Патент на изобретение №2170103

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ БЦЖ “ИМУРОН” ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Микробную массу культуры БЦЖ-1 фильтруют и разводят стабилизатором в два этапа. После первого разведения до концентрации 50 – 60 мг БЦЖ в 1 мл полученную взвесь центрифугируют при факторе разделения 250 в течение 5 мин, после чего проводят разведение до конечной концентрации 25 или 30 мг БЦЖ в 1 мл. Вакцину разливают по 1 мл в ампулы и лиофилизируют. Изобретение позволяет получать стандартную лечебную вакцину с концентрацией 25 или 30 мг БЦЖ в 1 мл с более высокими показателями жизнеспособности, гомогенности, дисперсности и растворимости. 2 табл.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам получения вакцины, предназначенной для профилактики рецидивов поверхностного (T_a, T₁) рака мочевого пузыря после оперативного (трансуретральная резекция) удаления опухолей, а также для лечения рака in situ и поверхностных опухолей мочевого пузыря размером менее 1 см, оперативное удаление которых невозможно.

Известен способ получения вакцины БЦЖ, применяемой для специфической профилактики туберкулеза, заключающийся в том, что микробную пленку культуры клеток БЦЖ-1, выращенную на твердой картофельной среде, а затем в жидких синтетических средах, снимают, фильтруют, растирают в шуттель-аппарате, после чего разводят стабилизатором – 1,5% раствором глутамината натрия до содержания 1 мг вакцины БЦЖ в 1 мл. Разведенную вакцину разливают в ампулы и лиофилизируют под вакуумом (“Справочник по применению бактериальных и вирусных препаратов” под редакцией Дзагурова С.Д. и Резепова Ф.Ф. – М.: Медицина, 1975, с. 179).

Недостатком известного способа является то, что данная вакцина предназначена для специфической профилактики туберкулеза и одна ампула препарата содержит 1 мг вакцины БЦЖ в 1 мл.

Для иммунопрофилактики и иммунотерапии поверхностных форм рака мочевого пузыря используется внутрипузырное введение 100-150 мг вакцины БЦЖ. Для инстилляции больному необходимого количества вакцины БЦЖ нужно вскрыть 100-150 ампул, что приводит к нестандартности дозы, а также значительному выбросу живой БЦЖ в окружающую среду (препарат под вакуумом).

Целью изобретения является создание вакцины БЦЖ для иммунотерапии рака мочевого пузыря с более высокой концентрацией культуры клеток в 1 мл и обладающей высокой жизнеспособностью, гомогенностью, дисперсностью и растворимостью.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе получения вакцины БЦЖ для иммунотерапии рака мочевого пузыря, согласно которому микробную массу культуры БЦЖ-1 фильтруют, растирают в шуттель-аппарате, разводят стабилизатором и лиофилизируют в ампулах, разведение проводят в два этапа, при этом после первого разведения до концентрации 50 – 60 мг БЦЖ в 1 мл полученную взвесь центрифугируют при факторе разделения 250 в течение 5 минут, после чего проводят разведение до конечной концентрации 25 или 30 мг БЦЖ в 1 мл.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.

Вакцина, впервые полученная предлагаемым способом, предназначена для иммунотерапии рака мочевого пузыря.

Предложенный способ позволяет получить стандартную лечебную дозу препарата с концентрацией 25-30 мг БЦЖ в 1 мл, обладающего более высокими показателями жизнеспособности, гомогенности, дисперсности и растворимости (табл. 1).

Это достигается за счет дополнительного введения центрифугирования и проведения разведения в два этапа.

Способ осуществляется следующем образом.

Вакцина представляет собой живые микробактерии вакцинного штамма БЦЖ-1, лиофилизированные в 1,5% растворе глутамината натрия.

Живые микробактерии штамма БЦЖ-1, размножаясь внутриклеточно, приводят к неспецифической стимуляции клеточного иммунного ответа. Для получения вакцины используют штамм БЦЖ-1, который должен отвечать следующим требованиям:
1. Состоять из жизнеспособных микробактерий штамма БЦЖ-1.

2. Не содержать вирулентных микробактерий.

3. Не содержать посторонней микрофлоры.

4. Достоверно увеличивать количество Т- и В-лимфоцитов на 7-е и 14-е сутки у беспородных мышей при подкожном введении 0,01 мг БЦЖ.

5. Стимулировать гиперчувствительность замедленного типа на 5-е сутки на эритроциты барана у беспородных мышей при подкожном введении БЦЖ-1 в дозе 0,2 мг.

6. Стимулировать активность перитонеальных макрофагов у беспородных мышей на 7-е сутки при подкожном введении БЦЖ в дозе 0,01 мг (Медуницин Н.В. Вакцинология. – М., 1999 г.; Лукшт Н.В. Стандартизация параметров качества вакцины БЦЖ в тестах in vitro и in vivo. Автореферат. – М., 1980 г.).

Высев из ампул со штаммом БЦЖ-1, полученным из ГИСК им. Л.А. Тарасовича, осуществляют на картофельную среду Павловского. На 20-25 сутки выращивания в термостате при температуре (38 1)^oC культуру БЦЖ-1 пересевают на жидкую среду Вакенгут, Козловской и Лещинской (ВКЛ) – матриксы N 1. Выросшую на 6-10 сутки на поверхности жидкой среды культуру БЦЖ-1 переносят ракеткой на поверхность свежей питательной среды ВКЛ – матриксы N 2. Матриксы N 2 на 6-8 сутки роста используют для засева пленочным методом среды ВКЛ в производственных колбах емкостью 0,5 л.

Вакцину изготавливают из культуры БЦЖ-1 11-суточного возраста, отбирая культуру с сухими, морщинистыми пленками, покрывающими всю поверхность среды. Сглаженные, влажные и растущие отдельными островками пленки не пригодны для изготовления вакцины. Тщательно отобранную культуру БЦЖ-1 (12-15 колб) фильтруют в один аппарат для фильтрации. Микробные тела отделяют от питательной среды, промывают средой высушивания и охлаждают в холодильнике 30 минут. Во время изготовления вакцина должна быть защищена от действия света (Тогунова А. И. Иммунизация живой вакциной против туберкулеза. – М.: Медгиз, 1960 г.).

Микробную массу растирают в бутыле с металлическими бусами в шуттель-аппарате до получения однородной массы при температуре от 10 до 18^oC в течение 20 минут при частоте 75 об/мин. Далее микробную массу разводят стабилизатором – средой высушивания до получения взвеси, содержащей приблизительно 50-60 мг БЦЖ в 1 мл. Эту взвесь асептично переносят в стеклянные флаконы объемом 250 мл и центрифугируют при факторе разделения 250 в течение 5 минут.

Надосадочную взвесь из флаконов асептично отсасывают и снова разводят средой высушивания (1,5% раствором глутамината натрия) до конечной концентрации 25 или 30 мг БЦЖ в 1 мл. Точность разведения проверяют по фотоэлектроколориметру. Вакцину разливают по 1 мл в ампулы и лиофилизируют.

Пример 1.

Для получения концентрации 25 мг БЦЖ в 1 мл культуры штамма БЦЖ-1 высевают на плотную картофельную среду Павловского, выращивают в термостате 22 дня при температуре (381)^oC, пересевают на жидкую среду ВКЛ-4 матрикса N 1. Выросшую на 7 сутки на поверхности жидкой среды культуру БЦЖ-1 переносят ракеткой на поверхность свежей питательной среды ВКЛ-8 матриксов N 2.

Матриксы N 2 на 7 сутки роста используют для засева пленочным методом среды ВКЛ в 15 производственных колбах, емкостью 0,5 литра – таким образом производится накопление биомассы. Тщательно отобранную культуру БЦЖ-1 (13 колб) фильтруют, промывают средой высушивания и охлаждают в холодильнике в течение 30 минут.

Микробную массу растирают в бутыле с металлическими бусами в шуттель-аппарате до получения однородной массы при температуре 11^oC в течение 20 минут при частоте 75 об/мин. Далее микробную массу разводят средой высушивания (1,5% раствором глутамината натрия) до получения взвеси, содержащей 50 мг БЦЖ в 1 мл (первое разведение), центрифугируют при факторе разделения 250 в течение 5 минут, разводят средой высушивания до содержания 25 мг БЦЖ в 1 мл (второе разведение), разливают по 1 мл в ампулы и лиофилизируют.

В клинической практике доказана эффективность использования вакцины БЦЖ для профилактики рецидивов поверхностного (стадии T_a, T_l) рака мочевого пузыря после оперативного (трансуретальная резекция – ТУР) удаления опухолей, а также для лечения рака in situ и поверхностных опухолей мочевого пузыря размером менее 1 см, оперативное удаление которых невозможно.

Пример 2.

Профилактическая внутрипузырная БЦЖ-терапия проведена 26 больным с поверхностным множественным поражением слизистой мочевого пузыря, которым были произведены радикальные операции. Среди них было 19 мужчин и 7 женщин. Возраст больных варьировался от 36 до 69 лет.

Средний возраст составлял 52 года. У 5 больных был первичный и у 21-рецидивный рак мочевого пузыря (РМП). Стадия заболевания соответствовала T_a-T_lNxMO.

До начала лечения всем больным было проведено клиническое, рентгеноскопическое, ультразвуковое и эндоскопическое обследование, изучен иммунный статус, проводилась внутрикожная проба с туберкулином.

Из 26 больных рецидивы заболевания появились у 8 пациентов (30,8%). У 18 больных (69,2%) наблюдалось безрецидивное течение заболевания в течение 6-33 месяцев. Сравнивались результаты профилактического использования химиотерапии (XT) и иммунотерапии вакциной БЦЖ у больных поверхностным РМП после радикальных операций.

Таким образом, внутрипузырная иммунотерапия вакциной БЦЖ обладает преимуществом перед профилактической внутрипузырной XT в плане уменьшения частоты рецидивов. Следует отметить, что профилактическое применение внутрипузырной БЦЖ-терапии позволяет не только уменьшить частоту возникновения рецидивов и продлить безрецидивный период, но также уменьшает частоту прогрессии опухоли и улучшает отдаленные результаты.

Пример 3.

Наряду с профилактическим применением внутрипузырной иммунотерапии и XT возможно их применение с лечебной целью, когда из-за множественности поражения слизистой мочевого пузыря поверхностными опухолями размером до 1 см невозможно радикальное удаление всех опухолей.

Внутрипузырная иммунотерапия вакциной БЦЖ проведена 31 больному. Женщин было 16, мужчин – 15. Пациенты были в возрасте от 33 до 78 лет, средний возраст – 55,4 года. У 8-й из них была первичная и у 23 – рецидивная опухоль. До начала лечения проводилось полное обследование больных с обязательной биопсией и цитологическим исследованием мочи. У всех больных верифицирован переходноклеточный РМП, у всех диагностировано множественное поверхностное поражение, соответствующее стадии T_lNxMO. Количество опухолей варьировалось от 3 до тотального поражения мочевого пузыря. Размер опухолей колебался от 0,2 до 3 см.

Для внутрипузырной иммунотерапии использованы две схемы лечения (инстилляции 100 мг и 150 мг вакцины БЦЖ). Также сравнивалась эффективность внутрипузырной химиотерапии и иммунотерапии. Эти данные представлены в табл. 2.

Наибольшую эффективность при лечении поверхностного РМП среди химиопрепаратов показал фарморубицин, при применении которого полная регрессия опухоли зарегистрирована у 26,7% и частичная – у 40% больных (всего 66,7%). Эффективность вакцины БЦЖ была достоверно выше эффективности всех химиопрепаратов: полная ремиссия отмечалась у 41,7% и частичная – у 50% больных (всего 91,7%) при дозе 150 мг.

Прямым показанием к применению внутрипузырной БЦЖ-терапии является наличие рака in situ, эффективность БЦЖ-терапии рака in situ достигает 94%.

Таким образом, внутрипузырная БЦЖ-терапия является эффективным средством лечения и профилактики поверхностного рака мочевого пузыря.

Формула изобретения

Способ получения вакцины БЦЖ для иммунотерапии рака мочевого пузыря, согласно которому микробную массу культуры БЦЖ-1 фильтруют, растирают в шуттель-аппарате, разводят стабилизатором и лиофилизируют в ампулах, отличающийся тем, что разведение проводят в два этапа, при этом после первого разведения до концентрации 50-60 мг БЦЖ в 1 мл полученную взвесь центрифугируют при факторе разделения 250 в течение 5 мин, после чего проводят второе разведение до конечной концентрации 25 или 30 мг БЦЖ в 1 мл.

РИСУНКИ

PD4A – Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 32-2003

(73) Новое наименование патентообладателя:

Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи РАМН (RU)

Извещение опубликовано: 20.11.2003

PD4A – Изменение наименования обладателя патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН (RU)

Адрес для переписки:

123098, Москва, ул.Гамалеи, 18, НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Извещение опубликовано: 10.02.2010 БИ: 04/2010

PD4A Изменение наименования, фамилии, имени, отчества патентообладателя

(73) Патентообладатель(и):

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (RU)

Дата публикации: 10.04.2011