Патент на изобретение №2173169

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИВАЛЕНТНОЙ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ БРУЦЕЛЛЕЗНОЙ СЫВОРОТКИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано в производстве поливалентной диагностической бруцеллезной сыворотки. Проводят однократную внутривенную иммунизацию кроликов смесью вакцинных штаммов Brucella melitensis Rev-1, Brucella abortus 19 и Brucella suis 61 в дозе 210⁹ КОЕ/мл каждого штамма в объеме 1 мл, обескровливают животных через 2 недели после окончания иммунизации, инактивируют сыворотку и добавляют фенол в качестве консерванта. Изобретение позволяет ускорить процесс получения готового препарата и увеличить биологическую безопасность этого процесса при достижениии высоких значений чувствительности получаемого препарата.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в производстве поливалентной диагностической бруцеллезной сыворотки.

Известен способ получения поливалентной диагностической бруцеллезной сыворотки Одесского предприятия по производству бактерийных препаратов МЗ СССР (Регламент производства сыворотки диагностической бруцеллезной агглютинирующей сухой N 273-82, утв. ГУ по производству бактерийных и вирусных препаратов МЗ СССР, 08.04.92; ТУ-316-82 от 01.06.82., утв. ГУ по производству бактерийных и вирусных препаратов МЗ СССР).

По этому способу иммунизируют крупный рогатый скот в возрасте от 2 до 5-6 лет, при этом используют некастрированных самцов-продуцентов.

До начала иммунизации животных выдерживают в течение 1 месяца на карантине, после чего проводят грунд-иммунизацию путем однократного введения 10 мл бруцеллезного антигена подкожно и через 1 месяц после этого приступают к иммунизации.

Иммунизацию осуществляют в 2-4 цикла с интервалами 20-30 суток. В течение одного цикла проводят 5 ежедневных инъекций антигена с объемами 10, 15, 20, 30, 40 мл антигена.

По окончании цикла иммунизации на 10-й день после последней инъекции берут контрольную пробу крови для постановки реакции агглютинации. При наличии титра не ниже 1:3200 проводят кровопускание.

Для иммунизации животного применяют антигены, инактивированные нагреванием при температуре 60^oC в течение 2 часов с последующим добавлением карболовой кислоты и выдерживанием при 37^oC 48 часов. Антигены представляют собой взвеси культур Brucella abortus 544, Brucella melitensis 16-М, Brucella suis 1330 (референтные штаммы).

Недостатками способа являются длительность, трудоемкость процесса и высокая себестоимость конечного препарата, а также риск заражения людей, занятых в производстве.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения поливалентной гипериммунной сыворотки к бруцеллам с использованием штаммов Brucella melitensis И-297 и Brucella abortus 146 (Пат. РФ N 2005781, C 12 N 1/20, A 61 К 39/10, от 15.01.94, Бюл. N 1).

Способ осуществляется следующим образом.

Кроликов породы Шиншилла массой 2,5-3 кг иммунизируют взвесью живых клеток в 0,85%-ном растворе натрия хлорида 48-часовой агаровой культуры бруцелл штаммов Brucella melitensis N И-297 и Brucella abortus 146. Животным вводят подкожно трехкратно в четыре точки спины вдоль позвоночника 0,5 мл (2 x 10⁹ микробов), 0,75 мл (3 x 10⁹ микробов), 1,0 мл (4 x 10⁹ микробов) смеси в равных количествах культур с равным объемом полного адъюванта Фрейнда с недельным интервалом. Через две недели после последней инъекции вводят подкожно в область внутренней верхней трети поверхности бедра 1,0 мл (4 x 10⁹ микробов) смеси культур в 0,85% растворе натрия хлорида. Через 14 дней после окончания иммунизации кроликов обескровливают. Сыворотку инактивируют прогреванием при 56^oC в течение 30 минут и добавлением мертиолята натрия 1:10000. Специфический титр сыворотки при ИФА составляет 1:1827889 155817.

Недостатком прототипа является длительность и трудоемкость получения сыворотки, большой расход культур и риск заражения людей, занятых в производстве.

Целью изобретения является ускорение процесса получения и снижение стоимости готового препарата при достижении достаточно высоких значений его чувствительности, а также увеличение биологической безопасности процесса.

Поставленная цель достигается тем, что способ включает однократную внутривенную иммунизацию кроликов смесью вацинных штаммов Brucella melitensis Rev-1, Brucella abortus 19 и Brucella suis 61 в дозе 2 x 10⁹ КОЕ/мл каждого штамма в общем объеме 1 мл, обескровливание животных через 2 недели после окончания иммунизации с последующей инактивацией сыворотки и добавлением в качестве консерванта фенола.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Использование смеси трех вакцинных штаммов обеспечивает увеличение биологической безопасности процесса производства.

Внутривенная однократная иммунизация животных обеспечивает ускорение процесса получения и снижение себестоимости препарата за счет активизации процесса генерации специфических антител благодаря быстрому распространению иммунизирующего агента током крови и доставке его к органам, ответственным за выработку антител и снижения расхода культуры и питательных сред на процесс иммунизации.

Заявляемое количество иммунизирующего агента 2 x 10⁹ КОЕ/ мл в общем объеме 1 мл при внутривенной однократной инъекции необходимо и достаточно для получения высокочувствительной сыворотки.

Возможность практического осуществления заявляемого способа подтверждается примером конкретного его выполнения.

Кроликов породы Шиншилла массой 2,5-3 кг иммунизируют взвесью живых клеток в 0,85% растворе натрия хлорида 48-часовой агаровой культуры бруцелл штаммов Brucella suis 61, Brucella melitensis Rev-l, Brucella abortus 19. Животным вводят смесь в дозе 2 x 10⁹ каждого штамма в общем объеме 1 мл внутривенно в краевую вену уха. Через 14 суток проводят эксфузию крови. Сыворотку инактивируют прогреванием при 56^oC в течение 30 минут и добавляют фенол до конечной концентрации 0,35-0,4%. Через 24-48 часов проверяют титр сыворотки, отсутствие специфического роста (бактериологический и биологический контроль стерильности препарата), после чего разливают по ампулам и лиофилизируют. Полученная поливалентная агглютинирующая сыворотка бесцветная, слегка опалесцирующая, обладает высокой активностью и специфичностью. Хранится при температуре 4^oC в лиофилизированном виде в запаянных ампулах. Специфический титр сыворотки в развернутой реакции агглютинации составляет 1: 1600 – 1:3200. При постановке реакции агглютинации на стекле просветление капельки суспензии наступает в течение 3-5 минут с образованием ясно видимых хлопьев агглютинации.

Таким образом, заявляемый способ имеет значительные преимущества перед известным по трудоемкости, себестоимости и биологической безопасности производства при достижении высоких титров готового препарата.

Формула изобретения

Способ получения поливалентной диагностической бруцеллезной сыворотки, включающий иммунизацию кроликов смесью штаммов видов рода Brucella, обескровливание животных через две недели после окончания циклов иммунизации с последующей инактивацией сыворотки и добавлением консерванта, отличающийся тем, что иммунизацию проводят смесью вакцинных штаммов Brucella melitensis Rev-1, Brucella abortus 19 и Brucella suis 61 внутривенно, однократно, в дозе 210⁹ КОЕ/мл каждого штамма, в общем объеме 1 мл, а в качестве консерванта используется фенол.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 28.07.2004

Извещение опубликовано: 20.01.2006 БИ: 02/2006