Патент на изобретение №2172956

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТЯЖЕЛЫХ ФОРМ ИНФЕКЦИОННОГО МОНОНУКЛЕОЗА, ВЫЗВАННОГО ВИРУСОМ ЭПШТЕЙНА-БАРР, У ДЕТЕЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и касается способа диагностики тяжелых форм инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барра у детей. Способ включает в себя определение специфических иммунных комплексов с данным ДНК-содержащим вирусом по увеличению активности экзогенного комплемента при одновременном внесении его в реакцию со специфическими антителами (СИК-1) или вирусом Эпштейна-Барра (СИК-2) с дальнейшим расчетом активности иммунных комплексов по формуле и дифференцируют тяжелые формы от легких по наличию в крови специфических иммунных комплексов по коэффициенту СИК-1 или СИК-2. 2 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике инфекционных заболеваний у детей и взрослых.

Сложность клинической диагностики вызванного вирусом Эпштейна-Барра (ВЭБ) инфекционного мононуклеоза, связанная с полисиндромностью течения заболевания, и трудности ранней дифференциальной диагностики данной инфекции среди групп заболеваний с синдромом тонзиллита и мононуклеозоподобным синдромом резко повышает актуальность лабораторной диагностики этой нозологической формы, особенно при ее тяжелом течении.

Частое сочетание этой инфекции с другими острыми вирусными и бактериальными инфекциями, неоднозначность прогноза перехода первичной инфекции в хроническую форму, наряду со связью ВЭБ с рядом онкологических заболеваний создают особую важность разработки оригинальных лабораторных приемов диагностики данной инфекции.

Кроме того, предлагаемыми способами, определяющими вирусные АГ-ны или АТ-ла, не удается определить специфические иммунные комплексы (СИК).

Наиболее близким к предлагаемому способу является “Способ дифференциальной диагностики различных форм ДНК-вых инфекций” (Аксенов О.А., Осипова 3.А. , патент на изобретение N 10121683 от 10 ноября 1998 г.). По прототипному способу определяют в количественной ферментной реакции связывания комплемента AT подклассов Ig М и Ig G 1-2, 3 и 4 и по их соотношению дифференцируют первично острую фазу инфекции, а также повторное обострение и хронизацию процесса. Способ позволяет в течение 12-18 часов дифференцировать эти фазы инфекции. Однако недостатком этого способа является невозможность установления диагноза на этапе отсутствия AT у больного, т.е. на самом раннем этапе инфекции.

Этот недостаток устраняется в предлагаемом способе.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что для прогноза тяжести течения инфекционного мононуклеоза и этиологической диагностики тяжелых форм данной инфекции, когда свободные AT еще не образовались в достаточном количестве, в крови больных определяют специфические иммунные комплексы по увеличению активности экзогенного комплемента (более 0,20 о.е.) при одновременном внесении его в реакцию со специфическими антителами или вирусом Эпштейна-Барр и по соотношению комплексов с полным или неполным связыванием антигена дифференцируют тяжелые и легкие формы инфекционного мононуклеоза. С помощью количественной реакции связывания комплемента определяют два вида СИК – комплекс с надостаточной инактивации антигенных детерминант вируса (СИК 1 типа) и комплекс с полной инактивацией, но слабой авидностью связи вирусных антигенов со специфическими ранними AT (СИК 2 типа). СИК 1 типа, отражающий недостаточный иммунный процесс, ведущий к неполной инактивации вируса, менее зависим от длительности инфекционного процесса, а более отражает тяжесть течения заболевания. Поэтому наличие СИК данного типа позволяет прогнозировать большую тяжесть процесса при дальнейшем течении заболевания.

Способ осуществляли следующим образом. Сыворотки обследованных больных соединяли со стандартной антисывороткой к ВЭБ или антигенами вируса Эпштейна-Барр любого происхождения (специально приготовленные или в виде сыворотки больного острого периода, содержащего достоверное количество подтвержденного антигена этого вируса). К таким системам добавляли две дозы стандартного комплемента, а спустя час контакта гемолитическую систему – 0,85% взвесь бараньих эритроцитов и 10 доз антисыворотки к ней. Учет опыта проводили по наступлению гемолиза в контролях исследуемой сыворотки без внесения специфических антител или вирусных антигенов с помощью количественного выявления оксидазных ферментов в реакции с 0,1% раствором ортофенилендиамином и перекисью водорода. Реакцию останавливали 1 N H₂SO₄. Количество фермента оценивали на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01C при длине волны 492 нм. Активность СИК-1 рассчитывали в опыте с внесением специфических антител на первом этапе: а СИК-2 в опыте с внесением антигена ВЭБ по формуле
СИК (1,2)=(Кк-Коп)/Кк,
где Кк- количественный показатель ферментов в контроле исследуемой сыворотки, Коп – то же в опытной пробе.

При расчете этой формулы за минимальное содержание СИК принимали величину > 0,10.

При стандартной постановке реакции связывания комплемента для определения свободных антител или антигенов концентрация свободных белков комплемента резко снижается, что показывает наличие указанных ингредиентов в исследуемой жидкости. Предлагаемый в заявляемом способе метод определения специфических иммунных комплексов основан на противоположном результате – увеличении активности комплемента по сравнению с контролями после добавления к исследуемой пробе специфических антител или антигенов и низкой дозы экзогенного комплемента. Это усиление основано на феномене расщепления уже имеющегося в пробе раннего иммунного комплекса при внесении более овидных антител или большой концентрации антигена.

В этом случае при перемешении антител на вновь вносимые ингредиенты эндогенный комплемент, находящийся в специфическом иммунном комплексе, выходит в раствор в форме отдельных белков системы комплемента, что выявляется по увеличению гемолиза при постановке способа. Если в пробу вносились высокоовидные антитела, то усиление комплементарной активности соответствовало содержанию в ней СИК-1 – комплекса с неполной инактивацией вируса с превалированием АГ над АТ-ными эпитопами вируса. При внесении в исследуемую пробу АГ-ов вируса ВЭБ в значительной концентрации усиление комплементарной активности соответствовало наличию СИК-2 – комплекса с превалированием AT над АГ-нами.

Т.к. известно, что свободные AT появляются достаточно поздно, совершенно очевидно, что на раннем этапе инфекционного мононуклеоза в свободной циркуляции в кровяном русле первыми должны быть специфические иммунные комплексы. Учитывая длительный инкубационный период (3-7 недель), очевидно, что в первые дни заболевания при благоприятном течении процесса в крови должны циркулировать СИК-2 – комплексы с полной инактивацией вируса и полным насыщением антителами. При неблагоприятном течении процесса этого быть не должно и комплекс должен относиться к типу СИК-1, где антигенные детерминанты вируса не полностью закрыты АТ-ми и неинактивированные антигенные эпитопы отчетливо преобладают над AT.

С другой стороны, при большой концентрации иммунных комплексов (СИК-2), выявляемой в данном способе по величине усиления активности комплемента, клиническое течение заболевания также может быть достаточно тяжелым в связи с невозможностью организма полноценно элиминировать такое большое количество комплексов -СИК. Т. о. , степень клинических проявлений зависит от качественного состава специфического иммунного комплекса и его количественной характеристики.

Заявляемый способ позволяет с достаточной степенью вероятности проводить прогноз течения инфекционного мононуклеоза. Более тяжелые случаи развиваются при тестировании в крови больных СИК -1 > 0,10 о.е. или СИК-2 > 0,2. При таких показателях у больных тяжесть состояния связана с большей выраженностью симптомов интоксикации, проявляющихся более длительное время (табл. 1 и 2). У этих больных имеет место большая длительность гипертермии. При указанных показателях выявляются большие величины гепато- и спленомегалии, как отражение характерного для инфекционного мононуклеоза лимфорпролиферативного синдрома. Длительность интоксикации составляла 4,7-4,9 дня, температуры – 4,9-6,2, увеличение печени достигало 1,36-2,3 см ниже реберной дуги, а селезенки – 0,21-0,89 см ниже реберной дуги.

Доказательством истинности предлагаемого способа в отношении определения прогноза течения ИМ явилось подтверждение этого положения посредством определения у больных количества атипичных мононуклеаров крови, характеризующих тяжесть инфекционного процесса при данной инфекции, и уровня – ИФ сыворотки, являющегося основным ингибитором репродукции вируса. Для больных из группы с тестированием AT без иммунных комплексов характерны низкие показатели атипичных мононуклеаров – 0,28-0,53х10х6, а при наличие комплексов особенно СИК-1 эти показатели составили 1,36-1,67х10х6. Концентрация -ИФ при более тяжелых формах и определении СИК-1 и СИК-2 (> 0,2) была минимальна-3,9-4,5 МЕ/мл крови, а при наличие свободных AT она была достоверно выше -5,1-12,2 МЕ/мл.

Таким образом выявление при инфекционном мононуклеозе специфических иммунных комплексов типа СИК-1 с превалированием АГ, а также циркуляция в крови СИК-2 в высокой концентрации означает недостаточный иммунный ответ, заключающийся либо в пониженной антителообразующей активности плазмоцитов, либо в сниженной способности фагоцитов захватывать и удалять нормально образующиеся иммунные комплексы. Блокада плазмоцитов связана с инфицированием их предшественников – В-лимфоцитов вирусом Эпштейна-Барр. Блокада фагоцитов связана с повышенной концентрацией основного противовоспалительного лимфокина ИЛ-10, характерной для данной инфекции. Все это естественно ведет к утяжелению клинической картины инфекционного мононуклеоза.

Клинические примеры. Пример 1.

Розова Елена 14 лет поступила на 4 день остро начавшегося заболевания с д-зом: Дифтерия зева? Инфекционный мононуклеоз. При поступлении состояние средней тяжести, вялая, жалуется на боли в горле. Температура – 39,0. Носовое дыхание сохранено. В зеве пленчатые желтоватые налеты, за пределы миндалин не распространяются. Верхнепереднешейные лимфатические узлы до 2 см, заднешейные – до 1,5 см, без отека над ними. Живот мягкий, безболезненный. Печень пальпируется на 1 см ниже реберной дуги, селезенка не увеличена. В клиническом анализе крови при поступлении атипичные мононуклеары составляют 8% от лейкоцитов крови. Уровень гетерофильных AT в реакции Пауль-Буннеля – 1/16. Уровень СИК ВЭБ 2 типа – 0,12.

В дальнейшем общая длительность температуры составила 3 дня, симптомы интоксикации сохранялись 4 дня. Размеры печени нормализовались через 3 дня и девочка была выписана с выздоровлением на 12 день болезни.

Пример 2. Лебедев Артем, 7 лет поступил на 6 день остро начавшегося заболевания с диагнозом – эпидемический паротит. При поступлении состояние тяжелое, вялый. Отмечается пастозность лица. Температура 38,5. Носовое дыхание резко затруднено. Зев гиперемирован, миндалины увеличены до III степени, на миндалинах единичные точечные белые налеты. Передне- и заднешейные лимфатические узлы спаяны в пакеты. Печень увеличена до 6 см ниже реберной дуги, селезенка увеличена до 10 см ниже реберной дуги. В клиническом анализе крови атипичные мононуклеары составляли 44% лейкоцитов. Гетерофильные AT в реакции Пауль-Буннеля составили 1/128. Уровень СИК 2 типа -0,15.

В дальнейшем общая длительность температуры составила 10 дней, симптомы интоксикации сохранялись 12 дней. К выписке на 25 день болезни печень пальпировалась на 2 см ниже реберной дуги, селезенка на 5 см ниже реберной дуги. Ребенок был выписан с улучшением под наблюдение районной поликлиники.

Заявляемый способ был опробирован на 170 больных с первичным инфекционным мононуклеозом. При постановке способа (СИК-1 + СИК-2 > 0,2) спрогнозировано 34% тяжелых форм инфекционного мононуклеоза. При окончательной выписке больных из стационара тяжелые формы составили 32% (p< 0,001).

Формула изобретения

Способ диагностики тяжелых форм инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барра, у детей путем определения иммунных комплексов, отличающийся тем, что в крови больных определяют специфические иммунные комплексы с данным ДНК-содержащим вирусом по увеличению активности экзогенного комплемента при одновременном внесении его в реакцию со специфическими антителами (СИК-1) или вирусом Эпштейна-Барра (СИК-2) с дальнейшим расчетом активности иммунных комплексов по формуле
СИК (1,2) = (К_к-К_оп)_хК_к,
где К_к – количественный показатель фермента в контроле исследуемой сыворотки;
К_оп – то же в опытной пробе,
и дифференцируют тяжелые от легких форм инфекционного мононуклеоза по наличию в крови специфических иммунных комплексов СИК-1 более 0,10 относительных единиц или СИК-2 более 0,20 относительных единиц.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 27.01.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 11-2003

Извещение опубликовано: 20.04.2003