Патент на изобретение №2170100

(54) СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ ПТИЦ, СЛИТЫЙ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫЙ БЕЛОК И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложенный способ заключается в том, что птице вводят эффективное количество гетерологичного белка, содержащего альфа-субъединицу белка ингибина птиц или ее иммуногенный фрагмент и белок-носитель. Гетерологичный белок может быть либо ингибином, конъюгированным с белком-носителем, либо ингибином, слитым с белком-носителем. Способ получения слитого гетерологичного белка включает введение двухцепочечной комплементарной ДНК, кодирующей ингибин или его фрагмент, в вектор, который кодирует белок-носитель, такой как связывающий мальтозу белок или бычий сывороточный альбумин. После введения вектора в систему экспрессии в ней экспрессируется слитый гетерологичный белок. После очистки экспрессированного гетерологичного белка эффективное количество этого белка назначают животному, так что у животного возникает ответная иммунологическая реакция. Изобретение позволяет увеличить производство яйцеклеток у птиц, ускорить начало яйценоскости и увеличить продолжительность периода яйценоскости. 3 с. и 17 з.п.ф-лы, 3 ил., 4 табл.

Изобретение является частичным продолжением заявки на Патент США с серийным номером 08/202964, поданной 28 февраля 1994.

Настоящее изобретение относится в общем случае к способу ускорения полового созревания у птиц, в частности, у бескилевых и Psittaciformes, путем назначения ксеногенного белка, содержащего белок ингибин или его фрагмент и белок-носитель. Настоящее изобретение относится также к способу увеличения продуцирования яйцеклеток у животных, в частности, у птиц, особенно у бескилевых, путем назначения ксеногенного белка, содержащего белок ингибин или его фрагмент и белок-носитель. Настоящее изобретение относится далее к ксеногенному белку, содержащему белок ингибин или его фрагмент и белок-носитель, и способу получения ксеногенного белка, в котором ингибин либо слит, либо конъюгирован с белком-носителем.

Бескилевые представляют собой неспособных летать обычно крупных бегающих птиц, состоящих из нескольких отрядов, включающих такие виды, как страус, эму, нанду, казуар и киви. Эму (Dromiceius novaehollandiae) является австралийской бескилевой птицей, которую отличает наличие рудиментных крыльев и то, что ее голова и шея покрыты перьями. Рост среднего взрослого эму составляет приблизительно 6 футов (180 см), а вес приблизительно 150 фунтов (68 кг). Страус (Struthio camelius) представляет собой крупную бегающую птицу с короткими крыльями и толстыми мощными ногами. Рост обычного страуса составляет приблизительно 8 футов (240 см), а вес приблизительно от 325 до 375 фунтов (от 147 до 170 кг). Термин “нанду” является обычным для членов отряда птиц Rheiformes.

Rheiformes являются отрядом Южноамериканских бегающих птиц, называемых американскими страусами, которые отличаются от истинных страусов среди прочих своим меньшим размером, наличием перьев на голове и шее и трехпалыми ногами. Страус и эму давно ценятся в их естественном окружении, соответственно, в Южной Америке и в Австралии. Продукты, получаемые от страуса, пользуются спросом уже более ста лет, и во всем мире находят сбыт их шкуры, мясо и перья. Например, кожу страуса используют при изготовлении обуви, дамских сумочек, курток, атташе-кейсов, кошельков и многих других изделий. Перья страуса применяют для отделки одежды, платьев и для изготовления пылеуловителей. Например, перья страуса продаются в Европе приблизительно от 60 до 1200 долларов за килограмм. Кроме того, считается, что перья страуса являются “магнитном пыли”, а потому широко используются в США и за рубежом в компьютерной технике и в автомобильной промышленности.

Напротив, эму относительно недавно появились на рынке. Ценятся те же самые их продукты, а также эфирное масло, которое используется в косметической промышленности. Масло эму, которое вытапливают из толстого слоя подкожного жира, обладает способностью глубоко проникать в ткани, а потому это масло полезно для изготовления косметических кремов, таких как смягчающие составы для предотвращения образования морщин. В настоящее время исследуется возможность применения масла эму в медицине, например при лечении артрита. Типичный взрослый эму может достигать высоты от 1,6 до 1,9 м или более и веса от 30 до 45 кг или более. Зрелые эму в возрасте приблизительно один год и препубертантные и постпубертантные эму не показывают связанные с полом фенотипные различия. Аналогично страусам в течение нескольких последних лет наблюдается стремительный рост популяции эму в Соединенных Штатах. В 1994 году в США было приблизительно всего 150000 эму, в том числе 15000 размножающихся пар. Предполагают, что количество эму в 1995 году увеличится до величины от 500000 до 750000 птиц, из которых 45000 будут составлять размножающиеся пары.

В ряде стран, включая Австралию, Бельгия Израиль, Канаду, Голландию, Намибию, Южно-Африканскую Республику и Зимбабве, наблюдается рост спроса на продукты, получаемые от бескилевых. Так, в течение нескольких лет на внутреннем рынке наблюдается стремительный рост спроса на страусов и эму и в меньшей степени на нанду. За последние пять лет количество размножающихся пар страусов и общее количество птиц в Соединенных Штатах увеличилось, соответственно, в 7,5 раз и 20 раз. По оценкам в 1995 году в Соединенных Штатах будет 200000 страусов, в том числе 20000 размножающихся пар. Огромный интерес к выращиванию этих животных вызван высокой стоимостью взрослых, а также молодых животных и особенно установленных размножающихся пар страусов, цена которых составляет 75000 долларов, а цена пары эму составляет 30000 долларов и более. Цена молодых страусов в возрасте от трех до четырех месяцев составляет приблизительно 7500, а стоимость молодого эму оценочно составляет приблизительно 5000 долларов. Большинство животных покупают, когда их возраст составляет от трех до шести месяцев.

Далее, огромный интерес проявляется к бескилевым как к альтернативе более традиционным формам животноводства. Несколько присущих бескилевым факторов обеспечивают им преимущество перед более традиционными формами животноводства (т.е. разведением крупного рогатого скота, свиноводством и овцеводством). Этими факторами являются: более высокая степень усвоения пищи, лучшая приспособленность для интенсивного разведения, большой размер животных, высокая производительность и исключительная питательная ценность их мяса.

Например, мясо страуса, которое представляет собой мясо красного цвета, напоминающее говядину, содержит значительно меньше жира, калорий и холестерина, чем мясо цыплят и индейки. В частности, порция мяса страуса весом 85 граммов содержит 2 грамма жира, 58 мг холестерина и 97 калорий. Напротив, порция мяса индейки весом 85 граммов содержит 3 грамма жира, 59 мг холестерина и 135 калорий. Порция мяса цыпленка весом 86 граммов содержит 3 грамма жира, 73 мг холестерина и 140 калорий. Порция говядины (для жаренья) весом 85 граммов содержит 15 граммов жира, 77 мг холестерина и 240 калорий. И, наконец, порция свинины весом 85 граммов содержит 19 граммов жира, 84 мг холестерина и 275 калорий. (Данные для мяса страуса получены из Отчета 0800100 лаборатории качества AMSI. Данные для других видов мяса взяты из справочника U. S. D.A.Handbook N 8, “Nutritive Value of Foods”.) Аналогично страусам, мясо эму представляет собой мясо красного цвета, которое содержит мало жира. В частности, порция мяса эму весом 100 граммов содержит 1,7 грамма жира, 57,5 мг холестерина и 109 калорий. (Данные для мяса эму получены от компании “Siliker Laboratories of Texas, Inc.”).

Кроме того, бескилевые, такие как страус, дают приблизительно 100 фунтов (45,3 кг) мяса в возрасте 12 месяцев, а потому производят значительное количество мяса за относительно короткий период времени.

Иллюстрацией того, насколько велико преимущество бескилевых над более традиционными формами животноводства, является следующее сравнение между страусом и коровой. Во-первых, период созревания и инкубации для страуса составляет 42 дня, в то время как аналогичный период для коровы составляет 280 дней. Во-вторых, средний страус дает потомство более чем 20 голов в год, в то время как корова дает лишь одного теленка. В-третьих, степень усвоения пищи для страуса составляет менее чем 2:1, в то время как степень усвоения пищи для коровы составляет 5:1. В-четвертых, количество дней от оплодотворения яйцеклетки до убоя составляет приблизительно 407 дней для страуса по сравнению с 645 днями для коровы. Наконец, страусы, помимо мяса и кожи, дают перья, в то время как коровы не дают никаких продуктов, помимо мяса и кожи.

Учитывая указанные обстоятельства и возрастающую потребность населения мира в мясе, которое обладает питательной ценностью, но содержит тем не менее мало жира и холестерина, и которое может быть эффективно произведено при минимальном негативном воздействии на окружающую среду, индустрия бескилевых обладает высоким потенциалом для роста в будущем.

В настоящее время спрос на бескилевых далеко превосходит предложение. Однако заводчики бескилевых ограничены тем, что производство яиц многими размножающимися самками меньше оптимального. В зависимости от вида большинство бескилевых в неволе откладывают в среднем 10-20 яиц в год, в то время как их генетический потенциал для производства яиц, как полагают, превышает 60 яиц в год. Например, высокопроизводительный страус в диких условиях способен откладывать в период размножения яйцо приблизительно через каждые 48 часов, а высокопроизводительный эму в диких условиях способен откладывать в период размножения яйцо каждые 72 часа. Напротив, в неволе страусу часто требуется от 5 до 10 дней, чтобы отложить яйцо, а эму, чтобы отложить яйцо, требуется от 4 до 8 дней.

Рынок бескилевых, предназначенных на убой, не сможет вырасти до тех пор, пока ежегодно не будет производиться достаточное количество потомства. По некоторым оценкам для поддержания уровня рынка бескилевых, предназначенных на убой, ежегодно должно появляться на свет, по крайней мере 250000 животных. По этой причине способ увеличения производства яиц значительно увеличит рост рынка. Таким образом, существует потребность в композициях и способе увеличения производства яиц у птиц, в частности у бескилевых, таких как страусы и эму.

Существует также необходимость в композиции и способе увеличения производства яиц экзотических птиц, таких как Psittaciformes . Psittaciformes включают попугаев и представляют собой состоящий из одного семейства отряд птиц, которые проявляют зигодактилизм и имеют сильный искривленный клюв. Попугай определяется как член семейства птиц Psittacidae (единственное семейство Psittaciformes), который отличается коротким, прочным, сильно искривленным клювом.

Недавно гормон ингибин исследовался в качестве потенциального средства увеличения овуляции у млекопитающих. Ингибин является пептидным гормоном, который в основном продуцируется половыми железами, в частности, растущими фоликулами. У млекопитающих он выполняет функцию ингибирующего регулятора секреции гипофизарного фолликулостимулирующего гормона, который осуществляет функцию обратной связи. Хотя существование ингибина постулировано более 60 лет назад, его выделение химическими методами осуществлено лишь недавно.

Ингибин млекопитающих представляет собой димерный белковый гормон, который состоит из -субъединицы (с молекулярным весом 18000) и -субъединицы (с молекулярным весом 14000). -Субъединица является уникальной для ингибина, поскольку димеры -субъединицы образуют активин, гормон, который высвобождает фолликулостимулирующий гормон из гипофиза, -Субъединица существует в двух формах (_A и _В), которые различаются, но весьма похожи. По этой причине в зависимости от наличной -субъединицы ингибин может существовать как ингибин-А или ингибин-Б. Обе субъединицы, когда они соединены дисульфидными связями, необходимы для проявления биологической активности при подавлении секреции фолликулостимулирующего гормона из гипофиза. Последовательность аминокислотных остатков -субъединицы ингибина приблизительно на 80 – 90% совпадает для образцов, выделяемых из свиней, коровы, человека, мышей и домашних цыплят. Превосходными обзорами по выделению, получению, анализу и биологическому действию ингибина является Risbridger et al., “Current Perspectives of Inhibin Biology”, Acta Endocrinologica (Copenh), 122: 673-682 (1990); и C.Rivier et al., “Studies of the Inhibin Family of Hormones: A Review”, Hormone Research, 28: 104-118 (1987), которые приводятся здесь для справок. У животных и птиц фолликулостимулирующий гормон играет роль в процессе роста и развития фолликул, в то время как лютенизирующий гормон, как полагают, индуцирует овуляцию. Несколько факторов мозга и половых желез (пептидных и стероидных гормонов) конкулируют между собой за контроль над высвобождением гормона гонадотропина. Из указанных факторов гонадотропин-высвобождающий гормон и ингибин оказывают противоположное контролирующее воздействие на гипофизарную секрецию фолликулостимулирующего гормона у млекопитающих. Гонадотропин-высвобождающий гормон представляет собой декапептид мозга, который стимулирует секрецию фолликулостимулирующего гормона и лютенизирующего гормона, в то время как ингибин представляет собой гормон половых желез, действие которого вероятно направлено на селективное ингибирование секреции фолликулостимулирующего гормона у млекопитающих.

Основы знаний о процессе овуляции у птиц необходимы для понимания роли ингибина в осуществлении эндокринного контроля над овуляцией у птиц. Растущие фолликулы у функционально зрелого яичника домашних кур существуют в определенной иерархии по размерам. Типичный яичник содержит от четырех до шести больших (от двух до четырех сантиметров в диаметре) наполненных желтком фолликул (от F1 до F4, F6), которых сопровождает большее количество меньших по размеру (от двух до десяти миллиметров) желтых фолликул и множество очень маленьких белых фолликул. Наибольшая предовуляционная фолликула (F1) предназначена для овуляции на следующий дань, вторая по величине (F2) – на другой день (приблизительно на 26 часов позднее) и так далее. Контроль за восстановлением фолликул и их развитием внутри указанной иерархии пока недостаточно выяснен. Участие гонадотропина из гипофиза было доказано, однако роль ингибина при контролировании секреции гонадотропина птиц и контролировании овуляции остается неясной.

Недавняя стратегия для индуцирования гиперовуляции у млекопитающих заключалась в развитии способов, которые заключаются в нейтрализации активности эндогенного ингибина. Например, изучалась активная иммунизация млекопитающих против различных ингибин-содержащих соединений. Иммунонейтрализация ингибина сопровождается повышенной скоростью овуляции у телок, овец, молодых свинок и крыс.

Обнаруженное у млекопитающих, которым вводили вакцины антигенных препаратов ингибина, ускорение овуляции, как полагают, является следствием повышения уровня содержания в плазме фолликулостимулирующего гормона, который приводит к усилению развития фолликул в яичнике. В этих исследованиях применялись вакцины различных антигенов, которые доказали увеличение скорости овуляции у млекопитающих. Некоторые из исследованных антигенов включают: фрагменты -субъединицы ингибина, полученные из рекомбинантной ДНК (Wrathall et al., “Effects of active immunization against a synthetic peptide sequence of inhibin -subunit of plasma gonadotropin concentrations, ovulation rate and lambing rate in ewes”, J. Reprod. Fert., 95: 175-182, 1992; и Meyer et al. , “Antiserum to an Inhibin Alpha-Chain Peptide Neutralizers Inhibin Bioactity and Increases Ovulation Rate in Sheep”, Scientific Journal Series of the Minnesota Agric. Exp. Sta. paper N. 17103, 1991), синтетические пептидные реплики N-концевой последовательности – субъединицы бычьего ингибина, связанной альбумином (Glencross et al., “Effects of active immunization of heifers against inhibin of plasma FSH concentrations, ovarian follicular development and ovulation rate”, Journal of Endocrinology, 134, 11-18, 1992): синтетические пептидные последовательности – субъединицы бычьего ингибина, связанной альбумином сыворотки человека (Morris et al., “Effect of immunization against synthetic peptide sequences of вovine inhibin -subunit of ovulation rate and twin-calving rate in heifers”, Journal of Reproduction and Fertility, 97: 255-261, 1993), и частично очищенный ингибин из фолликулярной жидкости коровы (Morris et al., “Effect of Immunizing Prepuberal Lambs of Low and High Ovulation Rate Genotypes with Inhibin Partially Purified from Bovine Fluid”, Theriogenology, Vol. 35, N 2, 1991).

Несмотря на противоречивые сведения о том, как меняется содержание фолликулостимулирующего гормона во время цикла овуляции, во всех циклах изученных млекопитающих иммунонейтрализация эндогенного ингибина приводит к значительному усилению развития фолликул в яичниках и увеличению скорости овуляции независимо от используемого антигена или видов млекопитающих, которым вводили пробу.

Как указано ранее, участие ингибина в процессе регулирования репродуктивной функции видов птиц остается неясным. Опубликованные в настоящее время сообщения ограничены репродуктивной функцией ингибина у домашних птиц. Большая часть этой литературы поддерживает теорию, согласно которой ингибин вероятно играет у домашних птиц ту же самую физиологическую роль, что и установленная для млекопитающих: у кур ингибин может служить регулятором восстановления и/или развития фолликул. Однако у птиц участие ингибина в контроле за скоростью овуляции может осуществляться, а может и не осуществляться за счет подавления секреции гипофизарного фолликулостимулирующего гормона. Например, хотя у кур с низкой яйценоскостью в плазме было обнаружено более высокое содержание ингибина и слоев гранулезных клеток в предовуляционных фолликулах, чем у кур с высокой яйценоскостью, никаких отличий в уровне содержания в плазме фолликулостимулирующего гормона, связанных со скоростью кладки яиц, не найдено. Wang et al., “Increase in Ovarian -Inhibin Gene Expression and Plasma Immunoreactive Inhibin Level is Correlated with a Decrease in Ovulation Rate in the Domestic Hen”, General and Comparative Endocrinology, 91, 52-58 (1993). В этой публикации, таким образом, высказывается предположение, что связанные со скоростью овуляции у кур изменения экспрессии гена -субъединицы ингибина и уровня содержания иммуноактивного ингибина в плазме не оказывают прямого воздействия на скорость овуляции путем модулирования содержания в плазме фолликулостимулирующего гормона. Далее, в публикации Р.А. Jonson, “Inhibin in the Hen”, Poultry Sciences. 72: 955-958 (1993), в которой для проведения успешного определения иммуноактивного ингибина в плазме кур используют бычью систему радиоиммуноанализа, тем не менее не обнаружен значительный пик иммуноактивного ингибина в течение цикла овуляции, несмотря на предовуляционный всплеск лютенизирующего гормона. Таким образом, роль ингибина в развитии фолликул у птиц остается невыясненной. Недавно – субъединица ингибина цыплят была успешно подвергнута клонированию и определению последовательности аминокислотных остатков. Wang and Jonson, “Complementary Deoxyribonucleic Acid Cloning and Sequence Analysis of the -Subunit of Inhibin from Chicken Ovarian Granulosa Cells”, Biology and Reproduction, 49, 1-6 (1993), которая полностью приводится здесь для справок. Сравнение последовательности ингибина птиц с известными последовательностями -субъединиц ингибина млекопитающих показывает 86-89%-ную гомологичность. Анализ по методу назерн-блоттинга с использованием двух выделенных зондов (cINA6 и cINA12) выявил, что -субъединица ингибина экспрессируется в гранулезных клетках яичника кур, но не экспрессируется в тканях мозга, почек, печени или селезенки кур.

Таким образом, биология ингибина в птицах по-прежнему плохо понятна, и не делалось попыток проследить ответную реакцию птиц на введение провокационных проб антигенного ингибина. Таким образом, поскольку рынок бескилевых в значительной степени ограничен меньшей, чем оптимальная, скоростью откладывания яиц многими страусами, эму и нанду, то необходима композиция или способ увеличения воспроизводства яиц у этих птиц. По этой причине необходимы также композиция и способ ускорения начала откладки яиц у птиц. Необходимы также композиции и способ увеличения периода яйценоскости птицы в течение ее жизни. Кроме того, в течение длительного времени сохраняется потребность в быстром, простом, надежном и недорогом способе определения, способна ли птица давать иммунологическую ответную реакцию на введение провокационной пробы в виде композиции антигенного ингибина. Кроме того, необходим быстрый, простой, надежный и недорогой способ определения, имеет ли птица гормональную предрасположенность обладать высокой или низкой яйценоскостью.

Потребность в композиции и способе увеличения воспроизводства яиц не ограничена лишь птицами. Сохраняется потребность в эффективной композиции и способе увеличения воспроизводства яйцеклеток у многих животных. Например, в течение длительного времени сохраняется потребность в увеличении воспроизводства яйцеклеток у большинства животных, которые разводятся в сельском хозяйстве, таких как свиньи, коровы, овцы и цыплята. В течение длительного времени сохраняется потребность в увеличении воспроизводства яйцеклеток у животных, имеющих мех, таких как норка, лисица, выдра, хорек и енот, а также высокая потребность для других животных, шкуры которых используются в декоративных целях. Необходимы также композиция и способ увеличения воспроизводства яйцеклеток для увеличения популяции многих животных, таких как экзотические виды или подверженные опасности виды, с целью предотвращения их вымирания. Далее, в течение длительного времени сохраняется потребность в увеличении воспроизводства яйцеклеток у животных, которые используются в гонках, для развлечений или шоу (соревнований), таких как лошади, собаки, кошки, животные, содержащиеся в зоопарках, и цирковые животные. Как свидетельствуют многочисленные примеры лечения бесплодия у человека, существует потребность увеличения воспроизводства яйцеклеток у человека. Таким образом, сохраняется потребность в композиции и способе увеличения овуляции у многих животных.

Настоящее изобретение относится к композиции и способу получения ксеногенного белка, содержащего ингибин или его фрагмент и белок-носитель. Белок ингибин или его фрагмент может быть ингибином птиц, ингибином млекопитающих или ингибином пресмыкающихся. Белок-носитель включает, помимо прочих, однако ими не ограничивается, белок, связывающий мальтозу, или бычий сывороточный альбумин. Предпочтительным белком-носителем является белок, связывающий мальтозу.

Ксеногенный белок может быть либо ингибином, конъюгированным с белком-носителем, либо ингибином, слитым с белком-носителем. Способ получения слитого ксеногенного белка включает введение комплементарной ДНК, которая кодирует экспрессию ингибина или его фрагмент, в вектор, содержащий кодирующую информацию для получения белка-носителя. После введения вектора в систему экспрессии в этой системе экспрессируется слитый ксеногенный белок. Преимущественно ксеногенный белок включает ингибин бескилевых, такой как ингибин страуса, ингибин эму и ингибин нанду.

Настоящее изобретение также относится к увеличению производства яйцеклеток у животных путем назначения ксеногенного белка по настоящему изобретению, который содержит ингибин или его фрагмент и белок-носитель. Способ заключается в назначении эффективного количества белка животному, так что воспроизводство яйцеклеток у животного увеличивается. Преимущественно у животного возникает иммунологическая ответная реакция, направленная против белка. Более предпочтительно иммунологическая ответная реакция направлена также против белка ингибина, продуцируемого животным (эндогенного ингибина). Способ приводит к увеличению воспроизводства яйцеклеток у женских особей животных, которые продуцируют ингибин, таких как млекопитающие, пресмыкающиеся и птицы, в частности, бескилевые птицы. В частности, указанный способ увеличивает воспроизводство яиц и женских особей бескилевых, таких как страус, эму и нанду.

Настоящее изобретение относится к способу ускорения начала яйценоскости у самок птиц, который включает стадию назначения самке птицы эффективного количества ксеногенного белка, содержащего альфа-субъединицу белка ингибина птиц или его фрагмент и белок-носитель, так что начало яйценоскости у птиц ускоряется. Настоящее изобретение относится также к способу увеличения количества яиц с низким содержанием холестерина, которые производятся самкой птицы, и включает стадию назначения самке птицы эффективного количества ксеногенного белка, содержащего альфа-субъединицу белка ингибина птиц или его фрагмент и белок-носитель, так что птица производит большее количество яиц с низким содержанием холестерина. Настоящее изобретение относится также к способу увеличения общей продолжительности периода яйценоскости у самок птиц, который включает стадию назначения самке птицы эффективного количества ксеногенного белка, содержащего альфа-субъединицу белка ингибина птиц или его фрагмент и белок-носитель, так что общая продолжительность периода яйценоскости у птиц увеличивается.

Настоящее изобретение относится также к способу получения антител, направленных против ксеногенного белка по настоящему изобретению. В общем случае способ получения антител, направленных против ксеногенного белка, заключается в назначении животному эффективного количества ксеногенного белка, содержащего белок ингибин или его фрагмент и белок-носитель, так что у животного возникает иммунологическая ответная реакция, направленная против ксеногенного белка. Наконец, у животного берут образец крови и из ее сыворотки выделяют антитела, направленные против ингибина. Антитела преимущественно выделяют из сыворотки, пропуская сыворотку через колонку, содержащую эффективные количества белка-носителя, с целью отделения антитела от сыворотки.

Далее, настоящее изобретение относится к быстрому, простому, надежному и недорогому способу определения, имеет ли птица гормональную предрасположенность к обладанию высокой или низкой яйценоскостью. Способ заключается в определении количества ингибина, продуцируемого животным, которое коррелирует со способностью животного производить яйцеклетки. Если коротко, то способ определения количества ингибина в крови животного заключается в отборе образца крови у животного и контактировании образца крови с антиингибиновыми антителами, которые специфично направлены против эндогенного ингибина животного. Образец крови контактирует с антиингибиновыми антителами в условиях, которые позволяют антителам селективно взаимодействовать с ингибином, который присутствует в образце. Затем не вступившие во взаимодействие антитела отделяют от вступивших во взаимодействие антител и определяют количество антител, которые вступили во взаимодействие.

Настоящее изобретение относится также к быстрому, простому, надежному и недорогому способу определения, дает ли животное иммунологическую ответную реакцию на введение провокационной пробы в виде композиций, содержащей ингибин. Если коротко, то способ включает связывание ингибина или ксеногенного белка по настоящему изобретению с твердой фазой и контактирование иммобилизованного ингибина с образцом крови животного, которого подвергают тестированию.

Образец контактирует с иммобилизованным ингибином в условиях, при которых ингибин селективно взаимодействует с антиингибиновыми антителами в образце. После удаления не вступивших во взаимодействие антител из образца добавляют некоторое количество содержащих метку антител второго животного, которые направлены против класса антител первого животного. Содержащие метку антитела, которые направлены против антител животного затем селективно взаимодействуют с антителами, которые связаны с иммобилизованным ингибином. После удаления непрореагировавших антител, содержащих метку, определяют наличие или количество вступивших во взаимодействие антител, содержащих метку, путем визуализации метки. Так, способ позволяет установить присутствие и количество антител, направленных против ингибина животного, а потому позволяет определить, способно ли животное давать иммунологическую ответную реакцию на введение композиции, содержащей ингибин.

Таким образом, целью настоящего изобретения является содержащая ингибин композиция, которая индуцирует иммунологическую ответную реакцию у животного при ее введении животному.

Еще одной целью настоящего изобретения является ксеногенный белок, содержащий ингибин или его фрагмент и белок-носитель.

Еще одной целью настоящего изобретения является композиция, включающая слитый ксеногенный белок, содержащий ингибин или его фрагмент.

Целью настоящего изобретения является также способ получения ксеногенного белка, в котором один из белков содержит ингибин или его фрагмент.

Еще одной целью изобретения является способ получения слитого ксеногенного белка, в котором один из белков содержит ингибин или его фрагмент.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ получения ксеногенного белка, содержащего ингибин или его фрагмент и белок-носитель.

Целью настоящего изобретения является способ ускорения начала яйценоскости (полового созревания) у птиц.

Целью настоящего изобретения является способ ускорения начала яйценоскости (полового созревания) у бескилевых, таких как страусы или эму.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ ускорения начала яйценоскости (полового созревания) у Psittaciformes.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ увеличения общей продолжительности яйценоскости птицы в течение ее жизни.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ уменьшения или устранения необходимости в линьке яйценесущих птиц.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ, позволяющий заставить птиц откладывать яйца, которые содержат меньшее количество холестерина, чем обычные яйца, откладываемые этими видами птиц.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ увеличения уровня воспроизводства яйцеклеток у животных.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ увеличения уровня воспроизводства яйцеклеток у млекопитающих.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ увеличения уровня воспроизводства яйцеклеток у людей.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ увеличения уровня воспроизводства яйцеклеток у коров.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ увеличения уровня воспроизводства яиц у пресмыкающихся.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ увеличения уровня воспроизводства яиц у птиц.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ увеличения уровня воспроизводства яиц у бескилевых, таких как страус и эму.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ увеличения уровня воспроизводства яиц у цыплят.

Еще одной целью настоящего изобретения является быстрый, простой, надежный и недорогой способ определения, дает ли животное иммунологическую ответную реакцию на введение провокационной пробы в виде композиции, содержащей ингибин или его фрагмент.

Еще одной целью настоящего изобретения является быстрый, простой, надежный и недорогой способ определения, имеет ли животное гормональную предрасположенность к обладанию высокой или низкой яйценоскостью.

Еще одной целью настоящего изобретения является быстрый, простой, надежный и недорогой способ определения, имеет ли птица гормональную предрасположенность к обладанию высокой или низкой яйценоскостью.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ получения антител, направленных против ингибина или его фрагмента.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ получения антител, направленных против ксеногенного белка, содержащего ингибин или его фрагмент.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ точного определения количества ингибина, содержащегося в крови животного.

Еще одной целью настоящего изобретения является композиция, содержащая антитела, направленные против антител другого животного.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ получения антител животного, направленных против антител другого животного.

Эти и другие цели, особенности и преимущества настоящего изобретения станут понятны после рассмотрения приведенного далее подробного описания вариантов осуществления настоящего изобретения и прилагаемой формулы изобретения.

На фиг. 1 приведен полиакриламидный гель для электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия, где А соответствует антителам анти (ингибин цыпленка связывающий мальтозу белок), В соответствует плазмиде pMAL-с, используемой в качестве стандартного вектора, С соответствует молекуле белка, применяемой в качестве стандарта массы, D соответствует реальному вектору pMAL-с, используемому для получения слитого ксеногенного белка, E соответствует очищенному слитому белку ингибин цыпленка – связывающий мальтозу белок (ксеногенному белку) по настоящему изобретению, a F соответствует элюенту после очистки, который не был загружен вместе со ксеногенным белком.

Фиг. 2 иллюстрирует воздействие иммунизации -субъединицей ингибина на количество яиц, откладываемых курицами за день (“HDEP”), для японского перепела с использованием связывающего мальтозу белка, слитого с белком, имеющим кодовое название сINA515. В частности, фиг. 2 является графическим представлением данных, приведенных в Таблице 2 Примера 8.

Фиг. 3 иллюстрирует воздействие иммунизации -субъединицей ингибина на количество яиц, откладываемых курицами за день (“HDEP”), для японского перепела с использованием связывающего мальтозу белка, слитого с белком, имеющим кодовое название cINA515, когда проводятся лишь две инъекции; контрольная и иммунизация ингибином. В частности, фиг. 3 является графическим представлением данных, приведенных в Таблице 3 Примера 8.

Термин “птица” или “домашняя птица” используется в настоящем описании для обозначения члена класса Aves животных, которые отличаются тем, что являются теплокровными откладывающими яйца животными, в основном приспособленными для летания. Термин “бескилевые” используется в настоящем описании для обозначения группы не способных влетать, в основном больших бегающих птиц, состоящих из нескольких отрядов и включающих эму, страусов киви и казуаров. Термин “Psittaciformes” в контексте настоящего изобретения обозначает попугаев, которые являются содержащим одно семейство отрядом птиц, проявляют зигодактилизм и имеют сильный кривой клюв. Под “попугаем” понимают любого члена семейства птиц Psittacidae (единственное семейство Psittaciformes), которые отличаются коротким, прочным, сильно искривленным клювом.

Термин “яйцо” используется в настоящем описании для обозначения большой женской яйцеклетки, заключенной в пористую известковую или кожаную оболочку, которая продуцируется птицей или пресмыкающимся. Выражение “продуцируется птицей или пресмыкающимся” используется в настоящем описании для обозначения акта кладки яйца птицей, или “откладки яиц”. Термин “зрелая яйцеклетка” используется для обозначения женской половой клетки, которую называют также яйцом. Таким образом, воспроизводство яйцеклеток у всех животных, за исключением птиц или пресмыкающихся, обозначает в настоящем описании воспроизводство и кладку зрелой яйцеклетки из яичника, или “овуляцию”. Таким образом, следует понимать, что термин “яйцо” используется для обозначения большой женской половой клетки, заключенной в пористую известковую или кожаную оболочку, которая продуцируется птицей или пресмыкающимся, или зрелой яйцеклетки, которая продуцируется всеми другими животными.

Термины “кладка яйца” или “половая зрелось” по отношению к птицам используются в настоящем описании как эквивалентные и обозначают тот момент, когда птица отложит свое первое яйцо. Таким образом, выражение “ускорение начала” кладки яиц или половой зрелости птиц в контексте настоящего изобретения обозначает индуцирование более ранней даты первой кладки яиц по сравнению с датой, когда птица отложила бы яйцо в обычных условиях.

Следует понимать, что способ “уменьшения содержания холестерина” в яйце в контексте настоящего изобретения обозначает способ заставить птицу откладывать одно или большее количество яиц с меньшим содержанием холестерина, чем среднее содержание холестерина в яйцах, откладываемых птицами того же вида.

Выражение “общая продолжительность яйценоскости в течение жизни” птицы определяет общее количество яиц, откладываемых птицей в течение всего периода ее жизни. Выражение количество яиц, откладываемых курицами за день, или “HDEP”, в контексте настоящего изобретения обозначает количество яиц, откладываемых конкретной группой куриц в день.

В отличие от термина птица или домашняя птица, термин “млекопитающее” используется в настоящем описании для обозначения члена класса Mammalia который представляет собой большой класс теплокровных позвоночных животных, в том числе животных, отличающихся наличием молочных желез, покрывающих тело волосами, тремя косточками в среднем ухе, мускулистой диафрагмой, отделяющий легочную и брюшную полости, красными кровяными тельцами, лишенными ядер, и эмбриональным развитием в аллантоисной и амниотической оболочках.

Термин “пресмыкающиеся” используется в настоящем описании для обозначения любого члена класса Reptilia, который представляет собой класс сухопутных позвоночных животных, характеризующихся отсутствием шерсти, перьев и молочных желез, при этом их кожа покрыта чушуей, у них трехкамерное сердце, а их легочная и брюшная полости не отделены друг от друга.

Ксеногенный белок в контексте настоящего описания обозначает белок, содержащий ингибин или его фрагмент и белок-носитель. Следует понимать, что термины “ингибин” и “фрагмент ингибина” являются взаимозаменяемыми в композиции ксеногенного белка, способе получения ксеногенного белка и методе использования ксеногенного белка по настоящему изобретению.

Следует также понимать, что “cINA515” используют для обозначения последовательности, имеющей 515 пар оснований (Последовательность с номером идентификации 1), или для обозначения последовательности, имеющей 516 пар оснований (Последовательность с номером идентификации 3), или для обозначения соответствующей последовательности cINA6, приведенной на странице 3 (начиная с пары оснований с номером 790 и кончая приблизительно парой оснований с номером 1310) статьи Wang and Johnson, “Complementary Deoxyribonucleic Acid Cloning and Sequence Analysis of the -Subunit of Inhibin from Chicken Ovarian Granulosa Cells”, Biology of Reproduction, 49, 1-6 (1993),
которая полностью приводится здесь для справок, и полученной из геномной ДНК цыпленка. cINA515 кодирует часть альфа-субъединицы ингибина страуса, такой как Последовательность с номером идентификации 2 или Последовательность с номером идентификации 4. В контексте настоящего описания “MBP-cINA515” обозначает конъюгат белка, который экспрессируется из рекомбинантной клетки-хозяина после клонирования cINA515 в рекомбинантную клетку-хозяина и экспрессии слитого ксеногенного белка, содержащего связывающий мальтозу белок и фрагмент альфа-субъединицы белка ингибина, кодируемого cINA515. Таким образом, “cINA515” обозначает последовательность нуклеотидов, а “MBP-cINA515” обозначает слитый ксеногенный белок.

Слитый ксеногенный белок в контексте настоящего описания определяется как белок, содержащий ингибин или его фрагмент, слитый с белком-носителем. Слитый ксеногенный белок экспрессируется из системы экспрессии, включающей слитый генный продукт, который содержит ген, кодирующий экспрессию белка ингибина или его фрагмента, слитого с геном, кодирующим экспрессию белка-носителя. Выражение “слитый генный продукт” в контексте настоящего изобретения означает продукт, получаемый в результате слияния гена, кодирующего экспрессию белка ингибина или его фрагмента, и гена, кодирующего экспрессию белка-носителя.

Конъюгированный ксеногенный белок в контексте настоящего описания обозначает белок, содержащий ингибин или его фрагмент, конъюгированный с белком-носителем. Конъюгированный ксеногенный белок получают, осуществляя химическую реакцию, в результате которой белок ингибин соединяется с белком-носителем посредством ковалентной связи.

Иммунологическая ответная реакция животного на вещество, которое ему введено, в контексте настоящего описания обозначает регулируемую клетками и/или гуморальную ответную реакцию животного, которая специфично направлена против введенного вещества.

Выражение “избирательно взаимодействует” в контексте настоящего изобретения обозначает, что два объекта связываются друг с другом посредством ковалентной связи, нековалентной связи, электростатически, по механизму взаимодействия рецептор-лиганд, по механизму взаимодействия фермент-субстрат или посредством другого типа связывания или присоединения. Связывание является избирательным в том смысле, что два объекта взаимодействуют специфично, по специфическому месту или только друг с другом.

Настоящее изобретение относится в общем случае к композиции, которая используется в способе ускорения начала кладки яиц у птиц. Композиция включает ксеногенный белок, содержащий ингибин или его фрагмент и белок-носитель. Ингибин может быть получен от животного любого вида, которое производит ингибин. Ингибин включает среди прочих, однако ими не ограничивается, ингибин птиц, ингибин млекопитающих, ингибин пресмыкающихся, ингибин земноводных или ингибин рыб. Более конкретно ингибин млекопитающих может быть выбран, однако ими не ограничивается, из ингибина коровы, ингибина человека, ингибина лошади, ингибина кошки, ингибина собаки, ингибина овцы, ингибина норки, ингибина лисицы, ингибина выдры, ингибина хорька, ингибина енота и ингибина свиньи. Ингибин птиц может быть выбран, однако ими не ограничивается, из ингибина страуса, ингибина эму, ингибина нанду, ингибина казуара, ингибина киви, ингибина перепела, ингибина курицы и ингибина членов отряда Psittaciformes. Предпочтительным ингибином является ингибин птиц. Более предпочтительным ингибином является ингибин бескилевых. Еще более предпочтительным ингибином является ингибин страуса. Другим предпочтительным ингибином является ингибин эму. Еще одним предпочтительным ингибином является ингибин нанду. Еще одним предпочтительным ингибином является ингибин курицы. Наиболее предпочтительно ксеногенный белок по настоящему изобретению содержит альфа-субъединицу белка ингибина или его фрагмента и белок-носитель.

Ксеногенный белок по настоящему изобретению, содержащий белок ингибин или его фрагмент и белок-носитель, используется также в способе увеличения продолжительности общего периода яйценоскости птицы в течение ее жизни. Указанная композиция применяется также в способе увеличения уровня яйценоскости у животных. Эта композиция далее применяется в способе уменьшения содержания холестерина в яйцах птиц. Указанная композиция также применяется в способе уменьшения или устранения необходимости линьки птиц. Указанные способы и способ ускорения начала откладки яиц у птиц будет подробнее рассмотрен далее.

Ингибин или его фрагмент может быть выделен из жидкостей животного, экспрессирован из созданных методами генной инженерии клеток в системе экспрессии или получен синтетически путем проведения серии химических реакций. В частности, фрагмент ингибина может быть выбран, однако ими не ограничивается, из следующих композиций: -субъединица ингибина; -субъединица ингибина; фрагменты; -субъединицы ингибина или -субъединицы ингибина, полученные с помощью рекомбинантной ДНК; синтетические пептидные реплики фрагментов -субъединицы ингибина или -субъединицы ингибина; синтетические пептидные реплики N-концевых последовательностей -субъединицы ингибина или -субъединицы ингибина; фрагменты частично очищенного ингибина из фолликулярной жидкости; фрагменты эндогенной – субъединицы ингибина или – субъединицы ингибина; и фрагменты экзогенной – субъединицы ингибина или – субъединицы ингибина. Как указано ранее, фрагмент ингибина наиболее предпочтительно представляет собой – субъединицу ингибина или его фрагмент.

Ингибин в ксеногенном белке либо слит, либо конъюгирован с белком носителем, как это описано далее. Если ингибин слит с белком-носителем, то ксеногенный белок представляет собой “слитый ксеногенный белок”. Если ингибин конъюгирован с белком-носителем, то ксеногенный белок представляет собой “конъюгированный ксеногенный белок”. Предпочтительным ксеногенным белком является слитый ксеногенный белок.

Идентичность белка- носителя в ксеногенном белке не критична для настоящего изобретения. В ксеногенном белке может использоваться любой известный из области техники белок-носитель. Белок-носитель, который может использоваться по настоящему изобретению, может быть выбран, однако этим не ограничивается, из следующей группы: белок, связывающий мальтозу; бычий сывороточный альбумин; гемоцианин лимфы улитки; овальбумин; фрагеллин; сывороточный альбумин любых видов животных; гамма-глобулин любых видов животных; изогенные клетки; изогенные клетки, содержащие Ia антигены; и полимеры D – и/или L-аминокислот. Предпочтительным белком-носителем является белок, связывающий мальтозу. Другим предпочтительным белком- носителем, если ксеногенный белок не будет назначаться корове или лошади, является бычий сывороточный альбумин. Наконец, еще одним предпочтительным белком-носителем, если ксеногенный белок не будет назначаться птице, является овальбумин. Наиболее предпочтительным белком-носителем является белок, связывающий мальтозу. Белок-носитель предпочтительно должен быть иммуногенным по отношению к животному, которому он назначается.

Настоящее изобретение относится также к способу получения конъюгированного ксеногенного белка по настоящему изобретению. Способы получения конъюгированных белков хорошо известны из области техники. Методы конъюигрования белков с белками подробно описаны в публикации “Antibodies, A Laboratory Manual” (Editors Ed Harlow & David Lane) Cild Spring Harbor Lab (1988), которая приводится здесь для справок.

Хотя конъюгированные белки могут использоваться по настоящему изобретению, слитые белки являются более предпочтительными. В частности, слитые ксеногенные белки дают гомогенный продукт, в котором различные сегменты белков всегда слиты в том же самом положении и слито то же самое количество сегментов белков. Кроме того, слитые ксеногенные белки получаются однородными, недорого и в больших количествах. Напротив, конъюгированные ксеногенные белки не столь однородны, как слитые белки. Например, в зависимости от того, конъюгирование каких белков проводится, реакция конъюгации может привести к смеси белков, имеющих одно или несколько связей, либо белки имеют связи в разных местах, либо белки остаются неконъюгированными. Далее, некоторые сопряжения могут привести к тому, что ксеногенный белок не сможет использоваться вследствие стерических препятствий (например, вследствие стерических препятствий станет недоступной иммуногенная часть белка). Кроме того, при проведении реакции конъюгации ее условия и реагенты могут привести к деградации получаемых белков. Например, в реакциях конъюгации обычно используют глютаровый альдегид, а он модифицирует конформацию белков. Далее, конъюгированные белки при получении их в больших количествах значительно дороже слитых белков.

Настоящее изобретение относится также к способу получения слитых ксеногенных белков. Слитые ксеногенные белки экспрессируются слитым генным продуктом, содержащим ген, кодирующий экспрессию белка ингибина или его фрагмента, и ген, кодирующий экспрессию белка-носителя. Слитый генный продукт и способ получения слитого генного продукта более подробно описан далее. Если коротко, то способ получения слитого ксеногенного белка по настоящему изобретению включает стадии введения слитого генного продукта в кодирующую область плазмиды, трансфекции клетки-хозяина с помощью плазмиды и экспрессии слитого ксеногенного белка из клетки-хозяина с использованием методов, хорошо известных из области техники.

Из области техники известно множество способов получения слитых ксеногенных белков. Поэтому для получения слитого ксеногенного белка по настоящему изобретению можно использовать любой способ, известный из области техники. Для получения слитого ксеногенного белка по настоящему изобретению могут быть использованы многие имеющиеся на рынке наборы векторов и систем экспрессии. Примером такого набора векторов и системы экспрессии является pMAL-c компании ” New England Biolabs” (Беверли, штат Массачусетс). Цитоплазменная экспрессия слитого ксеногенного белка происходит в системе pMAL-c. Способ получения слитого ксеногенного белка из набора pMAL-c подробно описан далее в Примерах 1 и 2. Другие источники векторов и систем экспрессии, которые могут использоваться для получения слитого ксеногенного белка по настоящему изобретению, включают, однако ими не ограничиваются: “Pharmacia Biotech” (Пискатауэй, штат Нью- Джерси) и “Clontech” (Пало-Альто, штат Калифорния).

Настоящее изобретение относится далее к слитому генному продукту, содержащему ген, кодирующий экспрессию белка ингибина или его фрагмента, и ген, кодирующий экспрессию белка-носителя. Ген ингибина может быть получен от любого вида животного, который продуцирует ингибин. Ген ингибин может быть среди прочих геном ингибина птицы, геном ингибина млекопитающего, геном ингибина пресмыкающегося, геном ингибина земноводного или геном ингибина рыбы. Более конкретно ген ингибина млекопитающего может быть выбран из группы, включающей, однако этим не ограничивается, ген ингибина коровы, ген ингибина человека, ген ингибина лошади, ген ингибина кошки, ген ингибина собаки, ген ингибина овцы, ген ингибина норки, ген ингибина лисицы, ген ингибина выдры, ген ингибина хорька, ген ингибина енота и ген ингибина свиньи. Ген ингибина птиц может быть выбран, однако ими не ограничивается, из гена ингибина страуса, гена ингибина эму, гена ингибина нанду, гена ингибина казуара, гена ингибина киви, гена ингибина индюка, гена ингибина перепела, гена ингибина домашней курицы и гена ингибина любого члена отряда Psittaciformes, гена ингибина любого из Falconiformes, гена ингибина любого из Piciformes, гена ингибина любого из Strigiformes, гена ингибина любого из Coraciformes гена ингибина любого из Ralliformes, гена ингибина любого из Passeriformes, гена ингибина любого из cuculiformes, гена ингибина любого из Columbiformes, гена ингибина любого из Galliformes (домашняя птица), гена ингбина любого из Anseriformes (гуси, утки и другие домашние водоплавающие птицы), гена ингибина любого из Herodiones и гена ингибина любой из следующих птиц: сокола, орла, ястреба, голубя, длиннохвостого попугая, какаду, попугая и птиц, сидящих на насесте (таких как певчие птицы, сойка, черный дрозд, зяблик, славка и воробей). Предпочтительным геном ингибина является ген ингибина птицы. Более предпочтительным геном ингибина является ген ингибина бескилевых. Особенно предпочтительным геном ингибина является ген ингибина страуса. Другим предпочтительным геном ингибина является ген ингибина эму. Еще одним предпочтительным геном ингибина является ген ингибина нанду. Еще одним предпочтительным геном ингибина является ген ингибина курицы.

Клон комплементарной ДНК -субъединицы ингибина цыпленка (cINC6; Wang and Johnson, “Complementary deoxyribonucleic acid cloning and sequence analysis of the -subunit from chicken ovarian granulosa cells”, Biology of Reproduction, 49: 453-458, 1993), введенный в положение EcoR 1 Bluescript (“Stratagene” Ла-Джойла, штат Калифорния) любезно предоставлен P.A. Johnson (Корнельский университет). Клон cINA6, специально гибридизованный для геномной ДНК страуса, показывает в анализе по методу сазерн-блоттинга значительную гомологичность ДНК между указанными двумя образцами (Chouljenko et al. , “Expression and purification of chicken -inhibin as a fusion protein with E. coli maltose Binding protein”, Poultry Science, 73 (Suppl. 1): 84, 1994). Фрагмент ДНК (“cINA515”) вырезают из клона cINA6, используя ферментацию с помощью Pst 1. Фрагмент cINA515 сопровождает большинство -субъединиц ингибина зрелых домашних кур.

Последовательность – субъединицы ингибина страуса получают по методу полимеразной реакции синтеза цепи, хорошо известного из области техники. В частности, конструируют следующие праймеры на основе последовательности, приведенной в статье Wang, и используют в полимеразной реакции синтеза цепи с геномной ДНК страуса: 5′-TCTTTCGAGGAGCTGGGCTGG-3′ и 3′- GGGCCGTGGTACGCGAGTGACGCA-5′. Приблизительно 75% ДНК последовательности cINA515 сравнивают с геномной ДНК страуса. Таким образом, проведенное сравнение между ДНК курицы и страуса показывает 100%-ную гомологичность.

Как указано выше, следует понимать, что белок-носитель не является критичным аспектом настоящего изобретения. По этой причине в настоящем изобретении может использоваться любой ген, кодирующий экспрессию белка- носителя. Ген белка-носителя может быть выбран, однако ими не ограничивается, из гена, кодирующего экспрессию следующих белков: белок, связывающий мальтозу; бычий сывороточный альбумин; гемоцианин лимфы улитки; овальбумин; фрагеллин; сывороточный альбумин любых видов животных; гамма-глобулин любых видов животных; изогенные клетки; изогенные клетки, содержащие Ia антигены; и полимеры D- и/или L-аминокислот. Предпочтительным геном белка-носителя является ген, кодирующий экспрессию белка, связывающего мальтозу. Другим предпочтительным геном белка- носителя, если полученный в итоге ксеногенный белок не будет назначаться корове или лошади, является ген бычьего сывороточного альбумина. Наконец, еще одним предпочтительным геном белка- носителя, если полученный в итоге ксеногенный белок не будет назначаться птице, является ген овальбумина. Наиболее предпочтительным геном белка-носителя является ген, кодирующий экспрессию белка, связывающего мальтозу. Предпочтительный ген белка-носителя кодирует белки, которые увеличивают как интенсивность, так и продолжительность ответной иммунной реакции хозяина на действие белка ингибина.

Настоящее изобретение относится также к способу получения слитого генного продукта, включающему слияние гена, кодирующего экспрессию белка ингибина или его фрагмента, с геном, кодирующим экспрессию белка-носителя. Если коротко, то способ получения гена слияния по настоящему изобретению включает стадии выделения требуемой комплементарной ДНК ингибина, получения двухцепочечной ДНК ингибина, слияние двухцепочечной ДНК ингибина с двухцепочечной ДНК белка-носителя таким образом, чтобы слитая ДНК позволяла провести экспрессию слитого ксеногенного белка, содержащего ингибин или его фрагмент и белок-носитель.

Из области техники известно много способов выделения генов и получения продуктов гена слияния. См. , например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol. I, II, III. Таким образом, может быть использован любой известный из области техники способ получения слитого генного продукта по настоящему изобретению. Для получения слитого генного продукта по настоящему изобретению могут быть использованы многие имеющиеся на рынке наборы векторов. Примером такого имеющегося на рынке набора векторов является pMAL-c компании “New England Biolabs” (Беверли, штат Массачусетс). Способ получения слитого генного продукта из набора pMAL-c подробно описан далее в Примере 1. Другие источники наборов векторов, которые могут использоваться для получения слитого генного продукта по настоящему изобретению включают, однако ими не ограничиваются: “Pharmacia Biotech” (Пискатауэй, штам Нью-Джерси) и “Clontech) (Пало-Альто, штат Калифорния).

Как указано ранее, клон комплементарной ДНК – субъединицы ингибина курицы (cINA6), введенный в положение EcoR1 Biuescript, предоставлен P.A. Johnson, (Корнельский университет). Фрагмент ДНК (“cINA515”) вырезают из клона cINA6 ферментацией с использованием Pst 1. Этот фрагмент (cINA515) клонируют в плазмиде p-MAliTM-с в рамке с белком, связывающим мальтозу (“МБР”), и белок слияния нужного размера (дорожка Е. фиг. 1) определяется после индукции изопропил –-D-тиогалактопиранозидом и электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Полученный белковый конъюгат (“MBP- cINA515”) используют в качестве антигена для иммунизации препубертантной самки японского перепела (Coturnix coturnix japonica) против циркулирующего ингибина, как это подробно описано в Примере 8.

Неожиданно было обнаружено, что композиция по настоящему изобретению ускоряет начало кладки яиц у птиц. Настоящее изобретение относится также к способу ускорения начала кладки яиц или полового созревания самок птиц путем назначения эффективного количества ксеногенного белка по настоящему изобретению (содержащего ингибин или его фрагмент и белок- носитель) так что начало кладки яиц у птиц ускоряется. Термин “ускоряется” означает, что день первой кладки яиц у подвергнутой обработке птицы наступает, по крайней мере, на 3% ранее, чем эта откладка наступила бы в обычных условиях у не подвергнутой обработке птицы. Предпочтительно день откладки яиц наступает, по крайней мере, приблизительно на 5% ранее, более предпочтительно наступает, по крайней мере, приблизительно на 7% ранее. Еще более предпочтительно начало кладки яиц наступает, по крайней мере, на 10% ранее и более предпочтительно наступает, по крайней мере, приблизительно на 13% ранее, чем эта откладка натупила бы в обычных условиях у не подвергнутой обработке птицы. Следует понимать, что “подвергнутая обработке” птица означает птицу, которой назначают ксеногенный белок по настоящему изобретению. Предпочтительно иммунологическая ответная реакция возникает у птицы против ингибина. Более предпочтительно иммунологическая ответная реакция направлена против эндогенного ингибина, продуцируемого птицей.

Способ по настоящему изобретению может использоваться для ускорения начала кладки яиц самками птиц любых видов, которые продуцируют ингибин. Самок птиц можно выбрать, однако этим не ограничиваясь, из бескилевых, Psittaciformes, Falconiformes, Piciformes, Strigiformes, Passeriformes, Coraciformes, Ralliformes, Cuculiformes, Columbiformes, Galliformes (домашней птицы), Anseriformes (гусей, уток и других водоплавающих домашних птиц) и Herodiones. Более конкретно самку птицы можно выбрать, однако этим не ограничиваясь, из страуса, эму, нанду, киви, казуара, индюшки, перепелки, курицы, сокола, орла, ястреба, голубя, длиннохвостого попугая, какаду, попугая и птиц, сидящих на насесте (таких как певчие птицы, сойка, черный дрозд, зяблик, славка и воробей) и любого представителя отряда Psittaciformes. Предпочтительной птицей является бескилевая птица. Более предпочтительной птицей является страус. Еще одной предпочтительной бескилевой птицей является эму. Еще одной предпочтительной бескилевой птицей является нанду. Еще одной предпочтительной птицей является любой член отряда Psittaciformes. Еще одной предпочтительной птицей является курица. Еще одной предпочтительной птицей является перепел. Способ по настоящему изобретению может также использоваться для ускорения начала кладки яиц у видов птиц, подверженных опасности. Указанные подверженные опасности птицы включают, однако ими не ограничиваются, орлов, ястребов, кондоров и сов.

Ингибин и белок носитель в композиции ксеногенного белка по настоящему изобретению изменяются в зависимости от того, для каких видов птиц она предназначена. В композициях, назначаемых птицам, предпочтительно используют ингибин птиц и белок, связывающий мальтозу. Если композиция назначается бескилевым, то предпочтительным ингибином является ингибин курицы или ингибин бескилевой птицы. Более предпочтительным ингибином, если композиция назначается страусу, является ингибин домашней курицы или ингибин страуса.

Следует понимать, что ингибин в ксеногенном белке необязательно должен быть получен от того же вида животных, которому ксеногенный белок будет назначаться. Например, ксеногенный белок, который назначают страусу, может содержать ингибин курицы и белок-носитель. Следует также понимать, что композиция может далее включать вспомогательные соединения, консерванты, разбавители, эмульгаторы, стабилизаторы и другие известные компоненты, которые используются в данной области техники для приготовления вакцин. В композиции по настоящему изобретению может использоваться любая вспомогательная система, известная из области техники. Предпочтительной вспомогательной системой является неполный адъювант Фрейнда. Еще одной предпочтительной вспомогательной системой является полный адъювант Фрейнда. Наконец, еще одной предпочтительной вспомогательной системой является полидиспергированный ацетилированный – (1,4) – связанный маннан (“Acemannan”).

Композиция ксеногенного белка по настоящему изобретению может назначаться самке птицы любыми известными из области техники способами. Например, композиция может назначаться подкожно, внутрибрюшинно или внутримышечно. Предпочтительно композиция вводится в виде инъекции подкожно. Композиция может назначаться птице в виде одной или нескольких доз. Предпочтительно композиция назначается птице в виде нескольких доз, при этом за первичной иммунизацией следует повторная иммунизация.

Композицию по настоящему изобретению следует назначать самке птицы до того, как у птицы наступает способность откладывать яйца или половая зрелость. Предпочтительный возраст, когда композиция по настоящему изобретению впервые назначается животному, зависит от вида животного, периода спаривания животного (если он есть), размера птицы, идентичности компонентов (ингибина и белка-носителя) и композиции.

Количество назначаемого самке птицы ксеногенного белка по настоящему изобретению меняется в зависимости от вида птицы, ее возраста и веса птицы, от того, назначается ли белок в период размножения (если у птицы есть период размножения) и сколько раз белок будет назначаться. Кроме того, начало осуществления расписания назначений или расписания обработки изменяется в зависимости от вида птицы, среднего возраста, при наступлении которого начинается откладка яиц у данного вида, предыстории семейства птиц (касается предыстории начала откладки яиц в данном семействе), времени года, когда птица была выведена, уровня кормления птицы (птицы, которых хорошо кормят, достигают половой зрелости раньше тех, которых не докармливают), общего состояния здоровья птицы на момент начала проведения вакцинации, долговременной истории здоровья птицы, наличия экстремальных природных условий (продолжительных неблагоприятных погодных условий, таких как дождь, жара или ветреная погода, к которым птицы не привыкли), условий содержания (перенаселенности) и отсутствия возможности двигаться.

Специалист в данной области техники в соответствии с описанием настоящего изобретения сможет определить с помощью обычных тестов количество ксеногенного белка, которое будет необходимо для того, чтобы вызвать у птицы ответную иммунологическую реакцию к белку.

Например, далее кратко описывается способ по настоящему изобретению для ускорения наступления половой зрелости у японского перепела, который более подробно приведен в Примере 8. Средний возраст полового созревания для неподвергнутых обработке перепелов составляет приблизительно от шести до восьми недель. Далее приводится расписание проведения обработок японского перепела со средним весом в интервале от 0,1 до 0,25 фунтов (от 45 г до 113 г): первичная (первая) инъекция 0,75 мг ксеногенного белка по настоящему изобретению на 25 день от дня рождения птицы и ревакцинации в количестве 0,375 мг на 32-й, 39-й, 46-й, 53-й, 60-й и 90-й день от рождения птицы.

В частности, при достижении ими возраста 25 дней, 100 перепелов произвольно и равномерно делят на следующие четыре группы для проведения инъекций (по 25 птиц в каждой группе):
(1) MBP-сINA515 в полидиспергированном ацетилированном -(1,4)-связанном маннане (“Acemannan”), иммуностимулирующем носителе (“MBP-cINA515/ACE”),
(2) MBP- cINA515 в адъюванте Фрейнда (“MBP-cINA515/FRN”),
(3) Acemannan (контроль иммуностимулятора; “ACE”) или
(4) адъювант Фрейнда (контроль адъюванта; “FRN”). Каждой птице, которой проводят иммунизацию против ингибина (Группы 1 и 2), назначают приблизительно по 0,75 мг MBP-cINA515 в соответствующем контрольном носителе. Эквивалентные объемы (0,2 мл) инъекций носителя ACE или FRS применяют, соответственно, в Группах 1 и 3 и Группах 2 и 4. Все инъекции осуществляют подкожно с помощью шприца для введения туберкулина, снабженного иглами номер 25. В течение последующих пяти недель каждой птице подкожно проводят повторные вакцинации по 0,375 мг MBP-cINA515 или соответствующей контрольной провокационной пробы.

При достижении птицами возраста 41 день (обозначают как День 1 цикла откладки яиц) в течение 12 последующих недель проводят регистрацию ежедневной откладки яиц курами (“HDEP”) и смертности (“MORT”). Далее, для каждой из четырех групп определяют средний возраст, когда наступает первая кладка яиц (“FIRST”) и возраст, когда 50% птиц начинают откладывать яйца (“FIFTY “). Данные HDEP, как это подробнее будет описано в Примере 8, анализируют двумя разными способами.

В настоящее время предварительно получены сведения лишь о 35 днях. Общий процент скорости ежедневной откладки яиц курами для еженедельных интервалов откладки яиц (день 0, 7, 14, 21 и 35) в течение первых 35 дней изучения приведен на фиг. 2 (четыре группы с разными инъекциями рассматриваются как подвергаемые различным типам обработки) и фиг. 3 (проводится сравнение неиммунизованных (контрольных) и ингибин-иммунизованных групп).

Средний уровень ежедневной откладки яиц курами в течение Недели 1, Недели 2, Недели 3, Недели 4. Недели или объединенные данные для недель с первой по пятую для четырех групп, которым проводили инъекции и которых рассматривают независимо друг от друга, приведены в Таблице 2. В частности, значения в Таблице 3 представлены в виде процента уровни откладки яиц. Например, в течение Недели 1 при проведении исследования лишь 5,8% птиц в группе ACE откладывали яйцо за день. В течение Недели 2 при проведении исследования 39,56% птиц в группе ACE откладывали яйцо за день. (39,56% Недели 2 включает и 5,8% Недели 1).

В Таблице 2 также показано, что в течение Недели 4 группа, получавшая инъекции MBP-cINA515/FRN, достигла пика уровня кладки яиц, составившего 96,57%. Более того, в соответствии с данными Таблицы 2, другие три группы, которым вводили инъекции, не достигли пика в течение Недели 4, поскольку их процент кладки яиц продолжал расти в период между Неделей 4 и Неделей 5. Колонка под Неделями 1-5 показывает средний процент откладки яиц каждой из групп, которым проводили инъекции, за период от Недели 1 до Недели 5.

В Таблице 3 приведены средние уровни ежедневной откладки яиц курами в процентах в течение того же времени, что и в Таблице 2, при этом данные обобщены для сравнения контрольных групп и иммунизованных групп. В колонке под данными для Недель 1-5 приведен средний процент уровня откладки яиц для объединенных контрольных групп по отношению к объединенным иммунизованным группам за период от Недели 1 до Недели 5.

Таблица 4 содержит данные для первого для откладки яиц для обоих рассматриваемых статистических схем обработки результатов (т.е. сравнение для четырех групп, которым проводили инъекции, и сравнение объединенных данных). Возраст первой кладки яиц в Таблице 4 является среднестатистическим первой кладки яиц для птиц в каждой группе. Следует отметить, что данные Таблицы 5 свидетельствуют о более чем пятидневном ускорении начала кладки яиц между птицами группы FRN и птицами группы MBP-cINA515/FRN. Таблица 5 показывает также более чем трехдневное ускорение начала кладки яиц между птицами контрольной группы и птицами иммунизованной группы. (См. Таблицы 2, 3 и 4 в Примере 8).

Наблюдается первичный положительный эффект иммунизации ингибином на продуцирующую способность. Этот эффект особенно заметен для наборов обобщенных данных для ежедневной откладки яиц курами (HDEP) (Таблица 3) и данных для наступления первой кладки (FIRST) (Таблица 4), где увеличение количества наблюдений приводит к повышению значимости примененных статистических методов.

Большинство отнесенных ко времени биологических ответных реакций на проведение обработок изучались относительно начала, величины и продолжительности ответной реакции. Данные, приведенные в настоящем описании, являются предварительными (т.е. информация обо всем цикле откладки яиц (приблизительно 12 недель от начала откладки яиц) еще не получена. По указанной причине еще предстоит выявить скрытые механизмы того, как изменяется продуктивная способность перепелов, иммунизованных против ингибина. Однако приведенные в настоящем описании данные действительно свидетельствуют о влиянии иммунонейтрализации ингибина на первую часть цикла откладки яиц (т.е. на наступление половой зрелости).

Приведенные данные показывают, что наступление половой зрелости у групп, подвергнутых обработке ингибином, ускоряется. Об этом свидетельствуют как данные HDEP, так и данные FIRST. Величина статистической значимости, связанная с большим средним значением уровня HDEP, установленного для обработанных ингибином перепелов в течение Недели 1 проведенного исследования, велика (P<0,0095); эта разница не столь очевидна (P<0,0888) в течение Недели 2 (Таблица 3). Эта пограничная разница между подвергнутыми обработки группами, наблюдаемая в течение Недели 2, может означать, что кладка яиц, хотя и отсроченная, начинает интенсифицироваться у перепелов контрольной группы (см. фиг. 2). Следовательно можно ожидать, что величина статистических различий, обнаруженных между двумя испытуемыми группами (группы с ингибином по отношению к группе без ингибина) в течение Недели 1, будет несколько размываться с наступлением дня кладки яиц. В самом деле, когда данные, полученные в течение Недель 1-5, объединяют, то для кур, подвергнутых обработке ингибином, наблюдаются значительно более высокие уровни HDEP при средней величине статистической значимости (P<0,0763).

Японский перепел выбран вследствие высокой интенсивности откладки яиц, а потенциальная яйценоскость y Coturnix оценивается выше, чем у кур (породы одногребешковые белых леггорнов), которые коммерчески выращивают с единственной целью получения столовых яиц. Во-вторых, средний возраст, при котором иммунизованные перепела (возраст 51,98 дней) отложили свои первые яйца (FIRST) ускорился (P<0,0373) на 3+ дня по сравнению с неиммунизованными перепелами (возраст 55,33 дня) (Таблица 4). Это воздействие иммунизации ингибином на ускорение яйценоскости особенно заметно для перепелов, которым вводили MBP- cINA515/FRN и у которых среднее значение FIRST составляет 50,38 дней с момента рождения (Таблица 4). Полученные результаты свидетельствуют также о том, что более высокие титры антитела по отношению к провокационной пробе ксеногенного белка (и, следовательно, большая ингибиновая иммунизации) достигаются в том случае, когда в качестве носителя для MBP-cINA515 используют не Acemannan, а адъювант Фрейнда.

Дополнительные свидетельства подтверждают вывод о том, что иммунонейтрализация ингибина ускоряет половое созревание у перепела. Так, все (100%) кур, которым назначали ингибин уже (т.е. на 76 день от рождения или на День 35 от начала эксперимента) начали откладывать яйца, в то время как две курицы из контрольных групп еще не начали откладывать яйца. Это заставляет высказать предположение, что если две оставшиеся курицы никогда не начнут откладывать яйца, то иммунонейтрализация ингибина могла индуцировать кладку яиц у кур, которые в противном случае никогда бы яиц не откладывали. Более того, если те же две птицы никогда не отложат яиц или если оставшиеся две курицы начнут откладывать яйца несколько ранее окончания исследований (к достижению возраста 124 дня), то разница 3+ в данных для дня первой откладки яиц (FIRST), приведенная в настоящем описании, неизбежно возрастет.

Далее, хотя статистическая обработка данных FIFTY пока еще не приводит к противоречивым результатам (поскольку лишь приблизительно 23% кур достигли значения 50% НДЕР), большинство этих птиц, характеризующихся более поздней кладкой яиц (приблизительно 57%), являются членами контрольных (не подвергавшихся иммунизации) групп. Это наблюдение является дополнительным подтверждением того, что данные HDEP и FIRST, свидетельствующие о наступлении половой зрелости, ускорились у самок перепела, которым проведена иммунонейтрализация ингибина.

Таким образом, приведенные выше данные свидетельствуют о том, что содержащая ингибин композиция по настоящему изобретению ускоряет наступление половой зрелости у японского перепела. Поскольку японский перепел является удовлетворительной животной моделью для домашних кур применительно к их репродуктивным системам, то приведенные выше данные свидетельствуют о том, что способ по настоящему изобретению ускоряет также начало кладки яиц у домашних кур. Таким образом, способ по настоящему изобретению позволяет поставщикам яиц производить больше яиц при меньших затратах на корм.

Далее приводится краткое описание способа по настоящему изобретению для ускорения полового созревания у страусов, который обсуждается в Примере 9. Средний возраст достижения половой зрелости у неподвергнутых обработке страусов составляет приблизительно от 28 до 32 месяцев. Далее приводится расписание обработок для страусов с весом приблизительно в интервале от 150 до 300 фунтов (от 68 до 136 кг): первичная (первая) инъекция 5,0 мг ксеногенного белка по настоящему изобретению на 26 месяц от рождения; и повторные иммунизации в количестве 2,5 мг на 27-й, 28-й, 30-й, 32-й, 34-й и 36-й месяц от рождения.

Далее приводится краткое описание способа по настоящему изобретению для ускорения полового созревания эму, который обсуждается в Примере 10. Средний возраст достижения половой зрелости у неподвергнутых обработке эму составляет приблизительно 20 месяцев. Далее приводится расписание обработок для эму с весом приблизительно в интервале от 50 до 90 фунтов (от 23 до 41 кг): первичная (первая) инъекция 3,0 мг ксеногенного белка по настоящему изобретению на 18 месяц от рождения; и повторные иммунизации в количестве 1,5 мг на 19-й, 20- й, 22-й, 24-й, 26-й и 30-й месяц от рождения.

Далее приводится краткое описание способа по настоящему изобретению для ускорения полового созревания у домашних кур, который обсуждается в Примере 11. Средний возраст достижения половой зрелости у неподвергнутых обработке кур составляет приблизительно 20 недель. Далее приводится расписание обработок для кур с весом приблизительно в интервале от 2,0 до 3,5 фунтов (от 0,9 до 1,6 кг): первичная (первая инъекция 1,5 мг ксеногенного белка по настоящему изобретению на 15 неделю от рождения; и повторные иммунизации в количестве 0,75 мг на 17-ю, 20-ю, 24-ю, 30-ю, 40-ю и 50-ю неделю от рождения.

Далее приводится краткое описание способа по настоящему изобретению для ускорения полового созревания у индюшек, который обсуждается в Примере 12. Средний возраст достижения половой зрелости у неподвергнутых обработке индюшек составляет приблизительно 30 недель. Далее приводится расписание обработок для индюшек с весом приблизительно в интервале от 9,0 до 12 фунтов (от 4,1 до 5,4 кг): первичная (первая инъекция 2,0 мг ксеногенного белка по настоящему изобретению на 28 неделю от рождения; и повторные иммунизации в количестве 1,0 мг на 29-ю, 30-ю, 34-ю, 38-ю, 46-ю и 54-ю неделю от рождения.

Далее приводится краткое описание способа по настоящему изобретению для ускорения полового созревания у попугаев, который обсуждается в Примере 13. Средний возраст достижения половой зрелости у неподвергнутых обработке попугаев составляет приблизительно 20 месяцев. Далее приводится расписание обработок для попугаев с весом приблизительно в интервале от 0,5 до 1,25 фунтов (от 225 до 570 г): первичная (первая) инъекция 0,375 мг ксеногенного белка по настоящему изобретению на 28 месяц от рождения; и повторные иммунизации в количестве 0,375 мг на 29-й, 30-й, 32-й, 34-й, 36-й и 38-й месяц от рождения.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу увеличения яйценоскости у животных путем назначения эффективного количества ксеногенного белка по настоящему изобретению (содержащего ингибин или его фрагмент и белок-носитель), так что продуцирование яиц птицей увеличивается. Термин “увеличивается” означает, что продуцирование яиц подвергнутыми обработке птицами возрастает, по крайней мере, приблизительно на 3% по сравнению с количеством яиц, откладываемых не подвергнутыми обработке птицами. Продуцирование яиц предпочтительно возрастает, по крайней мере, приблизительно на 7%, а более предпочтительно возрастает по крайней мере приблизительно на 12%. Следует понимать, что “подвергнутой обработке” является птица, которой назначают ксеногенный белок по настоящему изобретению. У животного предпочтительно возникает ответная иммунологическая реакция против ингибина. Иммунологическая ответная реакция преимущественно направлена также против эндогенного ингибина, продуцируемого животным.

Способ по настоящему изобретению может использоваться для увеличения производства яйцеклеток самками любых видов животных, которые продуцируют ингибин. Животное может быть, среди прочих, птицей, млекопитающим, пресмыкающимся, земноводным или рыбой. Более конкретно млекопитающее может быть выбрано из группы, включающей, однако ими не ограничивается, корову, человека, лошадь, кошку, собаку, овцу, норку, лисицу, выдру, хорька, енота и свинью. Предпочтительным животным является птица. Самку птицы можно выбрать, однако этим не ограничиваясь, из бескилевых, Psittaciformes, Falconiformes, Piciformes, Strigiformes, Passeriformes, Coraciformes, Ralliformes, Cuculiformes, Columbiformes, Galliformes (домашней птицы), Anseriformes (гусей, уток и других водоплавающих домашних птиц) и Herodiones. Более конкретно самку птицы можно выбрать, однако этим не ограничиваясь, из страуса, эму, нанду, киви, казуара, индюшки, перепелки, курицы, сокола, орла, ястреба, голубя, длиннохвостого попугая, какаду, попугая и птиц, сидящих на насесте (таких как певчие птицы, сойка, черный дрозд, зяблик, славка и воробей) и любого представителя отряда Psittaciformes. Предпочтительной птицей является бескилевая птица. Более предпочтительной птицей является страус. Еще одной предпочтительной бескилевой птицей является эму. Еще одной предпочтительной бескилевой птицей является нанду. Еще одной предпочтительной птицей является любой член отряда Psittaciformes. Еще одной предпочтительной птицей является домашняя курица. Еще одной предпочтительной птицей является перепел. Способ по настоящему изобретению может также использоваться для увеличения кладки яиц у видов птиц, подверженных опасности. Указанные подверженные опасности птицы включают, однако ими не ограничиваются, орлов, яcтребов, кондоров и сов.

Ингибин и белок-носитель в композиции ксеногенного белка по настоящему изобретению изменяются в зависимости от того, для каких видов животных она предназначена. Ксеногенный белок по настоящему изобретению подробно рассмотрен ранее. В композициях, назначаемых птицам, предпочтительно используют ингибин птиц и белок, связывающий мальтозу. Если композиция назначается бескилевым, то предпочтительным ингибином является ингибин домашней курицы или ингибин бескилевой птицы. Более предпочтительным ингибином, если композиция назначается страусу, является ингибин домашней курицы или ингибин страуса. Следует понимать, что ингибин в ксеногенном белке необязательно должен быть получен от того же вида животных, которому ксеногенный белок будет назначаться. Например, ксеногенный белок, который назначают страусу, может содержать ингибин домашней курицы и белок-носитель. Следует также понимать, что композиция может далее включать вспомогательные соединения, консерванты, разбавители, эмульгаторы, стабилизаторы и другие известные компоненты, которые используются в данной области техники для приготовления вакцин. В композиции по настоящему изобретению может использоваться любая вспомогательная система, известная из области техники. Предпочтительной вспомогательной системой является неполный адъювант Фрейнда. Еще одной предпочтительной вспомогательной системой является полный адъювант Фрейнда.

Композиция ксеногенного белка по настоящему изобретению может назначаться животному любыми известными из области техники способами. Например, композиция может назначаться подкожно, внутрибрюшинно или внутримышечно. Предпочтительно композиция вводится в виде инъекции подкожно. Композиция может назначаться животному в виде одной или нескольких доз. Предпочтительно композиция назначается животному в виде нескольких доз, при этом за первичной иммунизацией следуют повторные иммунизации.

Композиция может назначаться самке животного в любой период времени до того, как у нее приостановится овуляция вследствие болезни или возраста. Предпочтительный возраст, при котором следует назначать животному композицию по настоящему изобретению, зависит от вида животного, периода спаривания животного (если он есть) и от цели назначения композиции.

Например, если композицию назначают с целью увеличения производства яйцеклеток у выращиваемых в сельском хозяйстве животных, у которых есть периоды размножения, то предпочтительное время назначения композиции предшествует периоду размножения. Напротив, в том случае, если композиция назначается зрелому животному с низким уровнем воспроизводства яйцеклеток, то композицию назначают в то время, когда этот низкий уровень станет вызывать проблемы.

Например, хотя ксеногенный белок может назначаться птице, такой как бескилевая птица, в любом возрасте, предпочтительной является иммунизация птицы в течение шестимесячного периода, предшествующего первому периоду размножения птицы. Специалистам в области техники известно, что в среднем самки птиц начинают откладывать яйца в течение первого периода размножения. Поэтому более предпочтительной является иммунизация птицы приблизительно за шесть месяцев до наступления первого периода размножения птицы, а затем проводят повторные иммунизации с интервалами в один месяц до наступления первого периода размножения птицы. Еще более предпочтительной является иммунизация птицы приблизительно за шесть месяцев до наступления первого периода размножения птицы, а затем проводят повторные иммунизации с интервалами в один месяц в течение шести месяцев. Количество назначаемого животному ксеногенного белка по настоящему изобретению меняется в зависимости от вида животного, его возраста и веса животного, от того, назначается ли белок в период размножения (если у животного есть период размножения) и сколько раз белок будет назначаться. Специалист в данной области техники, пользуясь настоящим описанием, легко определит с помощью обычных тестов количество ксеногенного белка, которое необходимо для подавления иммунологической ответной реакции у животного по отношению к белку.

Например, для получения лучших результатов по увеличению воспроизводства яиц у самки страуса, первичную иммунизацию страусу проводят приблизительно за 6 месяцев перед первым периодом размножения, а затем в течение шести месяцев с интервалами в один месяц проводят повторные иммунизации. Первичная иммунизация включает назначение приблизительно от 0,5 до 4,5 мг ксеногенного белка по настоящему изобретению. Повторные иммунизации включают назначение приблизительно от 0,30 до 3,0 мг ксеногенного белка по настоящему изобретению. Первичная иммунизация преимущественно включает назначение приблизительно от 1,5 до 3,0 мг ксеногенного белка по настоящему изобретению. Повторные иммунизации включают назначение приблизительно от 0,75 до 1,5 мг ксеногенного белка по настоящему изобретению. Ксеногенный белок предпочтительно эмульгируют в полном адъюванте Фрейнда (“Sigma Chemical Co.” Сент-Луис, штат Миссури) для первичной иммунизации, а для повторной иммунизации ксеногенный белок предпочтительно эмульгируют в неполном адъюванте Фрейнда (“Sigma”). Еще более предпочтительно композицию ксеногенного белка вводят в виде инъекции подкожно. Еще более предпочтительно композицию ксеногенного белка вводят в виде инъекции подкожно в три места в верхней части бедра страуса.

Способ увеличения яйценоскости птиц по настоящему изобретению обеспечивает значительное увеличение продуцирования яиц у видов, которые не подвергались генетической селекции с точки зрения плодовитости кладки яиц. Например, домашних кур генетически отбирают с точки зрения максимальной яйценоскости с конца 1920-х годов. См., например, M.A. Jull, 1932, “Poultry Breeding”, John Wiley & Sons. Вследствие короткого времени жизни домашних кур, приблизительно с 1928 года до настоящего времени проводится большая работа по селекции птиц с точки зрения их яйценоскости. Напротив, бескилевые и Psittaciformes и большинство экзотических птиц не отбирались генетически с точки зрения плодовитости кладки яиц. Аналогично с точки зрения плодовитости кладки яиц генетически не отбирались птицы, подверженные опасности. Таким образом, поскольку домашние куры уже генетически обладают превосходной яйценоскостью, то улучшение, которое может наблюдаться при использовании способа по настоящему изобретению, является ограниченным в сравнении с птицами, которые генетически обладают плохой или средней яйценоскостью. По этой причине значительно большее улучшение уровня яйценоскости при использовании способа по настоящему изобретению наблюдается для птиц, которых генетически не отбирали с точки зрения их плодовитости кладки яиц, таких как бескилевые, Psittaciformes, другие экзотические птицы и птицы, подверженные опасности.

Другой пример способа увеличения производства яйцеклеток заключается в следующем. Эффективное количество композиции конъюгированного ксеногенного белка назначают млекопитающему таким образом, что у млекопитающего возникает ответная иммунологическая реакция, направленная против ксеногенного белка. Ксеногенный белок преимущественно состоит из ингибина млекопитающего, конъюгированного с белком, связывающим мальтозу. Другой предпочтительный ксеногенный белок состоит из ингибина птиц или пресмыкающихся и белка, связывающего мальтозу.

Иммунизация животного ксеногенным белком по настоящему изобретению заставляет животное продуцировать антитела, селективно направленные против ксеногенного белка. Иммунизация предпочтительно также заставляет животное продуцировать антитела, селективно направленные против эндогенного ингибина. Продуцирование таких антител птицей ведет к ускорению полового созревания или начала производства яйцеклеток. Продуцирование указанных антител животным усиливает также способность животного производить яйцеклетки, поскольку антитела нейтрализуют биологическую активность ингибина, находящегося в крови животного.

Не связывая себя приведенным далее предположением, мы полагаем, что – субъединица ингибина связывает рецепторы фолликулостимулирующего гормона и, таким образом, полностью подавляет связывание фолликулостимулирующего гормона с сайтами указанного рецептора. Поэтому уменьшение содержания ингибина, который может связываться с сайтами рецептора, усиливает у животного биологическое воздействие фолликулостимулирующего гормона, поскольку конкуренция за сайты рецептора фолликулостимулирующего гормона уменьшается. Мы полагаем, что антитела нейтрализуют ингибин за счет взаимодействия с циркулирующим в организме ингибином, создавая, таким образом, стерические препятствия вступившему с ними во взаимодействие ингибину связываться с сайтами рецептора фолликулостимулирующего гормона.

Неожиданно оказалось, что композиция по настоящему изобретению может использоваться также для увеличения общей продолжительности яйценоскости птиц в течение их жизни. Термин “увеличивается” означает, что общий период яйценоскости подвергнутой обработке птицы возрастает, по крайней мере, на 3% по сравнению с общим периодом яйценоскости у не подвергнутой обработке птицы. Предпочтительно общий период яйценоскости увеличивается, по крайней мере, приблизительно на 7%, более предпочтительно увеличивается, по крайней мере, приблизительно на 12%. Еще более предпочтительно общий период яйценоскости увеличивается, по крайней мере, на 15%. Следует понимать, что “подвергнутая обработке” птица означает птицу, которой назначают ксеногенный белок по настоящему изобретению. Если коротко, то общий период яйценоскости птицы возрастает, если ей назначают эффективное количество ксеногенного белка по настоящему изобретению, с целью вызвать иммунологическую ответную реакцию по отношению к ксеногенному белку, а затем, если
птице назначают эффективное количество ксеногенного белка (проводят реиммунизацию), чтобы поддержать максимальную или выше, чем обычную, яйценоскость. В частности, если ксеногенный белок по настоящему изобретению в течение длительного времени назначается самке птицы в дозировках, приведенных в ранее описанных способах ускорения начала кладки яиц или наступления половой зрелости, то общий период яйценоскости птицы возрастает по сравнению с птицей, которая не подвергалась обработке композицией по настоящему изобретению.

В общем случае способ по настоящему изобретению приводит к заметному увеличению общего периода яйценоскости у видов птиц, которые не подвергались генетической селекции с точки зрения их плодовитости при кладке яиц. Общий период яйценоскости птицы ограничен количеством женских половых клеток, которые формируются у птицы. Однако некоторые виды птиц подвергались генетической селекции на предмет максимальной овуляции или кладки яиц. Как указано ранее, например, домашние куры с конца 1920-х годов подвергаются генетической селекции с точки зрения максимальной яйценоскости. Вследствие короткого времени жизни домашних кур, приблизительно с 1928 года до настоящего времени проводится большая работа по селекции птиц с точки зрения их яйценоскости. Напротив, бескилевые и Psittaciformes и большинство экзотических птиц не отбирались генетически с точки зрения плодовитости кладки яиц. Аналогично с точки зрения плодовитости кладки яиц генетически не отбирались птицы, подверженные опасности. Таким образом, поскольку домашние куры уже генетически обладают превосходной яйценоскостью, то улучшение, которое может наблюдаться при использовании способа по настоящему изобретению, является ограниченным в сравнении с птицами, которые генетически обладают плохой или средней яйценоскостью. По этой причине значительно большее увеличение общего периода яйценоскости при использовании способа по настоящему изобретению наблюдается для птиц, которых генетически не отбирали с точки зрения их плодовитости при кладке яиц, таких как бескилевые, Psittaciformes, другие экзотические птицы и птицы, подверженные опасности. Таким образом, увеличение общего периода яйценоскости приводит к получению большего количества яиц от того же самого количества птиц, что позволяет заводчикам кур получить дополнительную прибыль.

Неожиданно было обнаружено, что композиция по настоящему изобретению может использоваться также для того, чтобы уменьшить или устранить потребность в линьке птиц. В частности, если описанная выше композиция в течение длительного времени назначается самке птицы, как это описано в приведенном выше способе, то уровень яйценоскости птицы, по сравнению с птицей, которой не назначают композицию по настоящему изобретению, остается достаточно высоким, так что не возникает потребность в линьке птицы для увеличения ее яйценоскости. Практика линьки самок птиц, таких как домашние куры (одногребешковые белые леггорны, которые являются производителями столовых яиц), является обычной, когда яйценоскость снижается, так что затраты на содержание птицы превосходят экономические выгоды от получаемых яиц. С целью “линьки” домашних кур, птицам не дают пищу в течение приблизительно от четырех до четырнадцати дней до тех пор, пока она не начнет линять, т.е. терять свои перья. В течение периода линьки птица прекращает откладывать яйца. После того, как птицам вновь продолжают давать нормальное количество пищи кладка яиц через некоторое время возобновляется. Весь период линьки занимает приблизительно два месяца, начиная со времени прекращения кормления и до начала нового цикла яйцекладки. В итоге уровень яйценоскости птицы омолаживается. Однако после проведения линьки птицы уровень ее яйценоскости в следующем цикле не достигнет уровня ее яйценоскости в первый период (до линьки). M. North and D. Bell, “Commercial Chicken Production Manual”, 4 th Ed., Chapter 19, Published by Van Norstrand Reinhold of New York.

Например, домашние куры начинают откладывать яйца приблизительно через 20 недель и достигают экономически значимой яйценоскости приблизительно через 40-50 недель. При достижении пикового значения яйценоскости, домашние куры откладывают от восьми до девяти яиц каждые десять дней. Однако приблизительно через 50 недель кладки яиц уровень яйценоскости уменьшается приблизительно до величины, составляющей 60% от пикового значения. В этот момент стоимость пищи для кур превосходит ценность производимых ими яиц. Обычной практикой является линька птиц в это время с тем, чтобы, когда курица возобновит кладку яиц, уровень ее яйценоскости увеличился.

Таким образом, композиция по настоящему изобретению, поскольку она сохраняет более высокий уровень яйценоскости по сравнению с тем случаем, когда птицу не подвергают воздействию указанной композиции, снижает или устраняет необходимость проведения линьки птиц. Снижение или устранение необходимости линьки птиц приводит к значительной экономии. Более того, в течение времени, когда птицу подвергают линьке, она не является продуктивной по отношению к затратам на ее питание в период до линьки, а затем она некоторое время не является продуктивной после того, как кормление возобновляют. Поддержание яйценоскости на повышенном уровне поэтому устраняет или снижает необходимость в этих непродуктивных фазах птицы, уменьшая тем самым расходы заводчика кур и увеличивая его доходы, поддержание яйценоскости на повышенном уровне приводит к дальнейшему увеличению прибылей заводчика кур, поскольку уровень яйценоскости кур после линьки не равен уровню их яйценоскости в течение первого цикла кладки яиц, как это уже отмечено ранее.

Если коротко, то уровень яйценоскости птиц увеличивают, устраняя необходимость проведения линьки птиц, путем назначения эффективного количества ксеногенного белка по настоящему изобретению, с целью вызвать по отношению к нему ответную иммунологическую реакцию, а затем назначения эффективного количества ксеногенного белка (проведения повторной вакцинации) для поддержания большего, чем нормальный, уровня яйценоскости.

Другим неожиданным и удивительным аспектом настоящего изобретения является то, что композиция по настоящему изобретению приводит к получению большего количества яиц, имеющих пониженное содержание холестерина, по сравнению с яйцами, которые откладывают птицы, не подвергавшиеся обработке. В частности, если вышеуказанную композицию назначают самке птицы, как это описано ранее, то содержание холестерина в яйцах, откладываемых этой птицей, уменьшится на более длительный период по сравнению с птицей, которую не подвергали воздействию композиции по настоящему изобретению. Таким образом, композиция по настоящему изобретению увеличивает или приводит к получению большего количества яиц с меньшим содержанием холестерина.

Термины “увеличивает” или “большее количество” означают, что количество яиц с низким содержанием холестерина, получаемых от подвергнутой обработке птицы возрастает, по крайней мере, приблизительно на 5% по сравнению с количеством яиц с низким содержанием холестерина, которые откладывает не подвергнутая обработке птица. Количество получаемых яиц с низким содержанием холестерина предпочтительно возрастает, по крайней мере, приблизительно на 10%, а еще более предпочтительно возрастает, по крайней мере, приблизительно на 15%. Следует понимать, что “подвергнутая обработке” птица означает птицу, которой назначают ксеногенный белок по настоящему изобретению. Термин “низкое содержание холестерина” или “более низкое содержание холестерина” означает, что содержание холестерина в яйце ниже, чем среднее содержание холестерина в яйцах, откладываемых видами птиц в течение ее жизни, по крайней мере, на 10%. Предпочтительно содержание холестерина в яйцах с низким содержанием холестерина ниже, чем среднее содержание, приблизительно на 20%. Еще более предпочтительно содержание холестерина в яйцах с низким содержанием холестерина ниже, чем среднее содержание, приблизительно на 30%.

Известно, что у домашних кур первые пять или шесть яиц, откладываемых самкой птицы (курицей) после достижения ею половой зрелости, содержат меньше холестерина, чем яйца, которые она откладывает позднее. Композиция по настоящему изобретению заставляет самок птиц откладывать яйца с низким содержанием холестерина в течение более длительного периода времени. В результате последствий, оказывающих влияние на здоровье, которые связаны с высоким содержанием холестерина в крови, существует потребность в получении яиц с низким содержанием холестерина. Таким образом, композиция по настоящему изобретению позволяет получить яйца, большее количество которых представляют собой требуемые типы яиц.

Таким образом, способы по настоящему изобретению для увеличения производства яиц и ускорения начала кладки яиц приведут к значительному увеличению роста популяции, а потому и рынка бескилевых, таких как страус и эму, поскольку их недостаточный в настоящее время уровень яйценоскости будет увеличен благодаря способу по настоящему изобретению. Способ по настоящему изобретению удовлетворит также постоянную потребность в домашних птицах, таких как куры, и их яйцах.

Применение способа по настоящему изобретению для увеличения воспроизводства яйцеклеток не ограничена лишь кладкой яиц птицами. Способ по настоящему изобретению для увеличения воспроизводства яйцеклеток может использоваться для улучшения продуцирования яйцеклеток многими животными. Например способ по настоящему изобретению может применяться для увеличения воспроизводства яйцеклеток у большинства животных, выращиваемых в сельском хозяйстве, таких как свиньи, коровы, овцы и цыплята. Кроме того, способ по настоящему изобретению может применяться для увеличения воспроизводства яйцеклеток у животных, имеющих мех, таких как норка, лисица, выдра, хорек и енот, а также других животных, шкуры которых используются в декоративных целях. Далее, способ увеличения воспроизводства яйцеклеток по настоящему изобретению может также использоваться для увеличения популяции многих животных, таких как экзотические виды или подверженные опасности виды, с целью предотвращения их вымирания. Способ по настоящему изобретению может также применяться для увеличения воспроизводства яйцеклеток у животных, которые используются для гонок, развлечений или шоу (соревнований), таких как лошади, собаки, кошки, животные, содержащиеся в зоопарках, и цирковые животные. Далее, способ по настоящему изобретению может быть использован в качестве терапевтического метода для лечения бесплодия у человека.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения антител, направленных против ксеногенного белка по настоящему изобретению. В общем случае способ получения антител, направленных против ксеногенного белка включает следующие стадии: назначение животному эффективного количества ксеногенного белка, содержащего белок ингибин или его фрагмент и белок-носитель, так что у животного возникает иммунологическая ответная реакция, направленная против ксеногенного белка: отбор образца крови у животного; выделение из сыворотки образца крови любых антител, направленные против ингибина. Антитела преимущественно выделяют из сыворотки крови, пропуская сыворотку через колонку, содержащую эффективные количества белка-носителя, с целью отделения антитела от сыворотки. Методы, применяемые для получения и очистки антител, направленных против ксеногенного белка по настоящему изобретению, хорошо известны специалистам в данной области техники.

Следует также понимать, ксеногенный белок по настоящему изобретению может назначаться любому животному в зависимости от типа требуемых антител. Следует также понимать, что ингибин может быть экзогенным или эндогенным. Таким образом, тип ингибина и ксеногенного белка по настоящему изобретению и вид животного, которому назначают композицию, определяется тем, какой тип антитела желателен. Например, ксеногенный белок, содержащий ингибин домашней курицы и связывающий мальтозу белок, может назначаться страусу, с целью получения у страуса антител ингибина антикурица. Аналогично, ксеногенный белок, содержащий ингибин страуса и связывающий мальтозу белок, может назначаться страусу, с целью получения у страуса антител ингибина антистраус.

Настоящее изобретение относится к способу определения количества ингибина, продуцируемого животным, что позволяет определить яйценесущую способность животного. Если коротко, то способ определения количества ингибина в крови животного включает следующие стадии: отбор образца крови у животного; контактирование образца крови с антиингибиновыми антителами, специфично направленными против эндогенного ингибина животного, в условиях, которые позволяют антителам селективно взаимодействовать с ингибином, если он присутствует в образце; отделение каких-либо не вступивших во взаимодействие антител от вступивших во взаимодействие антител; и определение количества антител, которые вступили во взаимодействие.

Для специалиста в данной области техники очевидно, что методики иммуноанализа, которые могут использоваться в указанном выше способе, хорошо известны из области техники. Поэтому любой метод иммуноанализа, любые методики формирования метки в ее визуализации, известные из области техники, могут быть применены в вышеуказанном способе. Предпочтительным иммуноанализом является ELISA (ферментативный иммуносорбентный анализ), а предпочтительной меткой является пероксидаза из хрена. Другой предпочтительной меткой является окрашенный латексный шарик. Орашенный латексный шарик может иметь любой цвет, необходимый для осуществления визуализации. Латексный шарик предпочтительно имеет желтый, красный, голубой или зеленый цвет. Латексный шарик может быть полым или твердым, однако предпочтительно он является полым, с целью минимизации его веса. Размер латексного шарика варьирует в зависимости от цели его использования в иммуноанализе. Специалисты в данной области техники с помощью стандартных анализов подберут наибольший размер шарика, который еще виден, но не оказывает стерических препятствий для протекания реакций иммуноанализа. Предпочтительно диаметр латексного шарика составляет не более 0,5 мкм, а наиболее предпочтительно он составляет менее 0,2 мкм.

Например, концентрации циркулирующего в крови птицы ингибина могут быть установлены с использованием стандартной методики сэндвичевого ферментного иммуносорбентного анализа. Вначале связывают антиингибиновые антитела, направленные против порции ингибина или его фрагмента в ячейках планшета для микротитрования. После промывки и блокировки планшета добавляют некоторое количество крови, взятой у испытуемой птицы. Дают ингибину, который может содержаться в образце, селективно прореагировать с иммобилизованным антиингибиновым антителом, а затем образец вымывают из ячейки планшета. Далее в ячейку добавляют меченые антиингибиновые антитела, действие которых направлено на другую часть ингибина или его фрагмент, по сравнению с антителом, иммобилизованным в ячейке. Антитело может быть помечено любой меткой, известной из области техники, такой как пероксидаза из хрена. Дают меченому антиингибиновому антителу провзаимодействовать с возможным иммобилизованным ингибином, а затем не прореагировавшие меченные антиингибиновые антитела удаляют с помощью промывки. Количество присутствующего в плазме образца ингибина определяют, используя подходящий метод визуализации метки, который применяется в ферментном иммуносорбентном анализе, с целью количественного определения иммобилизованного антиингибинового антитела в ячейке. Одновременно в соседних ячейках проводят анализ с негативными и позитивными контрольными образцами.

Следует понимать, что вышеуказанный способ позволяет определить репродуктивный потенциал любого животного, которое продуцирует ингибин. Способ по настоящему изобретению может использоваться для определения количества ингибина, продуцируемого самкой животного любого вида, которое продуцирует ингибин. Животное может быть, среди прочих, птицей, млекопитающим, пресмыкающимся, земноводным или рыбой. Более конкретно млекопитающее может быть выбрано из группы, включающей, однако ими не ограничиваясь, корову, человека, лошадь, кошку, собаку, овцу, норку, лисицу, выдру, хорька, енота и свинью. Птицу можно выбрать, однако этим не ограничиваясь, из страуса, эму и курицы. Предпочтительным животным является птица. Более предпочтительным животным является бескилевая птица. Наиболее предпочтительным животным является страус. Еще одним предпочтительным животным является эму. Еще одним предпочтительным животным является домашняя курица.

Животные с высоким уровнем ингибина обладают низким репродуктивным потенциалом и в зависимости от видов и от того, выращиваются ли они в сельскохозяйственных целях, подобных животных, продуцирующих мало яйцеклеток, можно отправить на убой, а не держать для размножения. Напротив, разводимые в сельскохозяйственных целях животные с низким уровнем ингибина являются хорошими производителями яйцеклеток и их обычно используют для размножения и не отправляют на убой.

Уровень ингибина у животного варьирует в зависимости от возраста, вида и времени года относительно периода размножения (если он есть). Таким образом, определение потенциала животного по продуцированию яйцеклеток может быть определено относительно указанных факторов, и измерение уровней ингибина у животного имеет наибольшую ценность при сравнении со средними уровнями ингибина у тех же видов животного, приблизительно одного возраста, в то же самое время года, если животное имеет период размножения.

Поскольку количество ингибина, продуцируемого птицей, варьирует в зависимости от указанных факторов, то относительные количества ингибина приведены далее для различных возрастных категорий птиц. Таблица 1 иллюстрирует различия у бескилевых, таких как эму и страус, относительно воспроизводства ими ингибина в зависимости от того, обладают ли они плохой или хорошей яйценоскостью, а также в зависимости от возраста бескилевой птицы.

В таблице 1 уровень ингибина приведен относительно обобщенного значения 1 для самок страусов, откладывающих в среднем за сезон от 50 до 60 яиц, что является хорошим показателем, и значения 7 для функционально непродуктивных самок бескилевых, откладывающих за сезон менее 5 яиц, что является плохим показателем.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ получения антител, направленных против класса других антител животного, таких как иммуноглобулины. Если коротко, то способ получения у животного антител, направленных против других иммуноглобулинов животного, включает следующие стадии: назначение эффективного количества класса антител первого животного, таких, что получают вышеописанными способами, второму животному, так что у второго животного возникает иммунологическая ответная реакция против антител первого животного; отбор пробы крови у второго животного; и выделение антител второго животного из сыворотки образца крови, как это указано ранее. Второе животное предпочтительно является животным другого вида по отношению к первому животному.

Настоящее изобретение относится также к способу определения, дает ли животное иммунологическую ответную реакцию на введение провокационной пробы в виде композиции, содержащей ингибин. В этом способе используют антитела второго животного, направленные против класса антител первого животного, как это описано ранее. Если коротко, то способ включает связывание ингибина или ксеногенного белка по настоящему изобретению с твердой фазой и контактирование иммобилизованного ингибина с образцом крови у испытуемого животного. Образец контактирует с иммобилизованным ингибином в условиях, при которых ингибин селективно взаимодействует с антиингибиновыми антителами в образце. После удаления не вступивших во взаимодействие антител из образца и промывки добавляют некоторое количество содержащих метку антител второго животного, которые направлены против класса антител первого животного. Содержащие метку антитела, которые направлены против антител животного, затем селективно взаимодействуют с антителами, которые связаны с иммобилизованным ингибином. После удаления непрореагировавших антител, содержащих метку, определяют наличие или количество вступивших во взаимодействие антител, содержащих метку, путем визуализации метки. Таким образом, способ позволяет установить присутствие и количество антител, направленных против ингибина животного, а потому позволяет определить, способно ли животное давать иммунологическую ответную реакцию на введение композиции, содержащей ингибин.

Следует понимать, что вышеуказанный способ определения, дает ли животное иммунологическую ответную реакцию на введение провокационной пробы в виде композиции, содержащей ингибин, может быть осуществлен для самки животного любого вида. Животное может быть, среди прочих, птицей, млекопитающим или пресмыкающимся. Более конкретно млекопитающее может быть выбрано из группы, включающей, однако ими не ограничивается, корову, человека, лошадь, кошку, собаку, овцу, норку, лисицу, выдру, хорька, енота и свинью. Птицу можно выбрать, однако этим не ограничиваясь, из страуса, эму, нанду и курицы. Предпочтительным животным является птица. Более предпочтительным животным является бескилевая птица. Наиболее предпочтительным животным является страус. Еще одним предпочтительным животным является эму. И еще одним предпочтительным животным является нанду.

Для специалиста в данной области техники очевидно, что методики иммуноанализа, которые могут использоваться в указанном выше способе, хорошо известны из области техники. Поэтому любой метод иммуноанализа, любые методики формирования метки и ее визуализации, известные из области техники, могут быть применены в вышеуказанном способе. Предпочтительным иммуноанализом является ферментный иммуносорбентный анализ, а предпочтительной меткой является пероксидаза из хрена. Другой предпочтительной меткой является окрашенный латексный шарик. Окрашенный латексный шарик может иметь любой цвет, необходимый для осуществления визуализации. Латексный шарик предпочтительно имеет желтый, красный, голубой или зеленый цвет. Латексный шарик может быть полым или твердым, однако предпочтительно он является полым, с целью минимизации его веса. Размер латексного шарика варьирует в зависимости от цели его использования в иммуноанализе. Специалисты в данной области техники с помощью стандартных анализов подберут наибольший размер шарика, который еще виден, но не оказывает стерических препятствий для протекания реакций иммуноанализа. Предпочтительно диаметр латексного шарика составляет не более 0,5 мкм, а наиболее предпочтительно он составляет менее 0,2 мкм.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения связан с указанным выше способом определения, дает ли животное иммунологическую ответную реакцию на введение провокационной пробы в виде композиции, содержащей ингибин, при этом метод иммуноанализа модифицируют следующим образом. Если коротко, то способ включает отбор у животного образца крови и контактирование его с меченым ингибином животного или его фрагмента. Образец контактирует с меченым ингибином животного в условиях, при которых ингибин животного селективно взаимодействует с любыми антиингибиновыми антителами в образце. После удаления из образца не вступившего во взаимодействие меченого ингибина наличие или количество вступившего во взаимодействие меченого ингибина определяют путем визуализации метки. Ингибин, используемый в указанном способе выбирают, однако этим не ограничиваются, из слитого ксеногенного белка ингибина по настоящему изобретению; эндогенного ингибина или его фрагмента; и экзогенного ингибина или его фрагмента. Предпочтительным ингибином, содержащим метку, является эндогенный ингибин.

Настоящее изобретение далее поясняется следующими примерами, которые ни в коем случае не ограничивают объем притязаний по настоящему изобретению. Напротив, должно быть очевидно, что настоящее описание является источником других возможных способов осуществления, модификаций или эквивалентов настоящего изобретения, которые после ознакомления с настоящим описанием могут быть разработаны специалистами в данной области техники, при этом они не противоречат сущности изобретения и/или объему притязаний по формуле изобретения.

Пример 1. Способ получения слитого генного продукта, содержащего ген, кодирующий экспрессию ингибина курицы, и ген кодирующий экспрессию белка, связывающего мальтозу
Ниже приводится способ получения слитого генного продукта, содержащего ген (сINA515), кодирующий экспрессию фрагмента альфа-субъединицы ингибина курицы (Последовательность с номером идентификации 2 или Последовательность с номером идентификации 4) и гена, кодирующего экспрессию белка, связывающего мальтозу. Слитый генный продукт по настоящему изобретению получают из набора векторов pMAL-с, который производится компанией “New England Biolabs”(Беверли, штат Массачусетс).

Векторы pMAL позволяют осуществить экспрессию белка из подвергнутого клонированию гена или открытой рамки считывания генетической информации. Подвергнутый клонированию ген вставляют в прямом направлении от гена ma1E кодирующего белок, связывающий малотозу (“МВР”), что приводит к экспрессии слитого белка с белком, связывающим мальтозу (“MBP-cINA515”). Этот способ позволяет осуществить на высоком уровне экспрессию клонированных последовательностей и одностадийную очистку белка слияния, MBP-cINA515, используя аффинность MBP по отношению к мальтозе.

Далее приводится способ лигирования гена ингибина, cINA515, к вектору pMAL-c.

1. Ферментируют 0,5 мг ДНК плазмиды pMAL в 20 мкл с геном ингибина курицы, cINA515.

2. Ферментируют 20 мкг ДНК из клона gt 11 в 200 мкл с геном ингибина курицы, cINA515.

3. Добавляют 0,05 единиц кишечной алкалинфосфатазы теленка (NEB # 290) к продукту ферментации ДНК. Выдерживают при температуре 37^oC в течение часа.

4. Проверяют полноту протекания ферментации путем изучения 4 мкл реакционной смеси pMAL и 15 мкл реакционной смеси на 0,8%-ном агарозном геле. Добавляют к продуктам ферментации pMAL и gtll соответственно 1 мкл и 8 мкл 0,5 М раствора ЭДТК.

5. К продуктам рестрикционной ферментации добавляют равный объем смеси фенол/хлороформ (1:1), перемешивают, удаляют водную (верхнюю) фазу и помещают в свежую пробирку. Повторяют с одним хлороформом.

6. Добавляют к вектору ферментации 10 мкг гликогена или тРНК в качестве носителя. К обоим продуктам ферментации добавляют 1/10 часть объема 3 М раствора ацетата натрия, перемешивают, а затем добавляют равный объем изо-пропанола. Оставляют при комнатной температуре в течение 10 минут.

7. Помещают в микроцентрифугу на 15 минут. Жидкость над осадком сливают, промывают таблетку 70%-ным этанолом и дают высохнуть.

8. Вновь суспендируют каждый образец в 25 мкл 10 мМ раствора Tris-C1, 1 мМ растворе ЭДТК с pH 8,0.

8. Смешивают: 1 мкл продукта ферментации вектора; 6 мкл продукта ферментации инсерции; добавляют 8 мкл воды, а затем нагревают смесь ДНК до температуры 65^oС в течение 5 минут. Охлаждают на льду, а затем добавляют 4 мл буфера 5х лигазы; 0,5 мкл лигазы NEB Т4 (# 202; около 200 единиц); и выдерживают при температуре 16^oC в течение не менее 2 часов или оставляют на ночь.

10. Нагревают в течение 5 минут до температуры 65^oC; охлаждают на льду.

11. Смешивают с 25 мкл конкурентного TB1 (или любую lacZ -комплементарную цепочку) и выдерживают на льду в течение 5 минут. Нагревают в течение 2 минут до температуры 42^oC.

12. Добавляют 0,1 мл LB и выдерживают в термостате при температуре 37^oC в течение 20 минут. Помещают на LB планшет, содержащий 100 мг/мл ампициллина. Оставляют на ночь в инкубаторе при температуре 37^oС. Отбирают колонии с помощью стерильной деревянной палочки на эталонный планшет LB amp и планшет LB amp, содержащий 80 мкг/мл Xga1 и 0,1 мМ изопропилтиогалактозида. Выдерживают в термостате при температуре 37^oC в течение от 8 до 16 часов. Вычисляют фенотип планшета Lac и выделяют “белые” клоны из эталонного планшета.

13. Проводят анализ на наличие инсерций одним или обоими следующими способами:
А. Получают минипрепарат ДНК. Ферментируют с подходящей эндонуклеазой рестрикции, с целью определения присутствия и ориентации инсерций.

В. i) Выращивают 5 мл культуры в бульоне LB amp до величины приблизительно 210⁸ мл.

ii) Берут образец в количестве 1 мл. Помещают в микроцентрифугу на 2 минуты, жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 50 мкл буфера для проведения электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

iii) К оставшейся культуре добавляют изопропил-тиогалактозид до концентрации 0,3 мМ, например 15 мкл 0,1 М маточного раствора. Выдерживают в термостате при температуре 37^oC при хорошей аэрации в течение 2 часов.

iv) Берут пробу объемом 0,5 мл. Микроцентрифугируют в течение 2 минут, жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 100 мкл буфера для проведения электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

v) Кипятят образцы в течение 5 минут. Подвергают 15 мкл каждого образца электрофорезу на 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Окрашивают гель с помощью бриллиантового голубого Кумасси. Введенная полоса легко визуализируется в положении, соответствующем молекулярному весу белка слияния. Молекулярный вес самого белка, связывающего мальтозу, составляет 42000 дальтон.

Пример 2. Способ получения слитого ксеногенного белка “MBP-cINA515”, содержащего ингибин курицы и белок, связывающий мальтозу
Ниже приводится способ получения слитого ксеногенного белка, содержащего ингибин курицы и белок, связывающий мальтозу, “MBP- cINA515”. Слитый генный продукт по Примеру 1 экспрессирует слитый ксеногенный продукт связывающий мальтозу белок – ингибин, “MBP-cINA515”, следующим образом:
1. Вносят в 80 мл обогащенной питательной среды, содержащей галактозу и ампициллин (см, ниже раздел Среды и растворы) 0,8 мл выдержанной в течение ночи культуры клеток, содержащих плазмиду слияния по Примеру 1.

2. Выращивают при температуре 37^oC при хорошей аэрации до величины 2 x 10⁸ клеток/мл (A₆₀₀~ 0,5). Берут образец объемом 1 мл и помещают в микроцентрифугу на 2 минуты (неиндуцированные клетки). Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 50 мкл буфера для проведения электрофореза на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Перемешивают и помещают на лед.

3. К оставшейся культуре добавляют изопропилтиогалактозид до конечной концентрации 0,3 мМ, в частности 0,24 мл маточного 0,1 М раствора в воде (см. раздел Среды и растворы). Продолжают инкубацию при температуре 37^oC в течение 2 часов. Берут образец объемом 0,5 мл и помещают в микроцентрифугу на 2 минуты (индуцированные клетки). Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 100 мкл буфера для проведения электрофореза на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Перемешивают и помещают на лед.

4. Делят культуру на две аликвоты. Отделяют клетки центрифугированием с ускорением 4000 x g в течение 10 минут. Жидкость над осадком сливают. Одну таблетку (образец А) повторно суспендируют в 5 мл буфера для проведения лизиса (см. раздел Cреды и растворы). Вторую таблетку (образец В) повторно суспендируют в 10 мл 30 мМ раствора Tric-Cl, содержащем 20% сахарозы, с pH 8(8 мл для каждого 0,1 г клеток в сыром виде).

5. Замораживают образец на бане сухой лед – этанол (или оставляют на ночь при температуре -28^oC). Оттаивают в холодной воде (при 20^oC более эффективно, чем при 70^oC, однако занимает больше времени).

6. Подвергают ультразвуковой обработке, контролируя процесс разрушения клеток путем определения количества высвобождающегося белка с помощью анализа Брэдфорда или высвобождения нуклеиновой кислоты при A_260′ до тех пор, пока не будет достигнут максимум. Добавляют 0,6 мл 4 М раствора хлорида натрия.

7. Центрифугируют с ускорением 9000 х g в течение 20 минут. Декантируют жидкость над осадком (сырой экстракт 1) и хранят на льду. Таблетку вновь суспендируют в 5 мл буфера для проведения лизиса. Получают суспензию нерастворимого вещества (сырой экстракт 2).

Колоночную очистку полученного ранее ксеногенного продукта связывающий мальтозу белок-ингибин, “МВР-cINA515”, проводят следующим образом:
1. Дают смоле амилозы (1,5 г) набухнуть в течение 30 минут в 50 мл буфера для проведения колоночной хроматографии (см. Среды и растворы) в колбе емкостью 250 мл. Проводят дегазирование с помощью аспиратора. Помещают в колонку размером 2,5 х 10 см. Промывают колонку тремя ее объемами с помощью того же самого буфера + 0,25% Tween 20.

Необходимое количество смолы зависит от количества полученного белка связывания. Смола связывает около 3 мг/мл придонного объема колонки, так что колонки емкостью 15 мл должно быть достаточно для получения до 45 мг белка слияния на литр культуры. Шприц емкостью 50 мл с пробкой из силанизированного стекловолокна может быть заменен колонкой 2,5 см. Отношение высоты колонки к диаметру должно быть не более 4.

2. Разбавляют сырой экстракт 1:5 колоночным буферным раствором + 0,25% Tween 20. Загружают разбавленный сырой экстракт со скоростью [10x(диаметр колонки в см)²] мл/час. Это составляет приблизительно 1 мл/мин для колонки 2,5 см.

Разбавление сырого экстракта проводят для уменьшения концентрации белка до величины приблизительно 2,5 мг/мл. Если сырой экстракт менее концентрированный, то его не следует так сильно разбавлять. Хорошее правило правой руки заключается в том, что 1 г сырых клеток дает приблизительно 120 мг белка.

3. Промывают двумя объемами колоночного буферного раствора + 0,25% Tween 20.

4. Промывают тремя объемами колоночного буферного раствора без Tween 20.

5. Элюируют белок слияния, “MBP-cINA515”, колоночным буферным раствором + 10 мМ мальтозы + 0,1% додецилсульфата натрия (необязательно 10 мМ бета-меркапто- этанола, 1 мМ EGTA). Отбирают 10-20 фракции по 3 мл.

Анализируют фракции на наличие белка, т.е. по методу
Брэдфорда или A_260′ во фракциях, содержащих белок слияния, он легко обнаруживается. Белок слияния элюируется вскоре после того как проходит мертвый объем колонки.

Среды и растворы
Обогащенная среда + глюкоза и ампициллин = на литр:
10 г триплона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлорида натрия, 2 г глюкозы. Выдерживают в автоклаве; добавляют стерильный ампициллин до концентрации 100 мкг/мл.

0,1 М раствора изопропил –-o-тиогалактозида = 1,41 г изопропил –-o- тиогалактозида; добавляют воду до 50 мл. Фильтруют и стерилизуют.

0,5 М буферный раствор фосфата натрия, pH 7,2 (маточный раствор) =
(A) 69,0 г NaH₂PO₄H₂O до 1 л H₂O.

(B) 70,9 г Na₂HPO₄ до 1 л H₂O.

Смешивают 117 мл (A) и 383 мл (B). pH маточного раствора должен составлять приблизительно 7,2. В разбавленном до 10 мМ колоночном буфере pH должен составлять 7,0.

Буфер для лизиса.

На литр – конечная концентрация
20 мл 0,5 М раствора Na₂HPO₄ – 10 мМ фосфата;
1,75 г NaCl – 30 мМ хлорида натрия;
10 мл 25%-ного Tween 20 – 0,25% Tween 20;
0,7 мл бета-меркаптоэтанола (не обязательно) – 10 мМ бета-меркаптоэтанола;
20 мМ 0,5 М раствора ЭДТК (pH 8) – 10 мМ ЭДТК;
10 мл 1 М раствора EGTA (pH 7) – 10 мМ EGTA.

Доводят до pH 7,0 с помощью HCl или NaOH.

Колоночный буфер.

На литр – конечная концентрация:
20 мл 0,5 М раствора фосфата натрия, pH 7,2 – 10 мМ фосфата;
29,2 г NaCl – 0,5 М хлорида натрия;
1 мл 1 М раствора азида натрия – 1 мМ азида;
0,7 мл бета-меркаптоэтанола (не обязательно) – 10 мМ бета-меркаптоэтанола;
1 мл 1 М раствора EGTA (pH 7) (не обязательно) – 1 мМ EGTA,
Доводят до pH 7,0 в случае необходимости.

Колоночный буфер с низким содержанием соли.

На литр – конечная концентрация:
20 мл 0,5 М раствора фосфата натрия, pH 7,2 – 10 мМ фосфата;
1,75 г NaCl – 30 мМ хлорида натрия;
1 мл 1 М раствора азида натрия – 1 мМ азида;
0,7 мл бета-меркаптоэтанола (не обязательно) – 10 мМ бета-меркаптоэтанола;
1 мл 1 М раствора EGTA (pH 7) (не обязательно) – 1 мМ EGTA.

Доводят до pH 7,0 в случае необходимости.

Чистоту слитого ксеногенного белка ингибин курицы – MBP. “MBP-cINA515”, после прохождения колонки иллюстрируют на фиг. 1 дорожки “E”. Дорожка “F” обозначает элюент из колонки, когда в нее не загружают ксеногенный белок (негативный контрольный образец). Дорожки, обозначенные как “B”, соответствуют стандартам плизмидного вектора pMAL-c. Дорожки, обозначенные как “C”, соответствуют стандартам молекулярного веса. Дорожки, обозначенные как “D”, соответствуют реальному вектору pMAL-c, который используется для получения слитого ксеногенного белка ингибин курицы-MBP, “MBP-cINA515”, перед проведением инсерции гена ингибина, как это описано в Примере 2. Указанные выше белки подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, используя гель для проведения электрофореза на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, и окрашивают с помощью бриллиантового голубого Кумасси.

Пример 3. Способ иммунизации страуса против ингибина
Далее приводится способ иммунизации страуса против ингибина. Первичную иммунизацию страусу проводят приблизительно за 6 месяцев перед первым периодом размножения, а затем в течение шести месяцев с интервалами в один месяц проводят повторные иммунизации. Таким образом, предпочтительно назначать первичную иммунизацию страуса, когда его возраст составит приблизительно от 18 до 24 месяцев. Первичная иммунизация включает назначение приблизительно от 1,5 до 3,0 мг слитого ксеногенного белка, содержащего ингибин (фрагмент альфа-субъединицы) и белок, связывающий мальтозу, по методу, описанному в Примерах 1 и 2. Повторные иммунизации включают назначение приблизительно от 0,75 до 1,5 мг слитого ксеногенного белка. Для проведения первичной иммунизации слитый ксеногенный белок эмульгируют в полном адъюванте Фрейнда (“Sigma Chemical Co.”, Сент-Луис, штат Миссури), а для проведения повторных иммунизаций слитый ксеногенный белок эмульгируют в неполном адъюванте Фрейнда (“Sigma”). Композицию слитого ксеногенного белка вводят подкожно в три места в верхней части голени страуса.

Пример 4. Способ получения антител страуса, селективно направленных против ингибина
Далее приводится способ получения антител страуса (“антикурица антитела ингибина страуса”), которые селективно направлены против ксеногенного белка по настоящему изобретению, содержащему ингибин курицы и белок, связывающий мальтозу. В частности, антитела страуса являются антителами IgG. Используемый ксеногенный белок представляет собой слитый белок, содержащий ингибин курицы и белок, связывающий мальтозу, получаемый по способам, приведенным в Примерах 1 и 2. С целью получения антител, страуса иммунизуют ксеногенным белком ингибин курицы – МВР, получаемым по способу, приведенному в Примере 3.

Количество, которое вводят страусу, должно быть достаточно для того, чтобы вызвать ответную иммунную реакцию у страуса против ксеногенного белка. Отбирают у страуса приблизительно 5 мл крови и выделяют из полученного образца крови антитела, направленные против ингибина. Для выделения антител можно использовать любой способ, известный из области техники. Предпочтительно используют стандартные методики ферментного иммуносорбентного анализа.

Пример 5. Способ получения антител козла, селективно направленных против антител страуса.

Далее приводится способ получения антител козла, селективно направленных против антител страуса, включая антитела, полученные по Примеру 4, в частности, антитела IgG страуса. В этом способе козла иммунизуют иммуноглобулином Г страуса в количестве от 0,5 до 3,0 мг, так что у козла возникает ответная иммунологическая ответная реакция против IqC-страуса. IgG-страуса выделяют из фонда сыворотки, полученной от разных страусов. У козла берут образец крови и затем выделяют антистраусовый IgG, используя стандартные методики, хорошо известные из области техники.

Фонд сыворотки очищают с помощью стандартных методов, которые включают осаждение 50%-ным сульфатом аммония, а затем подвергают фракционированию, используя колонку с белком-A на сефарозе. Осаждение IgG – предпочтительно проводят следующим образом. Двенадцать миллилитров сыворотки, содержащей IgG, разбавляют 1: 1 50 мМ раствором Tris (pH 8,0). Затем медленно при перемешивании добавляют 24 мл насыщенного раствора сульфата аммония (все операции проводят при температуре 4^oC) и перемешивают полученную смесь приблизительно в течение 2 часов. Центрифугируют смесь со скоростью 10000 об/мин в течение 10 минут для отделения осадка. Его вновь суспендируют в 50 мМ растворе Tris/солевой раствор (до 12 мл) и подвергают диализу в течение ночи по отношению к 2 л 50 мМ Tris при температуре 4^oC, при этом конечный объем составляет 20 мл.

Последующую фракционализацию на колонке белка-A на сефарозе предпочтительно проводят следующим образом. Колонка содержит белок-A на сефарозе CL-4B (“Pharmacia Biotech., Inc.”, Пискатауэй, штат Нью-Джерси). В колонку помещают приблизительно 5 миллилитров осадка сульфат аммония/сыворотка. Дают образцу связаться с белком-A на сефарозе в течение приблизительно 30 минут. Затем колонку промывают 0,1 М фосфатным буфером (pH 7,5) и абсорбированный IgG элюируют 0,1 М раствором глицина (pH 2,8). Наконец, полученные при элюировании фракции нейтрализуют, добавляя несколько капель 1 М раствора Tris – HCl (pH 9). Качество очищенного IgG страуса, прежде чем его назначат козлу, оценивают путем визуализации после проведения электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Способ иммунизации и вспомогательные вещества
не являются критичными для настоящего изобретения и поэтому может использоваться любой известный из области техники способ иммунизации и любая известная из области техники система вспомогательных веществ. Предпочтительно очищенный IgG страуса вводят козлу в виде подкожной инъекции. Повторные инъекции преимущественно назначают с интервалами в четыре недели, используя неполный адъювант Фрейнда. Очищенный IgG назначают вместе с полным адъювантом Фрейнда или Titermax Хантера (Sigma Chemical Co.”, Сент-Луис, штат Миссури). Удовлетворительная ответная реакция формируется у козла после трех или четырех инъекций.

Затем у козла берут 5-10 мл крови и выделяют из образца антитела козла, направленные против IgG страуса. Для выделения из образца крови антител козла применяют любые методики, хорошо известные из области техники. Предпочтительный способ выделения из образца антител козла заключается в пропускании образца крови через колонку с IgG страуса. Затем антитела козла вымывают из колонки с помощью глицинового буферного раствора с pH 8,0.

Пример 6. Способ контролирования иммунологической ответной реакции страуса после вакцинации слитым ксеногенным белком.

Далее приводится способ контролирования иммунологической ответной реакции страуса после того, как ему вводят вакцину слитого ксеногенного белка, содержащего ингибин курицы и белок, связывающий мальтозу, полученный по способу, приведенному в Примере 1 и 2, при этом ответную иммунологическую ответную реакцию контролируют, используя антитела козла, полученные по Примеру 5. Для определения, дает ли страус иммунологическую ответную реакцию на введение слитого ксеногенного белка ингибин-МБР, вначале связывают ксеногенный белок с твердой фазой. Затем у страуса, которому была введена вакцина ксеногенного белка, берут 5 – 10 мл крови и отделяют сыворотку. Иммобилизованный ксеногенный белок контактирует с сывороткой в условиях, при которых ксеногенный белок селективно взаимодействует с любыми антиингибиновыми антителами сыворотки. После промывки добавляют антитела козла, полученные по Примеру 5, которые содержат метку пероксидазы из хрена. Содержащие метку антитела козла селективно взаимодействуют с антителами страуса, которые связаны с иммобилизованным ксеногенным белком. После удаления непрореагировавших антител, содержащих метку, определяют наличие или количество вступивших во взаимодействие антител, содержащих метку пероксидазы из хрена, путем визуализации метки добавлением нитротетразолия голубого, который является субстратом для пероксидазы из хрена.

Для специалиста в данной области техники очевидно, что методики иммуноанализа, которые используются в указанном выше способе, хорошо известны из области техники. Поэтому любой метод иммуноанализа, методики формирования метки и визуализации, известные из области техники, могут быть применены в вышеуказанном способе. Предпочтительным иммуноанализом является ферментный иммуносорбентный анализ, а предпочтительной меткой является пероксидаза из хрена. Другой предпочтительной меткой является окрашенный латексный шарик.

Пример 7. Способ определения репродуктивного потенциала страуса
Ниже приводится способ определения репродуктивного потенциала страуса путем проведения качественной оценки количества ингибина в крови страуса. Концентрации циркулирующего в крови страуса ингибина могут быть установлены с использованием стандартной методики сэндвичевого ферментного иммуносорбентного анализа. Вначале связывают антиингибиновые антитела, полученные по Примеру 4, в ячейках планшета для микротитрования. После промывки и блокировки планшета добавляют в ячейки некоторое количество плазмы крови или сыворотки, взятой у страуса. Дают ингибину, который может содержаться в образце, селективно прореагировать с иммобилизованным антиингибиновыми антителами, а затем образец вымывают из ячейки планшета. Далее в ячейку добавляют другие антиингибиновые антитела, отличные от антиингибиновых антител, полученных по Примеру 4, которые конъюгированы с пероксидазой из хрена. Конъюгированные с пероксидазой из хрена антиингибиновые антитела отличаются от иммобилизованных антиингибиновых антител тем, что их действие селективно направлено на другие части ингибина. Дают меченому антиингибиновому антителу селективно провзаимодействовать с возможным иммобилизованным ингибином, а затем не прореагировавшие меченые антиингибиновые антитела удаляют с помощью промывки. Количество присутствующего в плазме образца ингибина определяют, добавляя в ячейку нитротетразолий голубой и визуализуя количество меченого антиингибинового антитела к ячейке. Одновременно в соседних ячейках проводят анализ с негативными и позитивными контрольными образцами. Анализ с негативными и позитивными контрольными образцами в соседних ячейках следует проводить параллельно. Из области техники хорошо известны многие методики иммуноанализа, методики формирования метки, и ее визуализации. Таким образом, в настоящем изобретении могут использоваться любые методики иммуноанализа, методики формирования метки и ее визуализации.

Пример 8. Способ ускорения кладки яиц у перепела
Как указано ранее, клон комплементарной ДНК-субъединицы ингибина курицы (cINA6), введенный в положении EcoR 1 Bluescript, предоставлен P.A.Johnson (Корнельский университет). Фрагмент ДНК (“cINA515”) вырезают из клона cINA6 ферментацией с использованием Pst 1. ДНК cINA515 сопровождает большинство -субъединиц ингибина зрелых кур. Этот фрагмент (cINA515) клонируют в плазмиде p-MALTM-c в рамке с белком, связывающим мальтозу (“MBP”), и белок слияния нужного размера (дорожка “E”, фиг. 1) определяется после индукции изопропил –-D-тиогалактопиранозидом и электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Полученный белковый конъюгат (“MBP-cINA515”) используют в качестве антигена для иммунизации препубертантной самки японского перепела (Coturnix coturnix japonica) против циркулирующего ингибина, как это подробно описано ниже.

Выводок перепелов выращивают в батарее брудеров фирмы “Petersime ” модели 2S-D), приспособленной для перепелов. Первоначальный эксперимент по выращиванию проводят при температуре 37,8^oC, еженедельно снижая температуру на 2,8^oC до тех пор, пока она не достигнет комнатной. В период роста (т.е. приблизительно в возрасте 6 недель) птице дают вволю стартовый рацион (28% СР, 2800 ккал МЕ/кг пищи) и воду и используют непрерывные периоды рассеянного света (22 люкс) с соотношением 14 часов светлого времени (от 280 до 300 люкс): 10 часов темного времени. При достижении ими возраста 25 дней, 100 перепелов произвольно и равномерно делят на следующие четыре группы для проведения инъекций (по 25 птиц в каждой группе):
(1) MBP-cINA515 в полидиспергированном ацетилированном -(1,4)-связанном маннане (“Acemannan”), иммуностимулирующем носителе (Chinnah et al. , “Antigen dependent adjuvant activity of polydispersed -(1,4)-linked acetylated mannan (acemannan)”, Vaccine, Vol. 10, Issue 8, 1992, p. 551-557 (“MBP- cINA515/ACE”),
(2) MBP-cINA515 в адъюванте Фрейнда (“MBP-clNA515/FRN”),
(3) Acemannan (контроль иммуностимулятора; “ACE”) или
(4) адъювант Фрейнда (контроль адъюванта; “FRN”).

Птицам, которым проводят иммунизацию против ингибина (Группы 1 и 2), назначают приблизительно по 0,75 мг MBP-cINA515 каждой в соответствующем контрольном носителе. Эквивалентные объемы (0,2 мл) инъекций носителя ACE или FRN применяют, соответственно, в Группах 1 и 3 и Группах 2 и 4. Все инъекции осуществляют подкожно с помощью шприца для введения туберкулина, снабженного иглами номер 25. После проведения первичных инъекций, перепелам на крылья привязывают ленточки, чтобы идентифицировать их перед размещением (индивидуально) в клетки для откладывания яиц. В течение последующих пяти недель (т. е. в возрасте 32, 39, 46, 53 и 60 дней) каждой птице покожно проводят повторные вакцинации по 0,375 мг MBP-cINA515 или соответствующей контрольной провокационной пробы. Начиная с возраста 6 недель птицам дают вволю ростовой рацион (21% CP, 2750 ккал МЕ/кг пищи) и воду. При достижении птицами возраста 41 день (обозначают как День 1 цикла откладки яиц) в течение 12 последующих недель проводят регистрацию ежедневной откладки яиц курами (“HDEP”) и смертности (“MORT”). Далее, для каждой из четырех групп определяют средний возраст, когда наступает первая кладка яиц (“FIRST”) и возраст, когда 50% птиц начинают откладывать яйца (“FIFTY “).

Данные по ежедневной откладке яиц курами анализируют двумя разными методами вариационного анализа, каждый из которых включает полную рандомизацию с разбивкой данных и нанесением на график. В первом методе вариационного анализа основной график включает четыре варианта инъекций (MBP-cINA515/ACE, MBP-cINA515/FRN, ACE или FRN, а разбивка включает 12 периодов по 7 дней каждый. Во втором методе вариационного анализа для более полного изучения ответной реакции при иммунонейтрализации по отношению к ответной реакции при введении контрольных проб, объединяют данные двух обработок ингибином и данные для двух контрольных обработок. Таким образом, основной график включает два вида инъекций (объединенные данные MBP-cINA515/АСЕ и MBP-cINA515/FRN против объединенных данных АСЕ или FRR) для 12 периодов кладки яиц по 7 дней.

В настоящее время предварительно получены сведения лишь о 35 днях. Общий процент уровня ежедневной откладки яиц курами для еженедельных интервалов откладки яиц (день 0, 7, 14, 21 и 35) в течение первых 35 дней изучения приведен на фиг. 2 (где четыре группы с разными инъекциями рассматриваются как подвергаемые различным типам обработки) и фиг. 3 (где проводится сравнение неиммунизованных (контрольных) и ингибин-иммунизованных групп). Средние уровни ежедневной откладки яиц курами в течение Недели 1, Недели 2, Недели 3, Недели 4, Недели 5, или объединенные данные для недель с первой по пятую для четырех групп, которым проводили инъекции и которые рассматриваются независимо друг от друга, приведены в Таблице 2.

В Таблице 3 для тех же временных интервалов представлены средние уровни откладки яиц, при этом данные обобщены для сравнения контрольных групп и иммунизованных групп. Таблица 4 содержит данные для первого дня откладки яиц (FIST) для обоих рассматриваемых статистических схем обработки результатов (т. е. сравнение для четырех групп, которым проводили инъекции, и сравнение объединенных данных).

К настоящему времени смертность не является заметным фактором, поскольку умерло лишь четыре птицы (три контрольных, одна обработанная). Такая смертность (4%) вполне попадет в ожидаемые границы для перепелов, достигших возраста 76 дней. Далее, случаи появления яиц без оболочки, яиц с тонкой оболочкой и яиц неправильной формы не часты и вполне совпадают с нормальной вероятностью возникновения указанных случаев, при этом они равномерно распределены среди всех четырех групп обработки (т.е. иммунизация ингибином не приводит к изменению количества откладываемых птицами дефектных яиц).

Налицо первичный позитивный эффект от иммунонейтрализации ингибина на продуцирующую способность. Этот эффект особенно заметен для обобщенных данных HDEP (Таблица 3) и FIRST (Таблица 4), для которых большее количество результатов усиливает статистическую значимость примененных тестов.

Данные показывают, что наступление половой зрелости у подвергавшихся обработке групп птиц ускоряется. Это очевидно как для данных HDEP, так и для данных FIRST. Величина статистической значимости, связанная с большим средним значением уровня HDEP, установленного для обработанных ингибином перепелов в течение Недели 1 проведенного исследования, велика (P<0,0095); эта разница не столь очевидна (P<0,0888) в течение Недели 2 (Таблица 3). Эта пограничная разница между подвергнутыми обработке группами, наблюдаемая в течение Недели 2, может означать, что кладка яиц, хотя и отсроченная, начинает интенсифицироваться у перепелов контрольной группы (см. фиг.2).

Следовательно, можно ожидать, что величина статистических различий, обнаруженных между двумя испытуемыми группами (группы с ингибином по отношению к группам без ингибина) в течение Недели 1, будет несколько размываться с наступлением дня кладки яиц. В самом деле, когда данные, полученные в течение Недель 1 – 5, объединяют, то для кур, подвергнутых обработке ингибином, наблюдаются значительно более высокие уровни HDEP при средней величине статистической значимости (P<0,0763).

Кроме того, средний возраст, при котором иммунизованные перепела (возраст 51,98 дней) отложили свои первые яйца (FIRST) ускорился (P<0,0373) на 3+ дня по сравнению с неиммунизованными перепелами (возраст 55,33 дня) (Таблица 4). Это воздействие иммунизации ингибином на ускорение яйценоскости особенно заметно для перепелов, которым вводили MBP-cINA5l5/FRN и у которых среднее значение FIRST составляет 50, 38 дней с момента рождения (Таблица 4).

Пример 9. Способ ускорения кладки яиц у страусов.

Конъюгат белка (MBP-cINA515) используют как антиген для иммунизации препупертантных самок страуса против циркулирующего ингибина и, таким образом, для ускорения начала кладки яиц у подвергнутых обработке страусов. Применяют способ, описанный в Примере 8, со следующими исключениями. Средний возраст наступления половой зрелости у неподвергнутых обработке страусов составляет приблизительно от 28 до 32 месяцев. Далее приводится расписание обработок страусов, вес которых приблизительно составляет от 150 до 300 фунтов (от 68 до 136 кг): первая (первичная) инъекция 5,0 мг ксеногенного белка по настоящему изобретению в возрасте 26 месяцев; и повторные иммунизации в количестве 2,5 мг в возрасте 27, 28, 30, 32, 34 и 36 месяцев.

Пример 10. Способ ускорения кладки яиц у эму.

Конъюгат белка (MBP-cINA515) используют как антиген для иммунизации препубертантных самок эму против циркулирующего ингибина и, таким образом, для ускорения начала кладки яиц у подвергнутых обработке эму. Применяют способ, описанный в Примере 8, со следующими исключениями. Средний возраст наступления половой зрелости у неподвергнутых обработке эму составляет приблизительно 20 месяцев. Далее приводится расписание обработок эму, вес которых приблизительно составляет от 50 до 90 фунтов (от 23 до 41 кг): первая (первичная) инъекция 3,0 мг ксеногенного белка по настоящему изобретению в возрасте 18 месяцев; и повторные иммунизации в количестве 1,5 мг в возрасте 19, 20, 22, 24, 26 и 30 месяцев.

Пример 11. Способ ускорения кладки яиц у домашних кур.

Конъюгат белка (MBP-cINA515) используют как антиген иммунизации препубертантных кур против циркулирующего ингибина и, таким образом, для ускорения начала кладки яиц у подвергнутых обработке кур. Применяют способ, описанный в Примере 8, со следующими исключениями. Средний возраст наступления половой зрелости у неподвергнутых обработке кур составляет приблизительно 20 недель. Далее приводится расписание обработок кур, вес которых приблизительно составляет от 2,0 до 3,5 фунтов (от 0,9 до 1,6 кг): первая (первичная) инъекция 1,5 мг ксеногенного белка по настоящему изобретению в возрасте 15 недель; и повторные иммунизации в количестве 0,75 мг в возрасте 17, 20, 24, 30, 40 и 50 недель.

Пример 12. Способ ускорения кладки яиц у индюшек.

Конъюгат белка (MBP-cINA515) используют как антиген для иммунизации препубертантных индюшек против циркулирующего ингибина и, таким образом, для ускорения начала кладки яиц у подвергнутых обработке индюшек. Применяют способ, описанный в Примере 8, со следующими исключениями. Средний возраст наступления половой зрелости у неподвергнутых обработке индюшек составляет приблизительно 30 недель. Далее приводится расписание обработок индюшек, вес которых приблизительно составляет от 9,0 до 12 фунтов (от 4 до 5,4 кг): первая (первичная) инъекция 2,0 мг ксеногенного белка по настоящему изобретению в возрасте 28 недель; и повторные иммунизации в количестве 1,0 мг в возрасте 29, 30, 34, 38, 46 и 54 недели.

Пример 13. Способ ускорения кладки яиц у попугаев.

Конъюгат белка (MBP-с1НА515) используют как антиген для иммунизации препубертантных самок попугаев против циркулирующего ингибина и, таким образом, для ускорения начала кладки яиц у подвергнутых обработке попугаев. Применяют способ, описанный в Примере 8, со следующими-исключениями. Средний возраст наступления половой зрелости у неподвергнутых обработке попугаев составляет приблизительно 30 месяцев. Далее приводится расписание обработок попугаев, вес которых приблизительно составляет от 0,5 до 1,25 фунтов (от 225 до 570 г): первая (первичная) инъекция 0,75 мг ксеногенного белка по настоящему изобретению в возрасте 28 месяцев; и повторные иммунизации в количестве 0,375 мг в возрасте 29, 30, 32 34, 36 и 38 месяцев.

Следует понимать, что все вышесказанное относится лишь к предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения и могут быть проведены многочисленные модификации и изменения, не противоречащие сущности настоящего изобретения и объему притязаний, приведенных в формуле изобретения.

Формула изобретения

1. Способ увеличения продуктивности птиц, отличающийся тем, что способ включает введение птице эффективного количества гетерологичного белка, содержащего альфа-субъединицу белка ингибина птиц или ее иммуногенный фрагмент и белок-носитель.

2. Способ по п.1, где увеличение продуктивности птиц включает увеличение кладки яиц, ускорение начала кладки яиц, ускорение начала максимальной кладки яиц, увеличение общего периода кладки яиц, увеличение продукции яиц, увеличение интенсивности продукции яиц, пролонгирование персистенции кладки яиц, улучшение качества скорлупы яиц, ускорение начала полового созревания и/или пролонгирование персистенции овуляции у птиц.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что птицу выбирают из группы, включающей бескилевых, Psittaciformes, Falconiformes, Piciformes, Strigiformes, Passeriformes, Coraciformes, Ralliformes, CuCuliformes, Columbiformes, Galliformes, Anseriformes и Herodiones.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что бескилевую птицу выбирают из группы, включающей африканского страуса, эму, нанду, киви и казуара.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что птицу выбирают из группы, включающей курицу, индейку, попугая, попугайчика, макао, сокола, орла, перепела, ястреба, голубя, какаду, певчих птиц, сойку, черного дрозда, вьюрка, славку, гуся, утку, канарейку, майну, тукана и воробья.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что белок-носитель выбирают из группы, содержащей белок, связывающий мальтозу, бычий сывороточный альбумид, овальбумин, флагеллин, гемоцианин лимфы моллюска, сывороточный альбумин, гамма-глобулин, тироглобулин и полимеры аминокислот.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что введение гетерологичноло белка увеличивает продукцию яиц.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что птицу выбирают из группы, включающей перепела, индейку, курицу, попугая и бескилевых.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что гетерологичный белок вводят до полового созревания.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что гетерологичный белок вводят в течение полового созревания.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что гетерологичный белок является слитым белком.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что гетерологичный белок является конъюгированным белком.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно вводят адъюванты, консерванты, разбавители, эмульгаторы или стабилизаторы.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что белок вводят после полового созревания.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что альфа-субъединица белка ингибина птиц или его иммуногенный фрагмент содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4.

16. Слитый гетерологичный белок общей формулы A-B, где А – альфа-субъединица белка ингибина птиц или ее иммуногенный фрагмент, такой, как белок, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0: 4; B – белок-носитель, такой, как белок, связывающий мальтозу, бычий сывороточный альбумин, овальбумин, флагеллин, гемоцианин лимфы моллюска, сывороточный альбумин, гамма-глобулин, тироглобулин и полимеры аминокислот.

17. Способ получения белка, включающий следующие стадии: (а) получение двухцепочечной кДНК, кодирующей альфа-субъединицу ингибина или ее фрагмент; (б) получение вектора, который кодирует белок-носитель; (в) лигирование кДНК альфа-субъединицу ингибина в вектор; (г) введение лигированного вектора в экспрессирующую систему и (д) экспрессия слитого гетерологичного белка, содержащего альфа-субъединицу белка ингибина или ее фрагмент и белок-носитель, отличающийся тем, что указанный белок представляет собой слитый гетерологичный белок по п.16.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что кДНК альфа-субъединицу белка ингибина содержит последовательность SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:3.

19. Способ по п.17, отличающийся тем, что альфа-субъединицы белка ингибина или ее иммуногенный фрагмент в экспрессируемом слитом гетерологичном белке содержат SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4.

20. Способ по п. 17, отличающийся тем, что белок-носитель выбирают из группы, включающей белок, связывающий мальтозу, бычий сывороточный альбумин, овальбумин, флагеллин, гемоцианин лимфы моллюска, тироглобулин, сывороточный альбумин, гамма-глобулин или полимеры аминокислот.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 01.03.2005

Извещение опубликовано: 20.04.2006 БИ: 11/2006