C12R1:07
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

Статус: по данным на 17.05.2011 – действует

(21), (22) Заявка: 2000101576/13, 19.01.2000

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

19.01.2000

(45) Опубликовано: 10.09.2001

(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске:
Дукалов И.А., Уралева В.С. Сибирская язва. Диагностика особо опасных и малоизвестных инфекций, из-во Ростовского университета, 1970. US 5840312, 24.11.1998. FR 2676068, 06.11.1992.

Адрес для переписки:

610000, г.Киров-Центр, Октябрьский пр-кт, 119, НИИМ МО РФ, начальнику

(71) Заявитель(и):

Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ

(72) Автор(ы):

Сероглазов В.В.,
Кожухов В.В.,
Амосов М.Ю.,
Строчков Ю.И.

(73) Патентообладатель(и):

Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ

(54) СИБИРЕЯЗВЕННЫЙ ВАКЦИННЫЙ ШТАММ СТИ-ПР-4 С РАСШИРЕННЫМ СПЕКТРОМ АНТИБИОТИКО-РЕЗИСТЕНТНОСТИ


(57) Реферат:

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для конструирования антибиотико-резистентных вакцинных препаратов, используемых для профилактики сибиреязвенной инфекции на фоне антибиотикотерапии. Сибиреязвенный штамм СТИ-ПР-4 резистентен к современным средствам экстренной профилактики: доксициклину, пефлоксацину, рифампицину, ампициллину, налидиксовой кислоте и не уступает по показателям иммуногенности штамму СТИ-1, на основе которого он получен. 6 табл.


Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения генетически измененных вариантов сибиреязвенного вакцинного штамма с расширенным спектром антибиотико-резистентности и сохранением основных биологических свойств штамма СТИ-1.

Недостатком известных штаммов является отсутствие устойчивости к препаратам хинолонового ряда, а у штамма СТИ-ПР-3 и к доксициклину. В настоящее время эти антибиотики используются в качестве основных препаратов при проведении экстренной неспецифической профилактики различных инфекционных заболеваний, в том числе и сибирской язвы.

Задачей изобретения является получение нового полиантибиотико-резистентного штамма на основе сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ-1, обладающего резистентностью, прежде всего к современным средствам экстренной профилактики: доксициклину и пефлоксацину, а также другим антибиотикам, к которым чувствителен сибиреязвенный микроб: рифампицину и пенициллинам, и не уступающего по показателям иммуногенности родительскому штамму СТИ-1.

Решение задачи достигается путем последовательного расширения спектра антибиотикоустойчивости культуры штамма СТИ-1 под контролем стабильности данного признака и полноразмерности генов токсинообразования при нескольких последовательных пересевах на плотной питательной среде в отсутствии селективного давления.

Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими, иммунобиологическими и биохимическими признаками.

Культуральные свойства.

Факультативный аэроб. Оптимальная температура роста на агаре и бульоне (361)oC, оптимум pH среды (7,40,2). На питательном агаре образует колонии R, реже RO- и O-форм. Дочерних колоний не образует. На бульоне дает хлопьевидный, легко разбивающийся осадок в виде кусочка ваты, на поверхности – тонкую узкую пристеночную пленку, бульон остается прозрачным, на сывороточных средах и в организме животных капсул не образует. При культивировании на искусственных питательных средах в течение первых двух суток бациллы находятся в вегетативной форме, а при более длительном – переходят в споровую.

Морфологические свойства.

Существует в двух морфологических формах: вегетативной – бескапсульной и споровой. Споры, окрашенные по Цилю-Нильсену, имеют овальную форму размером (1,3-1,5х0,7-0,9) мкм, розового цвета с красным ободком по периферии.

Грамположительные палочки в мазках с жидких и твердых питательных сред располагаются в виде длинных цепочек, в местах их соединения выглядят обрубленными или слегка вогнутыми, напоминая бамбуковую трость. Размеры палочки: длина 3-8, иногда до 10 мкм, ширина – 1-1,5 мкм. Жгутиков не имеют.

Токсигенные свойства.

При подкожном введении 250 млн.спор белым мышам гибель животных может достигать 70% и более в течение 2-7 сут.

Биохимические свойства.

Разлагает глюкозу, трегалозу, мальтозу, маннозу, инозит, сахарозу, крахмал, галактозу.

Продуцирует ДНК-азу, каталазу.

В качестве исходного (реципиентного) был использован штамм B.anthracis СТИ-1, использующийся в настоящее время для производства живой сухой сибиреязвенной вакцины.

Предварительно у штамма СТИ-1 был определен уровень чувствительности к различным наиболее употребляемым в настоящее время для лечения сибирской язвы антибиотикам: ампициллину (Amp); доксициклину (Dox); рифампицину (Rif); пефлоксацину (Pef); налидиксовой кислоте (Nal). У реципиентного штамма выявлены единичные клетки популяции бацилл, устойчивые к 5 мкг/мл Rif. К остальным антибиотикам культура штамма СТИ-1 была чувствительна.

В связи со сложностью прямого получения спонтанного мутанта, резистентного к представителю фторхинолонового ряда антимикробных препаратов – пефлоксацину, первоначально был получен вариант, устойчивый к налидиксовой кислоте. Из полученного варианта (Nalr) пересевами на плотной питательной среде был получен вариант, устойчивый к пефлоксацину (минимальная подавляющая концентрация (МПК) более 100 мкг/мл).

На следующем этапе получения полиантибиотико-резистентного штамма из популяции (Nalr, Pef) варианта выделен стабильный спонтанный мутант, устойчивый к 50 мкг/мл рифампицина. Резистентность к препарату тетрациклинового ряда – доксициклину была получена методом конъюгации транспозона Tn 916 от штамма B.subtilis в (Nalr, Pefr, Rifr) вариант штамма СТИ-1 с использованием пефлоксацина в качестве препарата контрселекции. Минимальная подавляющая концентрация (МПК) варианта по доксициклину составила 2,5 мкг/мл.

Для наведения устойчивости к ампициллину использовали высев на плотную питательную среду (ППС) с возрастающими концентрациями антибиотика (Nalr, Pefr, Rifr, Doxr) варианта штамма СТИ-1, при этом посевная доза споровой суспензии для предотвращения появления ложноположительных результатов не превышала 1107… 4107 спор на чашку Петри. МПК у полученного варианта составила 20 мкг/мл, что заведомо превышает достижимые в крови концентрации данного антибиотика.

Полученный вариант (СТИ-ПР-4) при проверке полноценности и стабильности детерминант токсинообразования (pag, lef, cya) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) не отличался от эталонной культуры исходного штамма.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. Описание основных биологических свойств штамма СТИ-ПР-4 в сравнении с исходным штаммом СТИ-1.

Из представленных в таблице 1 данных видно, что основные культурально-морфологические свойства полученного штамма не отличались от свойств эталонной культуры исходного штамма.

Пример 2. Резистентность к антибиотикам и ее стабильность после 5 пересевов на плотной питательной среде (ППС) в отсутствии селективного давления антибиотиков.

Из представленных в таблице 2 данных видно, что уровни устойчивости у полученного штамма значительно выше, чем у исходного родительского штамма СТИ-1.

Из данных, представленных в таблице 3, видно, что полученный штамм после 5 пересевов в отсутствии селективного давления химиопрепаратов при клоновом анализе полностью сохранил уровни антибиотико-резистентности.

Пример 3. Определение иммунобиологических свойств штамма СТИ-ПР-4.

Из представленных в таблице 4 данных видно, что штамм СТИ-ПР-4 сохранил высокие иммуногенные свойства штамма СТИ-1.

Данные, представленные в таблице 5, показывают, что подкожное введение 250 млн. спор кроликам не вызвало ни у одного из них подъема температуры более чем на 1oC и падения массы тела более чем на 10% от исходных показателей. Таким образом все экспериментальные серии штамма СТИ-ПР-4 безвредны.

Пример 4. Получение споровых культур сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ-ПР-4 способом глубинного культивирования.

Из данных, представленных в таблице 6, следует, что нативная культура генетически измененного штамма, полученная при глубинном культивировании, по основным показателям качества не отличается от нативных культур эталонного вакцинного штамма СТИ-1.

Таким образом, полученный вакцинный полиантибиотико-резистентный штамм СТИ-ПР-4 обладает множественной (Rifr, Ampr, Doxr, Pefr, Nalr) лекарственной устойчивостью, что позволяет конструировать на его основе антибиотико-резистентные вакцинные препараты для профилактики сибирской язвы на фоне проведения неспецифической экстренной профилактики.

Формула изобретения


Сибиреязвенный вакцинный штамм СТИ-ПР-4 с расширенным спектром антибиотико-резистентности, резистентный к современным средствам экстренной профилактики: доксициклину, пефлоксацину, рифампицину, ампициллину и налидиксовой кислоте.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6


PC4A Государственная регистрация перехода исключительного права без заключения договора

(73) Патентообладатель(и):

Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации

(73) Патентообладатель:

Федеральное государственное учреждение “48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации”

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 08.06.2010 № РП0000819

Извещение опубликовано: 20.07.2010 БИ: 20/2010


Categories: BD_2173000-2173999