Патент на изобретение №2169582

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПЕРИММУННОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ РОЖИ СВИНЕЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. В качестве антигенов берут инактивированные концентрированные культуры штаммов Erysipelotrix insidiosa 1689 подтипа 1a и N 1329 подтипа 1в (серотип А) в количестве 1500-2270 млрд. м.т. и живую концентрированную культуру штамма N 1933 подтипа 2а (серотип В) в количестве 525-905 млрд.м.т. Для создания грундиммунитета волов двукратно подкожно в разные участки тела вводят инактивированный концентрированный антиген (серотип А) в дозе 10-15 млрд.м.т. и живой концентрированный антиген (серотип В) в дозе 2-3 млрд.м.т. и повторно через 21 день – 20-25 и 5-7 млрд.м.т. соответственно. Гипериммунизацию проводят инактивированным концентрированным антигеном (серотип А) и живым концентрированным антигеном (серотип В) 8-10-кратно с интервалом 3-4 дня. Способ позволяет повысить активность целевого продукта, сократить длительность процесса и упростить его. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения гипериммунной сыворотки для лечения и профилактики рожи свиней. Известен способ изготовления сыворотки против рожи свиней, получаемой от продуцентов свиней (1).

Однако данный способ экономически нецелесообразен, так как срок эксплуатации свиней составляет 5-6 месяцев (в зависимости от длины хвоста и клинического состояния продуцентов). Напротив, срок эксплуатации волов – не менее 5 лет. Известен также способ изготовления сыворотки против бациллярной рожи свиней (2) [прототип], однако сыворотка, полученная данным способом, имеет низкую активность, а сам способ длителен и трудоемок.

Целью изобретения является повышение активности целевого продукта, сокращение длительности и упрощение способа.

Для этого рожистый антиген готовят из штаммов Erysipelotrix insidiosa N 1689 подтипа 1a и N 1329 подтипа 1в (серотип A), N 1933 подтипа 2а (серотип B), культивируют в реакторе 18-20 ч, инактивируют культуры штаммов серотипа A N 1689 и N 1329 0,3% формалином в течение 22-24 ч при температуре 37^oC, концентрируют путем центрифугирования. Грундим-мунизацию и гипериммунизацию провидят антигенами серотипа A и B раздельно, причем грундиммунизацию – двукратно с интервалом 21 день, а гипериммунизацию осуществляют 8-10-кратными внутримышечными инъекциями с интервалом 3-4 дня инактивированным рожистым антигеном (серотип A) при общей дозе 1500-2270 млрд.м.т. (75,0-113,5 мл) и концентрированным живым рожистым антигеном (серотип В) в количестве 525-905 млрд.м.т. (52,5-90,5 мл).

Сущность предлагаемого способа состоит в следующем. Для создания грундиммунитета волам двукратно подкожно в разные участки тела вводят инактивированный концентрированный антиген (серотип A) в дозе 10-15 млрд. м.т. и живой концентрированный антиген (серотип В) в дозе 2-3 млрд.м.т. и повторно через 21 день – 20-25 млрд.м.т. и 5-7 млрд.м.т. соответственно.

Гипериммунизацию волов проводят в количестве 8-10 внутримышечных инъекций в возрастающих дозах инактивированного концентрированного рожистого антигена (серотип A), очищенного от культуральной жидкости, в количестве 1500-2270 млрд.м.т. и концентрированного живого рожистого антигена (серотип B), очищенного от культуральной жидкости, в количестве 525-905 млрд.м.т.

В процессе эксплуатации после каждого взятия крови через 3-4 дня проводят очередные внутримышечные инъекции инактивированного концентрированного (серотип A) и концентрированного живого (серотип B) антигенов в дозе по 400 и 200 млрд.м.т. соответственно, а через 7-10 дней после этого от продуцентов снова берут кровь.

Пример 1. Гипериммунизацию волов проводили путем 10 внутримышечных инъекций в возрастающих дозах инактивированного рожистого антигена (серотип A) 20-миллиардной концентрации, очищенного от культуральной жидкости, в общем количестве 2270 млрд.м.т. и 10 внутримышечных инъекций живого рожистого антигена (серотип B) 10-миллиардной концентрации, очищенного от культуральной жидкости, в общем количестве 905 млрд.м.т. по схеме (табл. 1).

Результаты определения активности:
ЕД₅₀= 0,0043 ( Li = 5,0)
Контроль (прототип) ЕД₅₀ = 0,009 ( Li = 4,0)
Пример 2: В сравнении с примером 1 увеличено количество инъекций и дозы антигенов при гипериммунизации. Проводят 11 инъекций инактивированного рожистого антигена (серотип A) в общем количестве 2770 млрд. м.т. и живого рожистого антигена (серотип B) в общем количестве 1205 млрд.м.т. по схеме:
20-40-80-160-220-300-330-350-370-400-500 млрд.м.т. серотип
5-10-20-40-80-100-120-150-180-200-300 млрд.м.т. серотип B
Результаты определения активности:
ЕД₅₀= 0,0043 ( Li = 5,0)
Пример 3: Еще больше увеличено количество инъекций и доза антигенов. Общее количество инактивированного антигена (серотип A) – 3370 млрд.м.т.:
20-40-80-160-220-300-330-350-370-400-500-600 млрд.м.т.

Общее количество живого антигена (серотип B) – 1605 млрд.м.т.: 5-10-20-40-80-100-120-150-180-200-300-400 млрд.м.т.

Результаты определения активности:
ЕД₅₀ = 0,0043 ( Li = 5,0)
Увеличение числа инъекций больше 10 и количества антигенов – инактивированного (серотип A) больше 2270 млрд.м.т. и живого (серотип B) больше 905 млрд.м.т. не привело к дальнейшему повышению активности сыворотки. Увеличение количества антигенов и числа инъекций нецелесообразно, т.к. оказывает дополнительную нагрузку на иммунную систему продуцентов и не выгодно с экономической точки зрения.

Пример 4: Уменьшили количество инъекций до 8:
инактивированного антигена (серотип A):
20-40-80-160-220-300-330-350 млрд.м.т.,
живого антигена (серотип B):
5-10-20-40-80-100-120-150 млрд.м.т.

Общее количество антигенов: инактивированного – 1500 млрд.м.т., живого – 525 млрд.м.т.

Результаты определения активности:
ЕД₅₀ = 0,0043 ( Li = 5,0)
Уменьшение числа инъекций до 8 при уменьшении общего количества вводимых антигенов: инактивированного – до 1500 млрд.м.т., живого – до 525 млрд.м.т. не привело к снижению титра антител в сыворотке.

Пример 5: Уменьшили количество инъекций до 7 при уменьшении общего количества вводимых микробных тел:
инактивированного антигена – до 1150 млрд.м.т.

20-40-80-160-220-300-330 млрд.м.т.,
живого антигена – до 375 млрд.м.т.

5-10-20-40- 80/100-120 млрд.м.т.

Результаты определения активности:
ЕД₅₀ = 0,0090 ( Li = 4,0)
Уменьшение числа инъекций до 7 при уменьшении общего количества вводимых антигенов: инактивированного – до 1150 млрд.м.т., живого – до 375 млрд.м.т. привело к снижению титров антител в полученной сыворотке (табл. 2).

Предложенный способ апробирован с положительными результатами в лабораторных и производственных условиях.

Предложенный способ в отличие от известного обладает следующими преимуществами:
1) сыворотка, полученная данным способом, более активна;
2) использование концентрированного антигена, очищенного от культуральной жидкости, позволяет: во-первых, повысить концентрацию специфического антигена, что в свою очередь способствует повышению активности сыворотки; во-вторых, снизить неспецифическую нагрузку на иммунную систему продуцентов и реактогенность антигена;
3) использование в качестве антигена инактивированных культур вирулентных штаммов серотипа A обеспечивает безопасность антигена и возможность его приготовления впрок сроком на 3 месяца, что упрощает способ изготовления антигена;
4) способ более прост в исполнении и менее трудоемок:
– сокращено количество инъекций с 25 до 8-10;
– сокращена длительность цикла гипериммунизации на 40- 50 дней;
– антиген вводится в малых объемах 20 мл вместо 400-500 мл;
– исключены внутривенные инъекции антигена, которые нередко являются причиной аллергических реакций у продуцентов;
Источники информации
1. Инструкция по изготовлению и контролю сыворотки против рожи свиней, получаемой от продуцентов-свиней, утв. 20 июня 1987 г.

2. Инструкция по изготовлению и контролю сыворотки против бациллярной рожи свиней, утв. 25 июня 1960 г. – прототип.

Формула изобретения

Способ получения гипериммунной сыворотки против рожи свиней, включающий приготовление антигенов из штаммов Erysipelotrix insidiosa 1689 подтипа 1а и 1329 подтипа 1в (серотип А), 1933 подтипа 2а (серотип В), культивирование в бульоне Хоттингера, гипериммунизацию продуцентов полученными антигенами с последующим крововзятием и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что культуры вирулентных штаммов серотипа А инактивируют, культуры всех штаммов концентрируют центрифугированием, ресуспендируют в физиологическом растворе до концентрации 10 – 20 млрд.м.т./мл, проводят грундиммунизацию двукратно с интервалом 21 день, а гипериммунизацию осуществляют 8 – 10-кратными внутримышечными инъекциями с интервалом 3 – 4 дня инактивированным рожистым антигеном серотипа А при общей дозе 1500 – 2270 млрд.м.т. (75 – 113,5) и живым антигеном серотипа В в количестве 525 – 905 млрд.м.т. (52,5 – 90,5 мл), при этом грундиммунизацию и гипериммунизацию проводят каждым серотипом раздельно в разные участки тела в области региональных лимфатических узлов.

РИСУНКИ