Патент на изобретение №2171294

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЙТЕРОФРУКТОЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения дейтерофруктозы. Способ предусматривает культивирование бактерий штамма Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823 на питательной среде, содержащей дейтерометанол в качестве источника углерода, тяжелую воду и минеральные соли. Бактерии штамма-продуцента, отобранного как форма, адаптированная к тяжеловодной среде, синтезируют на таких средах дейтерополифруктаны, состоящих из мономеров дейтерофруктозы с примесью дейтерорибозы (2%). После выделения дейтерополифруктанов из культуральной жидкости и их гидролиза выделяют целевой продукт – дейтерофруктозу в сухом виде. Способ позволяет получать до 100 мг/л дейтерофруктозы с уровнем включения дейтерия не менее 89%.

Изобретение относится к области микробиологии и касается способа получения дейтерофруктозы (фруктозы, содержащей в молекуле вместо атомов водорода ¹H атомы его стабильного изотопа дейтерия – ²H или D).

Препараты дейтерофруктозы применяют при изучении углеводного и липидного метаболизма? что позволяет упростить диагностику ряда заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ.

В заявляемом изобретении предложен способ получения дейтерофруктозы путем микробиологического синтеза дейтерополифруктанов с их последующим гидролизом до дейтерофруктозы. Сведений о получении дейтерофруктозы путем микробиологического синтеза в научной и патентной информации нами не обнаружено.

Изобретение является новым и не имеет аналогов.

В предлагаемом изобретении для микробиологического синтеза дейтерополифруктанов используют бактерии вида Methylobacillus flagellatum. На основе бактерий штамма Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-4295 путем многоступенчатой селекции получен штамм, отличающийся способностью расти на питательной среде, приготовленной на основе тяжелой воды и содержащей дейтерометанол в качестве источника углерода. Отобранный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов как Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823.

Бактерии штамма Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823 имеют следующие морфологические и физиолого-биохимические особенности: подвижные палочки 1,8х0,6 мкм, спор не образуют, через 2-3 дня роста на твердой питательной среде образуют гладкие матовые серовато-желтые колонии, с ровным краем. Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823 облигатный метилотроф, аэроб, прототроф, нейтрофил, растущий при 35-40^oC, усваивает азот в форме солей аммония. При росте на питательной среде, содержащей дейтерометанол, тяжелую воду и минеральные соли, бактерии Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823 синтезируют до 110 мг/л дейтерополифруктанов. До полугода бактерии этого штамма можно хранить на твердой питательной среде такого же состава в бакпечатках при 6-10^oC, для длительного хранения используют лиофилизированные культуры.

Способ получения дейтерофруктозы осуществляют следующим образом. Бактерии Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823 культивируют на питательной среде, содержащей дейтерометанол, в качестве источника углерода, тяжелую воду и минеральные соли. При росте на такой среде эти бактерии продуцируют внеклеточные дейтерополифруктаны, которые накапливаются в культуральной жидкости. По окончании процесса культивирования культуральную жидкость отделяют от биомассы центрифугированием. Дейтерополифруктаны осаждают избытком ацетона и гидролизуют в кислых условиях до образования дейтерофруктозы, которую выделяют путем выпаривания под вакуумом до получения сухого продукта. Выход дейтерофруктозы составляет 80-100 мг/л культуральной жидкости. Уровень примесей дейтеромоносахаров определяют методом жидкостной хроматографии. Уровень дейтерирования целевого продукта – дейтерофруктозы определяют методом протонной ядерной магнитно-резонансной (ЯМР) спектроскопии.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример. Для культивирования бактерий Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823 используют питательную среду следующего состава, г/л [5]: дейтерометанол (CD₃OD 99,5 ат.% D) – 5,6, Na₂HPO₄ – 6,0, KH₂PO₄ – 3,0, NaCl – 1,0, NH₄Cl – 1,0, CaCl₂ – 0,02, MgSO₄ – 0,04, Na₂ЭДТА – 0,015, Na₂MoO₄ – 0,0001, MnCl₂ – 0,0001, ZnSO₄ – 0,0003, CuCl₂ – 0,0003, CoCl₃ – 0,0006, Fe₂SO₄ – 0,0006, H₃BO₃ – 0,0009, NiCl₂ – 0,00006, тяжелая вода (²H₂O 99,85 ат.% ²H), pH – 7,0-7,1.

Посевную культуру выращивают в пробирках, заполненных на 1/8 часть объема питательной средой на качалке при 200 об/мин в течение ночи. Колбы объемом 250 мл, содержащие 50 мл стерильной питательной среды, засевают, перенося в них содержимое пробирок, и культивируют 50 ч при 37^oC. Для предотвращения разбавления дейтериевой метки среды влагой атмосферы пробирки и колбы закрывают пробками, снабженными хлор-кальциевыми трубками. Культуральную жидкость с содержащимися в ней дейтерополифруктанами отделяют от биомассы центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин. Дейтерополифруктаны осаждают добавлением при интенсивном перемешивании охлажденной культуральной жидкости к двойному объему охлажденного ацетона. Выпавшие в течение 18 ч белые хлопья дейтерополифруктанов отделяют центрифугированием (16000 об/мин в течение 40 мин). Выход дейтерополифруктанов с 1 л питательной среды составляет 110 мг. Таким образом, конверсия дейтерометанола в дейтерополифруктаны – 1,96%.

Гидролиз дейтерополифруктанов (110 мг) проводят в 15 мл 2н. H₂SO₄ в течение 2ч при 100^oC. Гидролизат нейтрализуют Ca(OH)₂, выпавший осадок CaSO₄ отделяют центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин). Надосадок выпаривают досуха под вакуумом. Вес полученной дейтерофруктозы составляет 100 мг. Таким образом, конверсия дейтерометанола в дейтерофруктозу – 1,78%.

Определение моносахаридного состава дейтерополифруктанов проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе “Waters”, снабженном дифференциальным рефрактометром R401, колонкой Separon SGX NH₂ (150 мм х 3,3 мм) в изократическом режиме с использованием в качестве элюента системы ацетонитрил:вода в соотношении 3:1. Сопоставление хроматограмм мономеров гидролизата дейтеро-полифруктанов с хроматограммами стандартов наиболее распространенных сахаров (арабиноза, рибоза, фруктоза, глюкоза, сахароза, мальтоза) показало, что синтезированные дейтерополифруктаны состоят преимущественно из дейтерофруктозы с примесью дейтерорибозы – 2%.

Определение уровня дейтерирования дейтерофруктозы методом протонной ЯМР-спектроскопии проводят путем исследования ацетилированных производных (пентаацетатов) продуктов гидролиза дейтерополифруктанов. Для получения пентаацетатов к 1 мл охлажденного до 0^oC 1,0%-ного раствора свежеплавленного хлористого цинка в уксусном ангидриде прибавляют равный объем гидролизата дейтерополифруктанов, смесь энергично перемешивают до полного растворения сахара (4-5 ч), выдерживают 1 ч при 20-25^oC и 2 ч при 50^oC. Раствор, охлажденный в ледяной бане, перемешивают с 10 мл воды со льдом в течение 2 ч и нейтрализуют избытком бикарбоната натрия. Раствор трижды экстрагируют хлороформом (по 10 мл), объединенный экстракт промывают водой, высушивают безводным сульфатом натрия и выпаривают под вакуумом. Полученный таким образом сиропообразный остаток растворяют в 5 мл абсолютного эфира и оставляют на ночь при 10^oC. Пентаацетат дейтерофруктозы выделяют при перекристаллизации из спирта с добавлением хлороформа (2 об.%). Результаты анализа ЯМР-спектора пентаацетата полученной дейтерофруктозы свидетельствуют, что уровень дейтерирования целевого продукта – дейтерофруктозы составляет 89%.

Таким образом, заявляемый способ позволяет получать до 100 мг/л дейтерофруктозы с уровнем включения дейтерия не менее 89%. Примесь дейтерорибозы – не более 2%.

Формула изобретения

Способ получения дейтерофруктозы, предусматривающий культивирование бактерий штамма Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823 на питательной среде, содержащей дейтерометанол в качестве источника углерода, тяжелую воду и минеральные соли, отделение культуральной жидкости от биомассы, осаждение содержащихся в ней дейтерополифруктанов, их кислотный гидролиз до образования дейтерофруктозы и ее выделение путем выпаривания до получения сухого продукта.