Патент на изобретение №2172138

(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ПО В.Г. ВОРОБЬЕВУ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики опухолевых и неопухолевых заболеваний человека. Способ заключается в том, что перед нанесением на подготовленное предметное стекло исследуемый материал помещают в культуральную среду с добавлением антикоагулянта, отмывают oт ненужных примесей путем 3 – 5 мин отстаивания и удаления крупных частиц с последующими разведениями отобранной клеточной взвеси в свежих порциях культуральной среды, готовят несколько проб с заданной концентрацией клеточных элементов и проводят естественную седиментацию клеток на предметное стекло. Полученные таким способом препараты высушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают по унифицированной методике. Способ позволяет повысить точность и информативность результатов цитологического исследования за счет повышения качества приготовления цитологических препаратов.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики опухолевых и неопухолевых заболеваний человека.

При целом ряде заболеваний, особенно онкологических и онкогематологических, прямые цитологические исследования: анализы крови, мочи, спинномозговой, плевральной, синовиальной, асцитической и др. биологических жидкостей, пунктатов костного мозга, лимфатических узлов, внутренних органов, костных и мягкотканных образований – являются основными опорными критериями, вполне достаточными для установления нозологического диагноза. В отдельных случаях цитологическое исследование представляет единственную возможность получить информативную морфологическую картину патологического процесса.

Известны три основных этапа в приготовлении цитологического препарата для световой микроскопии:
процедура предварительной подготовки предметного стекла;
– забор исследуемого материала (пробы) и нанесение его на предметное стекло;
– высушивание, фиксация и окрашивание приготовленного препарата.

Требования к качеству предметных стекол, предназначенных для цитологических препаратов, известны и сводятся к следующим:
– предельная чистота (предметные стекла бракуются, если на них остались следы детергента или другие стойкие налеты, несмотря на тщательную промывку);
– максимальное обезжиривание;
– нейтральная реакция поверхности предметных стекол.

Если качество подготовки предметных стекол легко проверить, то второй этап – непосредственное приготовление препарата – целиком зависит от способа нанесения исследуемого материала на предметное стекло, как то: посредством мазка с помощью шлифованного стеклышка, путем размазывания шпателем по поверхности предметного стекла или методом отпечатка.

За прототип предлагаемого изобретения выбран известный способ приготовления цитологического препарата, включающий нанесение исследуемого материала на подготовленное предметное стекло (см. Справочник “Лабораторные методы исследования в клинике”, под ред. проф. В.В.Меньшикова, стр. 99, 101, 111).

Способ осуществляют следующим образом.

На сухое подготовленное предметное стекло, находящееся в горизонтальном положении, мерным капилляром наносят ближе к короткой стороне строго отмеренную каплю исследуемого материала (крови, пунктата или осадка биологической жидкости, полученного центрифугированием) и размазывают ее по стеклу с помощью чистого шлифованного стеклышка, помещая его под углом 45^o. Подождав, пока вся капля растечется по короткому ребру стеклышка, быстро проводят им по поверхности предметного стекла. Полученные таким образом мазки высушивают на воздухе, маркируют, фиксируют и окрашивают унифицированными способами.

Однако этот способ приготовления цитологического препарата очень часто не удовлетворяет требованиям качества, в силу того что при световой микроскопии постоянно возникают трудности в морфологической интерпретации клеточных элементов 1) из-за их деформации в толстых участках препарата, где клетки плохо идентифицировать, 2) частичного разрушения, особенно после центрифугирования, механически нестойких форм, а также 3) в связи с меняющимися тинкториальными свойствами самих клеток в зависимости от плотности их микроокружения, pH поверхности предметного стекла и pH среды, в которой клетки находились в естественных условиях, вследствие чего многие из них оказываются перекрашенными. В зависимости от исследуемого материала (пунктаты костных и мягкотканных образований, внутренних органов) от 10 до 25% препаратов содержат только лишь разрушенные клетки, и еще в 10-15% приготовленных образцов обнаруживают значительную примесь крови и разрозненные клетки морфологического субстрата заболевания, по которым бывает трудно судить о характере патологического процесса. В мазках, приготовленных из биологических жидкостей с нормально малым цитозом (ликвор, синовиальная жидкость, моча) посредством нанесения клеточного осадка на предметное стекло, изучение клеточного состава с дифференцированным подсчетом 50-100 клеток для выведения цитограммы оказывается практически нереальным по причине обнаружения в препарате лишь единичных клеточных экземпляров, к тому же не всегда четко прокрашенных, и большого числа разрушенных в результате центрифугирования клеток. Кроме того в разных биологических средах клетки несут различные физико-химические, в частности тинкториальные, характеристики, поэтому нередко в препаратах, приготовленных рутинным способом, часть клеток выглядит как компактные, интенсивно окрашенные структуры, что препятствует их детальному анализу.

В целом, при рутинном способе приготовления цитологических препаратов до 40-50% вынесенных в результате анализа заключений несут противоречивые суждения и не содержат необходимой для эффективной диагностики информации.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение точности и информативности результатов цитологического исследования за счет повышения качества приготовления цитологических препаратов.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе приготовления цитологического препарата, включающий нанесение исследуемого материала на подготовленное предметное стекло, высушивание на воздухе полученного препарата, его фиксирование и окрашивание по унифицированной методике, отличающийся тем, что предварительно исследуемый материал помещают в культуральную среду с добавлением антикоагулянта отмывают от ненужных примесей путем отстаивания в течение 3 – 5 мин и удаления крупных частиц с последующими разведениями отобранной клеточной взвеси в свежих порциях культуральной среды, готовят пробы с концентрацией ядросодержащих клеточных элементов 100 – 300 тыс./мл, помещают каждую пробу в седиментационную камеру и проводят естественную седиментацию клеток на предметное стекло с установленной постоянной скоростью фильтрации жидкости из камеры, равной 10 мл за 40-60 минут.

В качестве культуральной среды используют любую питательную среду, предназначенную для краткосрочного культивирования клеток: раствор Хенкса, среду 199, среду RPMI-1640 с глутамином и др.

Вид антикоагулянта и его разведение могут быть любые.

Предварительной подготовке по предлагаемому способу подвергаются любые образцы, полученные путем аспирационной пункции (лимфатические узлы, молочные железы, костный мозг в случаях получения скудного содержимого, внутренние органы, полостные и мягкотканные образования), а также биологические жидкости, биоптаты органов и тканей, смывы и соскобы с язвенных поверхностей, незаживающих ран, со слизистых внутренних органов (бронхов, желудка, влагалища), секреты молочных и слюнных желез.

Для спонтанного осаждения клеток на предметное стекло авторы используют седиментационную камеру специальной конструкции, состоящей непосредственно из камеры, в которой размещено предметное стекло, и ввинчивающейся цилиндрической трубки. Схема устройства седиментационной камеры была представлена одним из авторов в методических рекомендациях для врачей “Ранняя диагностика, профилактика и лечение нейролейкемии при лейкозах”, авт.: В.Г.Воробьев, С.А.Пугина, В.П.Корбман, А.И.Лебедева. – Горький -1989. Конструкция седиментационной камеры не имеет принципиального значения: для осуществления способа можно использовать любую из действующих модификаций.

Способ осуществляют следующим образом.

Взятый для исследования материал (пунктат, соскоб) помещают в мерную пробирку с 5 мл культуральной жидкости, в которую добавлено 2 капли гепарина в разведении 1:50. Если при пункции получено скудное количество материала, иглу и шприц, которыми производилась манипуляция, промывают заданной культуральной средой, возвращая смыв в исходную пробирку. Содержимое пробирки перемешивают опрокидыванием на пробку, в течение 3-5 минут отстаивают и переливают в другую мерную пробирку таким образом, чтобы более или менее крупные частицы остались на стенках первой пробирки.

Биоптаты органов и тканей или желеобразное содержимое кист или полостей после помещения в пробирку с культуральной средой энергично встряхивают, крупные комочки разбивают с помощью стеклянной палочки, также в течение 3-5 минут отстаивают и переливают в другую мерную пробирку, оставляя крупные частицы ткани в первой пробирке.

Выпоты и другие биологические жидкости (моча, спинномозговая, смывы с пораженных поверхностей), полученные в большом количестве, разливают по 5 мл в исходные центрифужные пробирки с культуральными средами и гепарином. Если доставленный материал содержит много примесей (кристаллы солей, хлопья белка, некротические массы, мелкие тканевые комочки, частицы перевязочного материала), проводят 1- или 2-кратное 3-5 мин отстаивание и перемещение надосадочного слоя в свежие порции культуральной жидкости.

По завершению процедуры отмывания каждую пробу доводят до объема 10 мл добавлением свежего культурального раствора, тщательно перемешивают путем переворачивания пробирки на пробку и в камере Горяева производят подсчет содержания клеток в полученной клеточной взвеси, с тем чтобы определить степень оптимального разведения для приготовления качественных препаратов. Оптимальной концентрацией ядросодержащих клеток для приготовления 1 препарата является 100-300 тыс. в 1 мл. При меньшей концентрации получится малоклеточный цитологический препарат, не удобный для дифференцированного клеточного подсчета. Минимальное количество препаратов, которое можно приготовить из исходной клеточной взвеси, определяется числом, кратным к оптимальной концентрации. Обычно в зависимости от задач, стоящих перед исследователем (напр., постановка цитохимических реакций), из одной матричной пробы готовят от 1-2 до 10-12 препаратов. Если доставленный материал содержит значительную примесь крови, то конечную концентрацию пробы, отобранной для приготовления 1 препарата, рассчитывают, исходя из содержания в ней эритроцитов – не более 2-5 млн. /мл, иначе из-за многослойного наложения эритроцитов друг на друга ядросодержащие элементы в препарате окажутся сдавленными, сморщенными и перекрашенными.

Каждую приготовленную рабочую пробу клеточной взвеси с заданным содержанием клеточных элементов помещают в седиментационную камеру, предназначенную для спонтанного осаждения клеток на предметное стекло при условии медленной элиминации жидкости из системы.

В седиментационный аппарат вставляют подготовленное предметное стекло, которое плотно прижимают к нижней стенке прибора путем ввинчивания сверху цилиндрической трубки с диаметром отверстия 18-20 мм. После плотного прижатия к предметному стеклу цилиндр заполняют рабочей пробой с известной концентрацией ядросодержащих клеток и обратными вращениями ослабляют плотность прижатия цилиндра к предметному стеклу так, чтобы по краям цилиндра стала медленно просачиваться жидкость, которую удаляют фильтровальной бумагой. Задается постоянная скорость фильтрации жидкости из трубки, установленная опытным путем и равная 10 мл за 40 мин – 1 час, благодаря которой клетки равномерно оседают на поверхность предметного стекла и не концентрируются по периметру цилиндра. По окончании процедуры фильтрации предметные стекла извлекают из аппарата, высушивают на воздухе, маркируют, затем фиксируют и окрашивают в соответствии с унифицированной технологией.

Окрашенные препараты после высушивания на воздухе просматривают сначала под малым увеличением микроскопа, оценивают с точки зрения их качества, отмечают характер распределения клеток по препарату, фиксируют клеточные скопления и конгломераты, которые затем анализируют под большим увеличением с иммерсионной системой. Производят дифференцированный подсчет в общей совокупности 100-500 клеток, учитывая изолированно расположенные клетки, доступные идентификации, и монослойные клеточные скопления и комплексы. Ответ выдается в форме цитограммы – дифференцированного распределения клеток в %, описательной характеристики отдельных особенностей клеточных элементов, имеющих диагностическое значение, и, если возможно, цитологического заключения о характере патологического процесса.

К преимуществам метода относятся следующие.

1. Метод дает возможность получать качественные цитологические препараты, в которых достигается однослойное распределение клеток по поверхности стекла, минимальное количество клеточных скоплений и крупных конгломератов (при этом раковые комплексы, если они имеют место, сохраняются несмотря на встряхивание пробирки), отсутствует слизь, кристаллы солей и другие ненужные примеси, мешающие анализу.

2. С помощью данного метода можно добиться оптимальной для микроскопии концентрации клеток на ограниченной площади диаметром 18-20 мм, соответствующей диаметру полого цилиндра в седиментационной камере, и получать хорошую окрашиваемость клеточных структур паноптическими красителями, тем самым повысить достоверность идентификации индивидуальных клеточных элементов.

3. Благодаря процедуре отмывания клеток в культуральных средах, метод позволяет использовать стандартные условия фиксации и окраски всех нативных препаратов, независимо от источника получения материала для цитологического исследования (моча, ликвор, плевральная жидкость, желудочный сок, соскоб со стенок влагалища и т.д.), с хорошим качеством паноптического окрашивания.

4. Рекомендуемый метод обеспечивает проведение дифференцированного подсчета клеток в малоклеточных биологических жидкостях, таких как спинномозговая и синовиальная, которые при нормальной клеточности, если используют общераспространенный способ приготовления цитологических препаратов, оказываются недоступными для цитологического изучения.

5. Метод также обеспечивает приготовление хороших цитологических препаратов из плотной опухолевой ткани и компактной губчатой кости путем приготовления смывов с биоптатов этих тканей, имеет несомненные преимущества перед способом приготовления отпечатков и открывает перспективу изучения цитологии тех опухолевых процессов, которые раньше не могли быть описаны в цитологическом плане по причине трудности получения материала для цитологического исследования.

6. Благодаря устранению этапа центрифугирования клеток, метод существенно снижает влияние технических погрешностей на результат исследования, уменьшает число деформированных и разрушенных клеток в препарате.

7. При пункции костных или синовиальных кистозных образований нередко получают кровь или густую желеобразную массу, которые при приготовлении мазков обычным способом содержат скудное количество клеточных элементов, не позволяющих составить представление о характере патологического процесса. Цитологические препараты, приготовленные в соответствии с предлагаемым способом, обеспечивают возможность изучать клетки, выстилающие то или иное полостное образование.

8. Благодаря предлагаемому методу, врач, производящий манипуляцию, освобождается от процедуры приготовления мазков, требующей специальных навыков.

9. Метод позволяет получить необходимое количество препаратов, предназначенных как для прямого цитологического изучения, так и для постановки дополнительных процедур (цитохимических реакций, анализа хромосом, иммунофенотипирования, культивирования клеток и т.д.).

Улучшение качества получаемых препаратов несомненно повышает точность, достоверность и информативность результатов цитологического исследования.

На данное время проведены диагностические цитологические исследования у 215 онкологических больных и 115 пациентов неонкологического профиля. В архиве ННИИТО хранится более 1500 цитологических препаратов, приготовленных предлагаемым способом и удовлетворяющих требованиям качества. По этим препаратам можно подсчитать цитограмму полученного субстрата и составить соответствующее цитологической картине заключение.

В нашей практике у 132 (61.4%) из 215 онкологических больных точный диагноз был установлен до получения результатов гистологического исследования, включая сюда 2 больных острыми лейкозами и 5 лимфосаркомами, у которых патогистологом первоначально была неверно интерпретирована морфологическая картина биоптатов пораженных лимфатических узлов. Это были больные с злокачественным характером новообразований различных локализаций и метастазами (низкодифференцированные раки, аденокарциномы, лимфосаркомы, лимфогранулематоз, другие гематосаркомы и лейкозы). У 39 пациентов с цитологически и гистологически доказанным опухолевым процессом исследовали клетки различных биологических жидкостей – ликвора, мочи, плеврального выпота, водянки яичка – с целью определения степени распространения опухолевого процесса; из них у 1 больного с опухолью головного мозга, 2 – почечно-клеточным раком, 1 – лимфосаркомой яичников и 1 – раком легкого в цитологических препаратах найдены атипичные опухолевые клетки. В диагностике доброкачественных опухолей при использовании предлагаемого метода встретились значительные трудности. В 68 (81.9%) из 83 случаев доброкачественных новообразований (38.6%) было вынесено лишь ориентировочное цитологическое заключение, поскольку наличие опухолевых клеток, хотя и в преобладающих пропорциях, но с разрозненным, изолированным, распределением по препарату при нормальном микроокружении и без признаков атипического полиморфизма, не позволяло составить твердое суждение о патологическом процессе. Только у 15 из этих больных при обнаружении в препаратах в подавляющем количестве мономорфных зрелых и созревающих клеток с легкими признаками атипии установлен достоверный диагноз доброкачественной опухоли. В результате полученных данных вынесено суждение о том, что в диагностике доброкачественных новообразований (фибром, аденом, базалиом, хондром, остеоидостеом, остеобластокластом) ведущая роль всегда принадлежит гистологическому исследованию.

В 27 (12.5%) исследованиях аспирационная пункция оказалась неэффективной, когда при аспирации была получена капля крови или бесклеточной тканевой жидкости; в таких случаях всегда предпринимали исследование смыва с биопсированного материала и, как правило, получали цитологические препараты с достаточным содержанием клеток.

В группе неопухолевых заболеваний (ожоги кожи, трофические язвы, костные экзостозы, очаги остеомиелита, невусы, подкожные и более глубокие гематомы, посттравматические бурситы, синовиты, ушибы головного мозга, арахномиелиты, бактериальные плевриты, водянка яичка и др.) случаев гипердиагностики злокачественных новообразований не было, а повторные аспирации патологического материала позволяли проследить динамику патологического процесса.

Пример 1. Больной М., 69 лет. Ист. б-зни N 180110. Диагноз: метастазирующая низкодифференцированная карцинома с неустановленным первичным очагом, поражением правого легкого, печени (?), мягких тканей левого плеча на фоне эритремии IIБ ст. (по А.В. Демидовой), атеросклероза аорты, коронарных сосудов, облитерирующего атеросклероза сосудов ног, ИБС: атеросклеротического кардиосклероза, пароксизмов мерцательной аритмии, хронического калькулезного холецистита, мочекислого диатеза, обменно-деформирующего полиартрита; эксудативный правосторонний плеврит, легочно-сердечная недостаточность II ст., кахексия.

С 1979 г. страдал эритремией, диагноз которой подтвержден данными трепанобиопсии и динамикой многолетнего течения заболевания, неоднократно получал химиотерапию (имифос, затем миелосан), кровопускания. Последний курс лечения (кровопускания + миелосан) проходил в марте 1997 г. В 1982 г. после курса лечения имифосом перенес тяжелый токсический гепатит, в 1985 г. – острый субэндокардиальный инфаркт передней стенки миокарда. В 1989 г. диагностирована гипернефрома левой почки, диагноз до операции был основан на данных аорторенографии и подтвержден цитологическим исследованием мочи, проведенным по описанной выше методике: в приготовленных цитологических препаратах клеточный состав представлен клетками плоского, переходного и почечного эпителия, среди которого обнаруживаются атипичные клетки (12.5%), расположенные изолированно и группами по 2-3. 17.12.89 г. больной был оперирован – нефрэктомия слева; диагноз почечно-клеточного рака подтвержден патогистологическим исследованием удаленной почки. В течение 7.5 лет чувствовал себя удовлетворительно, проходил курсы лечения миелосаном и кровопусканиями. С мая 1997 г. после острого воспаления геморроидальных узлов стал отмечать похудание. Обнаружено прогрессирующее увеличение печени и селезенки. Состояние расценивалось как трансформация эритремии в терминальный миелофиброз. С 13.12.97 по 8.01.98 гг. лечился стационарно по поводу правосторонней нижнедолевой пневмонии. В начале февраля 1998 г. госпитализирован в ННИИТО, где был диагностирован эксудативный плеврит, подтвержденный R^O-логически.

При осмотре 10.02.98 г.: пониженного питания, диффузный цианоз и акроцианоз, остаточные признаки инъецированности сосудов кожи лица, лимфатические узлы не увеличены, печень +16 см с ровной поверхностью, селезенка +7 см, плотная. В легких – физикальные признаки наличия жидкости справа до уровня 3-го межреберья спереди, хрипов нет, число дыханий 28 в 1 мин. Сердце – левая граница на 0,5 см кнутри от передней подмышечной линии, тоны учащены, приглушены, ритмичные, АД = 140/80 мм рт.ст. Живот умеренно вздут, безболезненный. В верхней 1/3 левого плеча с внутренней стороны пропальпировано мягкотканное образование.

R-графия грудной клетки 10.02.98 г.: справа в плевральной полости жидкость с косой верхней границей до 3-го ребра (счет спереди), срединная тень смещена влево, сердце увеличено за счет левых отделов, аорта развернута, уплотнена.

Анализ крови: Hb 130 г/л, э.4.010¹²/л; ПГ = 1,0; р. 1.4%, т. 280.010⁹/л, СОЭ 10 мм/ч, Лк. 6.010⁹/л (п. 10, с. 79, эоз. 0, баз. 1, лимф. 10, мон. +). Анизоцитоз 1+: макроцитоз, пойкилоцитоз 1+.

Анализ мочи: уд.вес 1011, белок – 0,099 г/л, лк., эр., эпит.кл., гиалин. цилиндры – един. в п/зр.

Биохимия крови: общий белок – 55.5 г/л (А-29.3, Г-26.2), общий билирубин – 24.9 мкмоль/л (непрямой – 13.6, прямой – 11.3), щелочная фосфатаза – 136.2 ед. /л (N до 115.0), гамма-ГТП – 65 ед./л (N до 53.0), мочевая к-та – 0.62 ммоль/л (N до 0.42), C-реактивный белок – 3+.

Были предприняты серия плевральных пункций и обследование в онкологическом плане. Все цитологические исследования выполнены по описанному выше способу.

Исследование плевральной жидкости: белок – 9.9 г/л, проба Ривальта – положительная, цитоз – 150 кл./мкл, эритроцитов – 40000 в мкл. Клеточный состав в % (цитограмма): палочкояд. нейтрофилов – 4.0, сегментояд. нейтрофилов – 24.0, эоз. – 0, лимфоцитов – 12.0, моноцитов – 8,0, макрофагов – 18.0, клеток мезотелия – 34.0. Клеточный состав плевральной жидкости полиморфный, преобладают клетки плеврального мезотелия, атипичных клеток не найдено.

Цитологическое исследование пунктата опухоли левого плеча: аспирировано скудное количество материала, в препарате, приготовленном суспензионно-седиментационным способом, получено достаточное для цитологической идентификации количество клеток, на 96.5% представленных низкодифференцированными эпителиальными клетками с выраженными признаками атипического полиморфизма. Заключение: метастаз низкодифференцированного рака; по морфологии клеток определить источник метастазирования не представляется возможным.

R-графия и томография грудной клетки от 20.02.98 г. Справа уровень жидкости не определяется, под куполом диафрагмы в заднем отделе – интенсивная округлая тень с неровными контурами 9x7x8 см, выраженный спаечный процесс, смещение сердечно-сосудистой тени вправо, деформация корня левого легкого, правый корень не отчетлив.

Цитология пунктата печени от 23.02.98 г. В препаратах, приготовленных суспензионно-седиментационным способом, преобладают зрелые нейтрофилы, среди которых встречаются скопления дистрофически измененных печеночных клеток без признаков малигнизации.

Цитологическое исследование мочи: клеточный состав мочи представлен в основном элементами плоского эпителия, единичными нейтрофилами, атипичных клеток не найдено.

15.03.98 г. в пульмонологическом отделении хирургической клиники 1-й Градской больницы г. Нижнего Новгорода произведено хирургическое удаление опухоли мягких тканей левого плеча. Гистологический диагноз: метастаз низкодифференцированного рака с обширными некрозами опухолевой ткани.

Консилиум в составе онкопульмонологов, терапевтов и гематолога утвердил диагноз рака легкого с метастазами и признал радикальное хирургическое лечение и проведение лучевой терапии неадекватными состоянию больного. Умер 17.05.98 г. дома (вскрытия не было).

Таким образом, серия цитологических исследований позволила достоверно определиться в характере патологического процесса (метастаз низкодифференцированного рака!) и исключить рецидив почечно-клеточного рака.

Пример 2. Больная Н., 67 л. Ист. б-зни N 179853. Диагноз: острый миеломонобластный лейкоз (М4-1-тип, по классификации ФАБ), малопроцентный вариант с высокой базофилией, 1-я атака. Сопутств.: ожирение II ст., артериальная гипертензия мягкого типа, состояние после холецистэктомии (1995 г.).

Больна с июня 1997 г., когда ощутила слабость и быструю утомляемость при ходьбе. Анализ крови, в котором выявлена анемия легкой степени, высокая СОЭ до 44 мм/ч, умеренная лейкопения (2.610⁹/л) с выраженным относительным лимфоцитозом и базофилией до 12%, обнаружены единичные клетки бластного типа, выполнен только в январе 1998 г. Больную беспокоила слабость, повышенная потливость, одышка при ходьбе и головные боли. В соматическом статусе – без существенных особенностей. Анализ крови от 14.01.98 г.: Hb 109 г/л, э. 3.210¹²/л; ПГ = 1,0; р. 2.6%, т. 127.010⁹/л, СОЭ 15 мм/ч, Лк. 4.010⁹/л (миелоц. 1, ю. 1, п. 1, с. 18, эоз. 2, баз. 12, лимф. 55, мон.+промон.10). Среди базофилов обнаружен 1 базофильный миелобласт. Анизоцитоз эритроцитов 2+: микроцитоз 1+, макроцитоз 1+, пойкилоцитоз 1+.

14.01.98 г. произведена стернальная пункция: получено малое количество пунктата (лишь в игле), из которого сделано только 2 мазка; клеточный состав окрашенных препаратов представлен преимущественно зрелыми элементами крови, среди которых повышенная пропорция базофилов, и единичными костномозговыми созревающими клетками – миелоцитами и метамиелоцитами, т.е. полноценной цитологической картины костного мозга получить не удалось. 15.01.98 г. предпринята 2-я пункция грудины: также получено мало материала – в игле и на стенках шприца. Шприц с иглой промыт культуральной средой, вся жидкость перенесена в центрифужную пробирку, получена клеточная взвесь с концентрацией ядросодержащих клеток 1.6 млн./10 мл, из которой седиментационным методом приготовлено 4 цитологических препарата с хорошей плотностью и равномерным распределением клеточных элементов. В 1 препарате подсчитано и идентифицировано 250 клеток.

Миелограмма (в %):
Недифференцируемые бласты + миелобласты – 4.4
Моноцитоидные бласты – 11.6
Промиелоциты – 2.0
Миелоциты – 4.4
Метамиелоциты – 3.2
Палочкоядерные – 2.8
Сегментоядерные – 13.6
Эозинофилы – 2.4
Базофильные миелобласты – 2.0
Базофилы зрелые – 8.8
Лимфоциты зрелые – 35.6
Моноциты зрелые – 1.6
Плазматические клетки – 0.4
Эритробласты – 0
Эритрокариоциты базофильные – 0.4
-“- полихроматофильные – 4.0
-“- оксифильные – 2.0
Мегакариоциты – 0.8
Остальные 3 препарата использованы для постановки и оценки цитохимических реакций в бластных клетках: реакция на миелопероксидазу – положительная в 57% бластных клеток, СЦК = 1.42; реакция на а-нафтилацетатэстеразу – положительная в 86% клеток, СЦК = 1.84, почти полностью ингибируется натрия фторидом, коэффициент ингибиции = 87.6%.

На основании повышенной пропорции бластных клеток в миелограмме (суммарно 18.0%) установлен диагноз малопроцентного острого лейкоза, который по данным цитохимического типирования верифицирован как острый миеломонобластный лейкоз, М4-1 тип (по классификации ФАБ).

Больная прошла 3-х месячный курс лечения сандимуном 200 мг/сут (всего 18000 мг) с некоторым улучшением показателей периферической крови, но в костном мозге 27.05.98 г. количество бластов нарастало (суммарно 30.4%), в связи с чем в июне 1998 г. была госпитализирована в гематологическое отделение Нижегородской городской больницы N 12, где начата химиотерапия по протоколу 7+3 (цитозар+рубомицин). Достигнуто улучшение, но полной ремиссии не получено. Наблюдение продолжается. В данном случае установлению точного диагноза помогло цитологическое исследование пунктата костного мозга по предлагаемому способу с постановкой цитохимических реакций.

Пример 3. Больной П. , 71 г., поступил в 3-е ортопедическое отделение ННИИТО 5 апреля 1999 г. с диагнозом: остеобластокластома левой подвздошной кости, двусторонний коксартроз.

Болен с декабря 1998 г., когда появились боли в костях таза и тазобедренном суставе слева. Лечился по месту жительства: электрофорез с гидрокортизоном, индаметацин – без эффекта. В феврале 1999 г. на основании данных рентгенографии костей таза высказано подозрение на остеобластокластому. На R-граммах таза от 22.03.99 г. определяется патологический очаг в области крыла и тела левой подвздошной кости больших размеров 14X10 см; кость вздута с перерывом кортикалиса по наружной стороне, структура очага крупно-ячеистая; тазобедренный сустав интактен. Заключение: необходимо дифференцировать остеобластокластому, солитарную плазмоцитому или метастаз гипернефромы.

Анализ крови от 6.04.99 г.: Hb 128 г/л, э. 4.010¹²/л; ПГ = 1,0; СОЭ 16 мм/ч, Лк. 5.810⁹/л (п. 7, с. 65, эоз. 2, лимф. 19, мон. 7), анизоцитоз 1+, пойкилоцитоз . Анализ мочи – N. Биохимия крови, в том числе биохимические опухолевые маркеры, в пределах нормы.

14.04.99 г. предпринята попытка открытой биопсии патологического очага подвздошной кости: после рассечения надкостницы началось обильное венозное кровоточение, которое удалось остановить с трудом; взят небольшой участок костной ткани, который направлен на цитологическое и патогистологическое исследования.

Цитология смыва с биоптата левой подвздошной кости.

В приготовленных цитологических препаратах подсчитано и идентифицировано 500 клеток.

Цитограмма в %:
Палочкояд. нейтрофилов – 0.8
Сегментояд. нейтрофилов – 14.4
Эозинофилов – 4.0
Лимфоцитов – 44.0
Моноцитов – 4.8
Гистиоцитов – 3.2
Остеобластов – 0.8
Остеокластов – 0.4
Хрящевых клеток – 3.2
Изолированно расположенных атипичных эпителиальных клеток – 20.8
Комплексов атипичных клеток (по 3-5 кл.) – 2.4
Крупных скоплений атипичных клеток – 1.2
Заключение: в приготовленных препаратах значительная примесь форменных элементов крови; обнаружены атипичные эпителиальные клетки (умеренно выраженный полиморфизм величины, структуры ядер, выраженная базофилия и вакуолизация цитоплазмы), расположенные большей частью изолированно, но и попарно и группами по 3-5 клеток, встречаются также крупные клеточные скопления (по 15-20) этих клеток. Цитологическая картина соответствует метастазу рака, по морфологии клеток определить источник метастазирования не представляется возможным, нельзя исключить аденокарциному предстательной железы и почечно-клеточный рак. Цитологическое заключение было составлено 15.04.99 г.

Цитология мочи от 21.04.99: приготовлено 2 препарата из свежевыпущенной мочи, подсчитано и идентифицировано 100 клеток.

Цитограмма в %:
Клеток плоского эпителия – 44.0
Клеток переходного эпителия – 4.0
Клеток почечного эпителия – 21.0
Мелких эпителиальных клеток – 27.0
Атипичных эпителиальных клеток – 4.0
Заключение: получены препараты с низкой клеточностью, значительно увеличена пропорция клеток кубического (почечного) эпителия, обнаружены клетки кубического эпителия с признаками атипического полиморфизма (крупная величина, резко выраженная базофилия цитоплазмы, гипертрофированные нуклеолы), что не исключает принадлежности этих клеток почечно-клеточному раку.

Результат гистологического исследования костного биоптата крыла подвздошной кости от 14.04.99 г. В доставленном материале опухоль альвеолярного строения с тонкими прослойками соединительно-тканной стромы фиброзного характера, компактным расположением опухолевых ячеек из довольно мономорфных клеток с эксцентрично расположенными ядрами и светлой пенистой цитоплазмой, либо из более полиморфных хромофильных клеточных элементов с явлениями анизокории и гиперхроматоза ядер. Среди немногочисленных фигур митотического деления встречаются патологические митозы. Заключение: патологическая картина более всего позволяет предполагать о метастазах почечно-клеточного рака, смешанного варианта с преобладанием светлоклеточного компонента.

Результат гистологического исследования был составлен 28.04.99 г., т.е. через 2 недели после взятия биоптата.

Больной переведен в городской онкологический диспансер для дальнейшего обследования и лечения.

В данном случае цитологические исследования (смыв с костного биоптата и цитология мочи) предварили почти на 2 недели результаты гистологии опухоли, подтвердившие с большей убедительностью и гистологической верификацией опухоли диагноз метастазирующего почечно-клеточного рака. За истекший срок с момента открытой биопсии кости у врачей была возможность провести дополнительные исследования, направленные на уточнение топографии опухоли в почках.

Формула изобретения

Способ приготовления цитологического препарата, включающий нанесение исследуемого материала на подготовленное предметное стекло, высушивание на воздухе полученного препарата, его фиксирование и окрашивание по унифицированной методике, отличающийся тем, что предварительно исследуемый материал помещают в культуральную среду с добавлением антикоагулянта, отмывают от ненужных примесей путем отстаивания в течение 3 – 5 мин и удаления крупных частиц с последующими разведениями отобранной клеточной взвеси в свежих порциях культуральной среды, готовят пробы с концентрацией ядросодержащих клеточных элементов 100-300 тыс./мл, помещают каждую пробу в седиментационную камеру и проводят естественную седиментацию клеток на предметное стекло с установленной постоянной скоростью фильтрации жидкости из камеры, равной 10 мл за 40 – 60 мин.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 16.07.2001

Номер и год публикации бюллетеня: 11-2003

Извещение опубликовано: 20.04.2003