Патент на изобретение №2171034

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ БИФИДОБАКТЕРИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии, ветеринарии и может быть использовано для обогащения биологически активным селеном продуктов питания и придания им лечебно-профилактического значения, способствующего поддержанию статуса синатропных бифидобактерий взрослых людей, нормализации кишечной микрофлоры новорожденных и больных дисбактериозом кишечника вследствие лучевой болезни, последствий химиотерапии и антибиотикотерапии. Способ получения бактериального препарата на основе бифидобактерий включает приготовление питательной среды, охлаждение до температуры культивирования, внесение чистых культур бифидобактерий, культивирование с последующим выделением биомассы из культуральной жидкости. В питательную среду в процессе ее приготовления вносят селенит натрия и сернокислый магний в соотношении от 1 до 1,25 к 1; в качестве чистых культур вносят по крайней мере одну культуру или ассоциацию бифидобактерий, включающую Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis, и/или Bifidobacterium breve, и/или Bifidobacterium infantis в количестве от 1,0 до 1,5 об. % каждой. Изобретение позволяет расширить диапазон полезно используемых бифидобактерий, присущих организму человека в зависимости от возраста. 1 з. п.ф-лы, 5 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии, ветеринарии и может быть использовано для обогащения биологически активным селеном продуктов питания и придания им лечебно-профилактического значения, способствующего поддержанию статуса синантропных бифидобактерий взрослых людей, нормализации кишечной микрофлоры новорожденных и больных дисбактериозом кишечника вследствие лучевой болезни, последствий химиотерапии и антибиотикотерапии.

Селен – необходимый для жизни элемент, участие которого в метаболизме интенсивно изучается в последнее время (1).

Заявителем проведено изучение потребления селена бифидобактериями из среды культивирования и влияние селена на жизнеспособность и кислотообразующую активность ассоциации бифидобактерий.

Из известных способов получения бактериальных препаратов наиболее близким является способ получения бактериального концентрата для производства кисломолочных продуктов, включающий приготовление питательной среды на основе творожной сыворотки с добавлением лактозы и хлористого магния, обработку среды дрожжевой -галактозидазой, культивирование бифидобактерий Bifidobacterium longum с последующим выделением биомассы, ее смешивание с защитной средой и хранение перед использованием в замороженном виде (2).

Известный способ обеспечивает рост бифидобактерий, которые обладают определенной активностью и жизнеспособностью, для сокращения продолжительности сквашивания молока.

Однако лечебно-профилактическое действие известного бактериального концентрата имеет ограниченную область как по возрасту людей, употребляющих эти продукты, так и по спектру антибиотикоустойчивости и антагонистической активности.

Задача, на решение которой направлено изобретение, состояла в том, чтобы создать условия для получения бактериального препарата, при которых он содержит клеточносвязанный селен в биологически активной форме, и расширить диапазон полезно используемых бифидобактерий, присущих организму человека в зависимости от возраста.

Согласно изобретению поставленная задача решена следующим образом.

Предложен способ получения бактериального препарата на основе бифидобактерий, включающий приготовление питательной среды, охлаждение до температуры культивирования, внесение чистых культур бифидобактерий, культивирование с последующим выделением биомассы из культуральной жидкости, в котором согласно изобретению в питательную среду в процессе ее приготовления вносят селенит натрия и сернокислый магний в соотношении от 1 до 1,25 к 1; в качестве чистых культур вносят по крайней мере одну культуру или ассоциацию бифидобактерий, включающую Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis, и/или Bifidobacterium breve, и/или Bifidobacterium infantis в количестве от 1,0 до 1,5 об.% каждой.

Предложенный способ осуществляют следующим образом. Готовят питательную среду следующего состава (г/л):
пептон 10; лактоза 10; цитрат натрия 6; дигидрофосфат калия 1; гидрофосфат натрия 2; гидрохлорид цистеина 0,15 (или аскорбиновая кислота 0,5); агар 0,5; раствор кукурузного экстракта (1:6) 50 мл. В среду культивирования вносят сернокислый магний в количестве 0,012 г/л и селенит натрия в количестве от 0,012 до 0,015 г/л. Объем питательной среды доводят до 1000 мл дистиллированной водой. Исходный pH среды 7,0-7,2. Питательную среду стерилизуют при температуре 115-120^oC, охлаждают до температуры культивирования 37-39^oC и вносят 1,0-1,5 об.% чистых культур Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, и/или Bifidobacterium adolescentis, и/или Bifidobacterium breve, и/или Bifidobacterium infantis, взятых соответственно, в соотношении 1: 1:1:1:1, и культивируют до достижения титра бактерий не менее 10⁹. Подобное соотношение вносимых в состав питательной среды селена и серы позволяет достичь максимального накопления внутриклеточного селена в биологически активной органической форме, преимущественно в форме аминокислот. Созданный бактериальный препарат обладает повышенной антагонистической активностью к представителям патогенной микрофлоры, а также высокой антибиотикоустойчивоситью, что позволяет поддерживать статус кишечной микрофлоры при проведении антибиотикотерапии.

Данные, представленные в таблице I, показывают видовой состав синантропных бифидобактерий, в основном присущий организму человека в зависимости от возраста. Из табл. I следует, что грудные дети имеют четыре вида бифидобактерий, дети до 3-х лет имеют пять видов бифидобактерий, а люди старше 3-х лет – три вида бифидобактерий.

Данные, представленные в табл. II, показывают чувствительность бифидобактерий, составляющих ассоциацию, к антибиотикам. Из табл. II следует, что бифидобактерии, включенные в ассоциацию, обеспечивают взаимное перекрытие спектров их антибиотикоустойчивости.

Данные, представленные в табл. III, показывают антагонистическую активность бифидобактерий. Из табл. III следует, что наличие в клетках бифидобактерий селена увеличивает антагонистическую активность как чистых культур, так и ассоциаций бифидобактерий особенно в отношении S. Aureus и Pr. Vulgaris.

Данные, представленные в табл. IV, показывают срок жизненной активности и кислотообразующую активность ассоциации бифидобактерий, содержащих внутриклеточный селен. Из табл. IV следует, что селен оказывает активизирующее влияние на некоторые свойства бифидобактерий, увеличивая их жизнеспособность на 20% и кислотообразующую активность на 18%.

Данные, представленные в табл. V, показывают влияние селена на продолжительность фаз роста и количества клеток в ассоциации бифидобактерий. Из табл. V следует, что внесение селена в среду роста бифидобактерий значительно сокращает экспоненциальную фазу роста бактерий и удлиняет стационарную фазу. При этом на порядок увеличивается накопление биомассы бифидобактериями (см. К.О.Е. – колонииобразующие единицы).

Пример 1.

В состав для приготовления питательной среды вносят по 0,012 г/л сернокислого магния и селенита натрия. Объем раствора доводят до 1000 мл дистиллированной водой. Питательную среду стерилизуют при 115-120^oC в течение 20 минут, охлаждают до температуры культивирования, вносят в нее 1,0-1,5 об. % чистой культуры Bifidobacterium bifidum и культивируют в течение 48-72 часов при температуре 37^oC до достижения титра бактерий не менее 10⁹. Антагонистическая активность бифидобактерий (поз. 2 табл. III) при наличии в клетках селена увеличивается на 5-23%, особенно в отношении культур-антагонистов Sh. sonnei и S. aureus.

Примеры 2 – 5
Среду для культивирования бифидобактерий готовят способом, аналогичным примеру 1. В качестве чистых культур в среду вносят 1,0-1,5 об.% Bifidobacterium longum, либо Bifidobacterium adolescentis, либо Bifidobacterium breve, либо Bifidobacterium infantis. Антагонистическая активность бифидобактерий при наличии в клетках селена увеличивается на 15-20% особенно в отношении Sh. flexneri и S. aureus (поз. 4 табл. III); на 11-20% особенно в отношении Sh. sonnei (поз. 6 табл. III): на 13-25% особенно в отношении Sh. sonnei (поз. 8 табл. III); на 7-36% особенно в отношении Е. coli (поз. 10 табл. III).

Примеры 6-8
В состав питательной среды вносят селенит натрия в концентрации, обеспечивающей оптимальные конкурентные отношения с серой по потреблению из среды культивирования, преимущественно 0,012 – 0,015 г/л и 0,012 г/л соответственно. В стерилизованную и охлажденную до температуры культивирования среду вносят в отдельные емкости чистые культуры.

В качестве чистых культур используют Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium breve, Bifidobacteriurn infantis. При этом в производственную добавку вводят с учетом их синантропности в зависимости от возраста людей и антибиотикоустойчивости три, четыре или пять штаммов в соотношении 1:1:1; 1:1:1:1; 1:1:1:1:1 соответственно. Антагонистическая активность ассоциации бифидобактерий (поз. 12, 14, 16 табл. III) возрастает в два-три раза при наличии внутриклеточного селена в биологически активной форме.

Для получения обогащенных селеном и бифидобактериями жидких продуктов питания (молоко, кефир, сливки и др.) в исходный продукт питания вносится ассоциация бифидобактерий с учетом их синантропности в зависимости от возраста людей и антибионикоустойчивости и в количестве, обеспечивающим титр в готовом продукте питания 10⁷ – 10⁸.

Пример 9.

Цельное коровье молоко нормализуют по массовой доле жира, подогревают и очищают, гомогенизируют при давлении 12,52,5 МПа и температуре от 45 до 79^oC, пастеризуют при температуре 922^oC 3-5 мин, охлаждают и направляют в промежуточный резервуар. В охлажденное молоко вносят ассоциацию Bifidobacterium 5 (или Bifidobacterium 4, или Bifidobacterium 3), клетки которой содержат связанный селен, перемешивают в течение 3-5 мин до получения однородной консистенции, разливают и охлаждают в камере до температуры не более 42^oC.

Пример 10
В цельное молоко вносят стимулятор роста ГМК-3 в количестве 0,20 г/л. Смесь тщательно перемешивают, очищают, подогревают до температуры 422^oC, очищают на центробежных молокоочистителях и гомогенизируют при давлении 152,5 МПа и температуре от 45 до 85^oC, смесь пастеризуют при температуре 952^oC с выдержкой от 30 до 40 минут или стерилизуют в ферментерах при давлении 0,05 МПа, охлаждают до температуры заквашивания (392^oC) и заквашивают ассоциацией бифидобактерий, содержащих внутриклеточный биологически активный селен. Заквашенную смесь перемешивают в течение 102 мин и оставляют в покое. Сквашивание проводят при температуре 371^oC от 3 до 6 часов до образования молочного сгустка кислотностью 604^oТ. По окончании сквашивания охлаждают продукт до температуры 4-6^oC и разливают.

Пример 11.

В обезжиренное молоко вносят стимулятор роста – кукурузный экстракт в количестве 0,0027 л/л. Смесь тщательно перемешивают, очищают, подогревают до температуры 422^oC, очищают на центробежных молокоочистителях и гомогенизируют при давлении 152,5 МПа и температуре от 45 до 85^oC. Смесь пастеризуют при температуре 952^oC с выдержкой от 30 до 40 минут или стерилизуют в ферментерах при давлении 0,05 МПа, охлаждают до температуры заквашивания 392^oC и заквашивают ассоциацией бифидобактерий, содержащих внутриклеточный биологически активный селен. Заквашенную смесь перемешивают в течение 102 минут и оставляют в покое. Сквашивание проводят при температуре 371^oC от 3 до 6 часов до образования молочного сгустка кислотностью 604^oТ. По окончании сквашивания охлаждают продукт до температуры 4-6^oC и разливают.

Поскольку заявитель ведет обширные исследования возможностей полезного использования ассоциации бифидобактерий, содержащих внутриклеточный биологически активный селен, его притязания не исчерпываются приведенными выше примерами.

Источники информации
1. HIDIROGLOU M., JENKIGH K.J., HOFFMAN J. Teneurs en selenium dans tissue des ruminants. Ann. Biol. Amin. Biochtm. Biophys., 1971, v.11, N 4, p. 695 – 704.

2. Авторское свидетельство СССР N 1686718, А 23 С 9/12, 1989.

Формула изобретения

1. Способ получения бактериального препарата на основе бифидобактерий, включающий приготовление питательной среды, охлаждение до температуры культивирования, внесение чистых культур бифидобактерий, культивирование с последующим выделением биомассы из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в питательную среду в процессе ее приготовления вносят селенит натрия и сернокислый магний в соотношении 1-1,25:1.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве чистых культур в среду вносят, по крайней мере, одну культуру или ассоциацию бифидобактерий, включающую Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis, и/или Bifidobacterium breve, и/или Bifidobacterium infantis в количестве от 1,0 до 1,5 об.% каждой культуры.

РИСУНКИ

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 31-2002

(73) Патентообладатель:

Бобова Ольга Евгеньевна (BY)

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 19.09.2002 № 15120

Извещение опубликовано: 10.11.2002

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 03.11.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 9-2004

Извещение опубликовано: 27.03.2004