Патент на изобретение №2169578

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, точнее к биотехнологии. Сущность изобретения: разбавленную в 4 раза абортную сыворотку человека смешивают с аффинной смолой, содержащей не менее 1 г/л антител к АФП, жидкость декантируют, а смолу переносят в хроматографическую колонку. АФП снимают со смолы 4 М раствором MgCl₂, раствор подвергают ультрафильтрации, в концентрат добавляют CaCl₂ и трис-ОН до концентрации 0,1 М и трипсин. Раствор выдерживают, подвергают ультрафильтрации и получают концентрат АФП с чистотой не ниже 90%. В продукт вводят полисахарид, физраствор, раствор стерилизуют, ампулируют и высушивают. Технический результат: упрощение и удешевление способа при высокой чистоте и качестве целевого продукта. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, и может быть использовано в медицине для изготовления лекарственной формы АФП-человеческого, используемого для лечения заболеваний с аутоиммунными нарушениями.

Известен способ получения альфа-фетопротеина путем осветления исходного сырья центрифугированием и хроматографической очисткой целевого продукта на аффинном сорбенте в две стадии: сначала на сорбенте, содержащем антитела к альфа-фетопротеину, а затем на сорбенте, содержащем комплекс антител против белков крови человека, причем в качестве аффинного сорбента используют Br-CN-сефарозу, активированную глутаровым альдегидом (патент РФ N 2100031, опубл. 27.12.97, бюл. N 36).

Недостатки: способ сложен и предполагает использование дорогих реактивов.

Изобретение направлено на решение задачи упрощения и удешевления способа при высокой чистоте и качестве получаемого продукта.

Указанная задача достигается путем получения АФП: разбавленную в 4 раза абортную сыворотку человека (АСЧ) смешивают с аффинной смолой, содержащей не менее 1 г/л антител к АФП, и выдерживают при перемешивании. Жидкость декантируют, а смолу переносят в хроматографическую колонку, где ее промывают 1,5-молярным раствором MgCl₂ до исчезновения белка в промывочном растворе. АФП снимают со смолы 4-молярным раствором MgCl₂, раствор подвергают ультрафильтрации на волокнах ПА-50 до минимального объема обессоливания. В полученный концентрат добавляют CaCl₂ и трис-OH до концентрации 0,1 М, трипсин 2 г на 10 л абортной сыворотки, взятой в работу. Полученный раствор выдерживают 2 ч при t=37^oC и снова подвергают ультрафильтрации на волокнах ПА-50 до минимального объема и исчезновения белка в фильтрате. Производят замену буфера на физраствор.

Получают концентрат белка – АФП с чистотой не ниже 90%.

Способ осуществляют следующим образом: разбавленную в 4 раза абортную сыворотку человека смешивают с аффинной смолой, содержащей не менее 1 г/л антител к АФП, и выдерживают при постоянном перемешивании 30 мин при t=37^oC (1 л смолы + 10 л разбавленной в 4 раза абортной человеческой сыворотки (АЧС). Жидкость декантируют, а смолу переносят в хроматографическую колонку. Затем смолу в колонке промывают 1,5-молярным раствором MgCl₂ до исчезновения белка в промывочном растворе. АФП снимают со смолы 4-молярным раствором MgCl₂ в объеме двух объемов смолы в колонке. Полученный раствор подвергают ультрафильтрации на волокнах ПА-50 до минимального объема и обессоливания раствора 0,1 молярным MgCl₂. В полученный концентрат добавляют CaCl₂ до концентрации 0,1 моль, трис-OH (при pH = 7,5) до концентрации 0,1 моль и трипсин из расчета 2 г на 10 л АЧС, взятой в работу; pН смеси устанавливают равной 7,5. Полученный раствор выдерживают при t=37^oC в течение 2 ч и подвергают ультрафильтрации на волокнах ПА-50 до минимального объема и исчезновения белка в фильтрате. Производят замену буфера на физраствор. Полученный концентрат белка представляет собой АФП с чистотой не ниже 90%. Далее в целевой продукт вводят полисахарид реополиглюкин или альбумин в количестве 3-10 мг на 75 мкг АФП. Раствор разводят физраствором до концентрации 75 АФП в 1 мл, стерилизуют фильтрацией, расфасовывают в ампулы или флаконы по 1 мл и лиофильно высушивают.

Способ позволяет упростить и удешевить получение препарата АФП, сохранив при этом высокое качество, чистоту и стабильность целевого продукта.

Формула изобретения

1. Способ получения альфа-фетопротеина из абортной сыворотки человека, включающий хроматографическую очистку целевого продукта на аффинном носителе, отличающийся тем, что разбавленную в 4 раза абортную сыворотку человека смешивают с аффинной смолой в соотношении 10 : 1 л смолы, выдерживают 30 мин при 37^oC, жидкость декантируют, смолу переносят в хроматографическую колонку, промывают ее 1,5 молярным раствором MgCl₂ до исчезновения белка в промывочном растворе, АФП снимают со смолы 4-х молярным раствором MgCl₂, равным двум объемам смолы в колонке, полученный раствор подвергают ультрафильтрации на волокнах ПА-50 до минимального объема и обессоливания, в концентрат добавляют CaCl₂ до концентрации 0,1 моль, трис-ОН до концентрации 0,1 моль и трипсин из расчета 2 г на 10 л абортной сыворотки, рН смеси устанавливают 7,5, раствор выдерживают 2 ч при 37^oC, а затем снова подвергают ультрафильтрации на волокнах ПА-50 до минимального объема и исчезновения белка в фильтрате, производят замену буфера на физраствор, получают концентрат альфа-фетопротеина с чистотой не ниже 90%, в который вводят полисахарид в количестве 3 – 10 мг на 75 мкг АФП, разводят до концентрации 75 мкг АФП в 1 мл и осуществляют фасовку в ампулы или флаконы и лиофильное высушивание.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве полисахарида используют реополиглюкин или альбумин.

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 5-2002

(73) Патентообладатель:

Родионов Сергей Юрьевич (RU)

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 04.12.2001 № 13606

Извещение опубликовано: 20.02.2002

QB4A Государственная регистрация договора о распоряжении исключительным правом

Дата и номер государственной регистрации договора: 26.01.2011 № РД0075710

Вид договора: лицензионный

Лицо(а), передающее(ие) исключительное право:
Родионов Сергей Юрьевич

Лицо, которому предоставлено право использования:

Общество с ограниченной ответственностью “КЮР”

Условия договора: НИЛ, на срок действия патентов на территории РФ.

Дата публикации: 10.03.2011